基于AlphaLISA的拉沙病毒糖蛋白快速、灵敏检测方法开发

《Pathogens》：Development of a Rapid and Sensitive AlphaLISA-Based Assay for Lassa Virus Glycoprotein Detection Hao Cai, Qingyu Lv, Wenhua Huang, Shaolong Chen, Peng Liu, Hua Jiang, Qian Li, Decong Kong, Yuhao Ren and Yongqiang Jiang + 2 authors

　　

鳄梨（Persea americana Mill. var. Hass）的木材组织病害，由于其慢性进展、症状表达延迟以及对树木稳定性和生产力的严重影响，构成了重大的植物检疫威胁。尽管白腐病传统上归因于腐生担子菌，但越来越多的证据表明，革菌类真菌可能在农业系统中作为兼性病原体发挥作用。本研究调查了与墨西哥米却肯州鳄梨茎和枝干白腐病相关的革菌类担子菌。实地调查显示了一致的结构弱化、枝梢枯死和木材腐烂症状。从有症状组织和子实体中获得的真菌分离物进行了形态学表征，并通过基于ITS的系统发育分析进行了鉴定。在受控条件下，研究人员评估了Grammothele spp. 和 Dentocorticium portoricense的代表性分离物的致病性。所有分离物都再现了田间症状，证实了其致病性，但攻击力各不相同。D. portoricense 表现出最高的发病率、严重程度和AUDPC（病程曲线下面积）值，表明其具有更强的毒力，而 Grammothele 分离物则表现出较慢、中等程度的进展。系统发育分析为 D. portoricense 提供了强有力的支持，而 Grammothele 在属水平上得到解析。结合田间观察、致病性和分子数据，证明革菌类真菌不仅仅是次生腐生菌，而且是鳄梨白腐病中重要的病原体。这些发现强调，有必要将革菌类真菌纳入枝干病害的诊断、监测和管理策略中。

论文解读：革菌类真菌在鳄梨枝干白腐病中的病原作用研究

一、 研究背景、问题与目的

枝干病害是鳄梨（Persea americana）生产系统中的主要植物检疫限制因素之一，它们损害维管完整性、结构稳定性和树木的长期生产力。传统上，这些症状主要与有限的植物病原真菌类群相关，如葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae）、炭疽菌属（Colletotrichum）、镰刀菌属（Fusarium）等子囊菌。近年来，担子菌门（Basidiomycota）成员在枝干病害中的作用日益受到关注。其中，革菌类（corticioid）真菌是一个形态和生态多样化的类群，其特征为平伏的子实体并与木质基质紧密相关。然而，从植物病理学角度，它们的研究甚少，长期以来仅被视为专性腐生菌。尽管有研究显示某些革菌类真菌能够定殖活体木质组织并造成损害，挑战了其严格腐生的传统观点，但它们在农业系统中仍常被解释为次级或机会性定殖者。因此，革菌类真菌在鳄梨等木本作物枝干病害中的致病潜力、流行病学重要性及贡献仍缺乏充分记录，这限制了诊断的准确性，并阻碍了有效植物检疫管理策略的制定。

在此背景下，本研究旨在鉴定与鳄梨枝干白腐病症状相关的革菌类真菌，并在受控条件下评估其致病性。通过量化病害发展（发病率、严重度和AUDPC），比较不同分离物随时间的攻击力差异。研究成果有助于更好地理解革菌类真菌在鳄梨枝干病害中的作用，并强调其作为木本作物系统中新发或先前被低估病原体的重要性。本研究发表在《Pathogens》期刊。

二、 关键技术方法

本研究采用了多学科结合的研究方法。首先，在墨西哥米却肯州鳄梨主产区的商业果园进行系统采样，收集了有白腐病症状的木材组织样本及相关子实体。其次，通过对组织样本进行表面消毒、培养和尖端菌丝转移，获得纯培养物。第三，利用分子生物学技术，从菌丝体中提取基因组DNA，扩增核糖体DNA内部转录间隔区（ITS）区域并进行测序，通过BLAST工具比对和构建基于ITS序列的系统发育树（采用贝叶斯推断和最大似然法）对分离物进行分子鉴定。第四，在温室条件下，通过人工接种试验评估所选代表性分离物的致病性，接种后定期监测症状发展，并利用科赫法则（Koch’s postulates）进行验证。第五，采用定量评估体系，通过测量病斑长度和宽度估算病斑面积，使用0-5级序数尺度评估病害严重度，并计算病程曲线下面积（AUDPC）来量化病害进展和分离物攻击力。最后，运用方差分析（ANOVA）和Tukey检验对攻击力数据进行统计分析。

三、 研究结果

3.1. 田间观察到的症状

在2022年至2025年的年度周期中，在评估的鳄梨果园中，观察到树木茎和枝干存在一致的白腐病症状，包括结构弱化、机械断裂、树皮裂缝和腐烂木材暴露。横切面和纵切面显示，受影响组织呈现白色至乳白色变色、硬度显著丧失、纤维质至海绵状质地、木质部结构改变以及病健组织边界模糊。在受损程度较高的树木上，记录到枝梢枯死、营养活力减退和叶片褪绿。此外，在受影响的树干和枝条表面检测到牢固附着的平伏担子果。

3.2. 子实体的形态学特征

田间采集的子实体表现出与革菌类真菌一致的宏观形态特征：子实体平伏或扩展，紧密附着在木质基质上，新鲜时质地软木状，干燥时易碎，边缘白色至淡黄色，表面光滑至略粗糙，颜色从白色到浅棕色不等。根据形态，可区分为归属于 Grammothele sp. 和 Dentocorticium portoricense 的两类子实体。Grammothele sp. 的子实体薄、平伏，膜质至革质，在树干和树枝上形成不规则壳状，子实层体孔状至齿菌状。D. portoricense 的子实体在树干和树枝上形成广泛的平伏壳状物，主要在皮层受损区域，呈白色至乳白色，具有明确的齿菌状子实层体，带有短而密集排列的齿状突起。

