《Pathogens》：Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) for the Diagnosis of High-Burden Viral Diseases in Resource-Limited Countries
Ana Catharina Vasconcelos-Martins,
Marta Giovanetti,
Maria Carolina Elias,
Svetoslav Nanev Slavov and
Sandra Coccuzzo Sampaio
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摘要：甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus，HAV）感染偶可导致急性重症肝炎，此类患者有时需接受肝移植并长期使用免疫抑制剂。尽管罕见，但在已接种疫苗人群中仍可出现突破性HAV感染，且在免疫功能受损人群中更为常见。免疫抑制剂对HAV复制的影响尚不明确
摘要：甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus，HAV）感染偶可导致急性重症肝炎，此类患者有时需接受肝移植并长期使用免疫抑制剂。尽管罕见，但在已接种疫苗人群中仍可出现突破性HAV感染，且在免疫功能受损人群中更为常见。免疫抑制剂对HAV复制的影响尚不明确。本研究在人肝细胞中检测了硫唑嘌呤对HAV HA11-1299 IIIA基因型复制的影响，结果显示硫唑嘌呤可抑制HAV复制，其半数抑制浓度（half-maximal inhibitory concentration，IC50）为0.967 μmol/L。研究人员进一步在HuhT7细胞中使用复制 competent 或 replication incompetent 的HAV HM175 18f IB基因型亚基因组复制子系统评估硫唑嘌呤的作用，发现相较于复制缺陷型复制子，硫唑嘌呤对复制 competent 型亚基因组复制子具有显著抑制作用。此外，在COS7-HAV-IRES细胞中通过报告基因实验检测硫唑嘌呤对HAV HM175 18f IB基因型内部核糖体进入位点（internal ribosomal entry site，IRES）活性的影响，结果显示1 μmol/L硫唑嘌呤可显著抑制HAV IRES活性，而0.5 μmol/L无此作用。结果表明，硫唑嘌呤既可抑制HAV复制，也可抑制其翻译过程。综上，硫唑嘌呤可在人肝细胞中抑制HAV复制，提示其在需要接受免疫抑制治疗的HAV感染患者中可能具有临床应用价值。
研究背景：甲型肝炎病毒（HAV）是全球范围内的重要公共卫生问题，食源性和男男性行为人群中的传播均呈上升趋势，可导致急性自限性肝炎、急性肝衰竭甚至死亡，部分患者需接受肝移植。虽然HAV感染可通过疫苗预防，但在免疫功能受损人群中，疫苗接种后的突破性感染相对更为常见。肝移植受者及自身免疫性疾病患者常需长期使用免疫抑制剂，而免疫抑制剂对HAV复制的影响尚未明确，因此亟需探究两者之间的关联，为高危人群的治疗提供依据。本研究由Ana Catharina Vasconcelos-Martins、Marta Giovanetti、Maria Carolina Elias、Svetoslav Nanev Slavov及Sandra Coccuzzo Sampaio等研究人员完成，发表于《Pathogens》。
关键技术方法：研究采用人肝癌细胞系Huh7及其稳定表达T7 RNA聚合酶的衍生细胞系HuhT7、非洲绿猴肾细胞系COS7及其稳定携带HAV IRES报告系统的COS7-HAV-IRES细胞。通过HAV感染模型、亚基因组复制子系统及IRES报告系统，结合实时荧光定量PCR（qPCR）、荧光素酶报告实验、细胞活力检测（MTS法）及统计学分析，评估免疫抑制剂对HAV复制及翻译的影响。
研究结果：
3.1 硫唑嘌呤抑制HAV复制
研究人员在Huh7细胞中分别检测霉酚酸、环孢素A及硫唑嘌呤对HAV HA11-1299 IIIA基因型复制的影响。结果显示，在无毒浓度范围内，霉酚酸和环孢素A均未表现出抑制作用，而硫唑嘌呤可显著抑制HAV复制，其IC50为0.967 μmol/L，且该浓度下未观察到细胞毒性。
3.2 硫唑嘌呤抑制HAV亚基因组复制子复制
在HuhT7细胞中转染HAV HM175 18f IB基因型复制 competent 型（pT-18f-LUC）与复制 incompetent 型（pT-18f-LUCmut）亚基因组复制子，评估硫唑嘌呤的作用。结果显示，0.5 μmol/L和1.0 μmol/L硫唑嘌呤对复制 competent 型复制子的抑制率分别为68.0%和56.2%，而对复制 incompetent 型复制子的抑制效应较弱，表明硫唑嘌呤主要作用于HAV的RNA复制阶段。
3.3 硫唑嘌呤抑制HAV IRES活性
在COS7-HAV-IRES细胞中检测硫唑嘌呤对IRES活性的影响。结果显示，0.5 μmol/L硫唑嘌呤未显著抑制IRES活性，而1 μmol/L可显著降低IRES驱动的荧光素酶表达，提示硫唑嘌呤在高浓度下可同时抑制HAV的翻译过程。
讨论与结论：硫唑嘌呤作为6-巯基嘌呤的前体药物，属于硫嘌呤类抗代谢物，可通过干扰嘌呤核苷酸的从头合成发挥免疫抑制作用。已有研究表明其代谢产物对多种RNA及DNA病毒具有抗病毒活性，本研究首次证实其对HAV复制及翻译的双重抑制作用。与其他免疫抑制剂不同，霉酚酸和环孢素A在本实验体系中未显示抗HAV活性。研究提示，硫唑嘌呤或可成为免疫抑制人群HAV感染的潜在治疗选择，但仍需进一步开展体内实验验证其安全性与有效性。
结论：硫唑嘌呤作为一种免疫抑制剂，可在无肝细胞毒性的浓度下抑制HAV复制，可能适用于正在接受免疫抑制治疗的HAV感染患者的管理。