3.3. 真菌分离物的获取

从米却肯州15个商业果园的调查中，从有白腐病症状树木的木质组织和相关子实体中，共获得28个纯真菌分离物。基于观察到的形态多样性，选择了10个代表性分离物用于第一个实验区块。基于它们与革菌类形态组的界定，并利用NCBI的BLAST工具进行比对，保留了三个分离物（CSA、CG1和C8）用于系统发育重建鉴定和随后的致病性及攻击力测定。

3.4. 培养物中分离物的形态学特征

在PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）培养基上，所选分离物（CSA、CG1和C8）表现出缓慢至中等的生长速度，菌丝体主要为白色至乳白色。菌落呈棉絮状、天鹅绒状或略扁平质地，并紧密附着在培养基上。微观形态分析揭示了透明、有隔膜的菌丝，在大多数分离物中可见明显的锁状联合。在某些分离物中，识别出生殖菌丝和骨架菌丝，表明白腐相关担子菌典型的二系菌丝系统。

3.5. 通过系统发育重建进行鉴定

基于ITS区域的分子分析成功鉴定了三个革菌类真菌分离物：两个属于 Grammothele 属（CG1和CSA），一个属于 Dentocorticium 属（C8）。在 Grammothele 的系统发育分析中，两个分离物聚集在一个得到良好支持的进化支中，与外类群 Porogramme albocincta 明显区分。对于 Dentocorticium，分离物C8始终聚集在 Dentocorticium portoricense 的进化支内，在贝叶斯推断和最大似然分析中均获得最大支持值，并与分析中包含的该属其他谱系清晰分开。

3.6. 致病性测试结果

接种了革菌类真菌的鳄梨幼苗出现了叶片和茎部症状的渐进发展、木质组织改变以及与菌丝生长相关的病征。接种 Grammothele 的幼苗，初期症状表现为叶片上不规则的褪绿斑驳，随后发展为部分叶片萎蔫和坏死，后期出现枝梢枯死和幼苗营养活力下降。在茎部水平，接种了 Grammothele 的植株表现出局部病征，即在受影响茎区出现可见的平伏担子果。接种了分离物C8（D. portoricense）的植株，观察到更严重的叶片症状，并从明显的褪绿斑驳和叶片普遍褪绿开始，随后出现高级别萎蔫、枝条坏死、叶片干燥和明显的枝梢枯死。此外，在接种了 D. portoricense 的茎上检测到明显的病原体病征，包括皮层表面牢固附着的丰富菌丝生长。

3.7. 发病率、严重度和攻击力

分离物 Dentocorticium portoricense （C8）与 Grammothele 分离物（CSA和CG1）相比，表现出更早且更快速的发病率进展。在病害严重度方面，D. portoricense C8 记录到最高的组织损伤水平，其次是 Grammothele CSA 和 CG1。在攻击力方面检测到具有统计学显著性的差异，通过计算病程曲线下面积（AUDPC）确定的攻击力分析显示，D. portoricense C8 的攻击力值显著高于 Grammothele 分离物，这一模式与发病率和严重度结果一致。

四、 讨论与结论

讨论部分总结：本研究中获得的证据表明，在墨西哥米却肯州鳄梨主产区内，与木质组织白腐病相关的革菌类真菌，在鳄梨品种哈斯（Hass）的茎和枝干渐进性退化中扮演着积极且有差异的致病角色。田间条件下观察到的结构病征和症状的一致性，结合受控条件下的致病性确认以及分离物的系统发育学支持，使研究人员确认这些担子菌不应仅仅被视为次级腐生菌，而应被视为集约化农业系统（特别是鳄梨生产系统）内的功能性植物病原体。观察到的症状表明白腐过程的发生，其特征是木质素的优先降解和随后木质部结构成分的紊乱。田间条件下一个相关观察是内部损伤的严重程度与外部症状表达之间的不一致性，在这种情况下，牢固附着在茎和枝条上的平伏担子果的检测具有很高的诊断价值。形态学表征支持了其归属于 Grammothele 和 Dentocorticium 属，但强调了结合分子和系统发育方法以实现可靠物种界定的必要性。致病性测试证实了所评估分离物能够诱发与田间观察一致的症状，但定量分析揭示了不同分类单元在发病率、严重度和攻击力上的显著差异。D. portoricense 表现出最高的严重度和AUDPC值，表明其更强的攻击力，这可能与其更高的木质素降解效率有关。从植物检疫角度看，识别具有不同致病攻击力的革菌类真菌对鳄梨园管理具有重要意义。总体而言，研究结果支持了以下观点：传统上被视为严格腐生生物的革菌类真菌，可能在集约化农业系统中改变其生态行为，充当兼性病原体。

研究结论：本研究提供了强有力的证据，表明与鳄梨木质组织白腐病相关的革菌类真菌是活跃的病原体，而非次级腐生菌。田间观察、形态学和分子分析以及致病性测试一致地证实了它们在茎枝衰退中的作用。在所评估的分类单元中，与 Grammothele spp. 相比，Dentocorticium portoricense 表现出显著更高的发病率、严重度和攻击力，强调了其作为鳄梨果园主要植物病原体的重要性。这些发现强调了将革菌类真菌纳入木质组织病害的诊断方案、监测系统和管理策略的重要性。认识到它们的致病潜力将有助于早期检测并加强植物检疫措施，最终减少鳄梨生产系统中的结构损害和产量损失。