综述：园艺苗圃植物病害监测中eDNA采样方法综述：针对不同植物病原类群的对比分析

《Horticulturae》：A Review of Available eDNA Sampling Methods for Plant Disease Surveillance in Horticultural Nurseries Across Contrasting Phytopathogenic Groups Kes Daly, Craig Murphy, Richard O’Hanlon, Adam P. Ryan, Michelle E. H. Thompson and Trevor R. Hodkinson

　　

植物病原体对自然生态系统和全球粮食安全构成威胁。园艺贸易是导致这些生物体传播和全球疾病爆发的主要远距离途径。大多数对病害症状的检查是目视进行的，但考虑到植物数量庞大以及无症状感染的普遍性，这是不够的。因此，利用高通量测序（HTS）和环境DNA（eDNA）进行植物健康监测的兴趣日益增加。许多研究已使用这些技术来检测植物病原体，但在园艺环境中进行的研究较少。此外，许多工作集中在分子和生物信息学方法上，对样本采集的关注相对较少。因此，本系统性综述概述了可用的采样方法及其目标植物病原体，特别关注这些采样方法在园艺苗圃中的实用性。它强调了文献中的一些显著空白和进一步研究的机会：例如，利用eDNA检测细菌性植物病原体尽管作为监测和/或诊断工具具有相当大的潜力，但很少受到关注。

引言：植物贸易、生物安全风险与园艺苗圃eDNA病原体监测需求

植物病原体（phytopathogens）是能引起植物病害的生物体，可导致多种症状，包括生长减缓、坏死和死亡。气候变化会加剧其危害。园艺产业是全球重要市场，观赏植物贸易不断增长。植物、木材和种子的流动促进了植物病原体进入新的地理区域。观赏植物可传播多种病原体，例如白粉病、细菌性叶斑病、灰霉病、根腐病和顶枯病。一旦入侵性病原体在环境中定殖，很难根除，因此可靠、早期的病原体检测方法对于预防疾病爆发至关重要。传统的目视检查对大批量运输不切实际且通常无效，许多植物可能是病原体的无症状携带者。因此，在园艺环境中，利用eDNA等技术进行可靠、早期的病原体检测，对于减少经济损失和防止植物病原体在园艺产业和生态系统中的传播至关重要。本综述旨在探讨主要植物病原体类群的生活史与检测其所需采样基质（如用于检测水生生物的水样）的关系，概述和比较各种eDNA样本类型（空气、水、生长介质、植物组织）及相应的采样方法和工具，并特别关注这些监测和诊断方法如何应用于实际园艺苗圃环境。

材料与方法

本综述通过在Scopus和PubMed数据库中使用关键词检索进行。搜索词包括("Environmental DNA" OR "eDNA" OR "high throughput sequencing" OR "HTS" ...) AND ("phytopathogen" ...) AND ("nurser" OR "horticultur*")。共发现934篇独立文献，其中27篇被判定为相关。相关研究的筛选标准是：在商业苗圃中使用HTS和/或基于eDNA的方法来检测植物病原体。

结果与讨论

3.1. 园艺苗圃病害监测面临的挑战

园艺苗圃的设施多样，从类似森林的树木农场到高度专业化的盆栽苗圃，规模、灌溉系统和植物种类差异很大。温暖、潮湿、灌溉良好的环境为病原体繁殖提供了理想条件，例如疫霉菌（Phytophthora）非常适合此类环境。苗圃中多种植物密集种植使得病害检测困难，并可能促进病原体从共生的无症状携带者传播到无天然免疫力的植物。苗圃还可能促进近缘植物病原物种间的杂交，产生更具侵袭性和更广寄主范围的杂种，例如欧洲的杂交疫霉菌（Phytophthora alni）导致大量树木死亡。

3.2. 高通量测序和环境DNA用于植物病原体监测的潜力

高通量测序（HTS）可以检测样本中任何生物体的核酸，无需预先知道存在何种生物，欧洲和地中海植物保护组织已发布相关指南。HTS已应用于园艺、农业和林业等多个领域，能在无症状时检测病原体，常能发现新物种或新记录物种。环境DNA（eDNA）是生物体留在环境中的遗传物质，可从空气、土壤和水等环境样本中提取，用于评估物种存在。eDNA方法在分析生物群落组成和监测入侵物种方面日益常规化，在植物苗圃等园艺环境中具有巨大应用潜力。与传统方法相比，eDNA结合适当的采样策略，可进行更彻底、高效的病害检测。物种特异性实时PCR等方法仅限于检测单个或少数目标物种，而酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法可能存在假阳性等问题。例如，2025年一项针对英国苗圃疫霉菌多样性的eDNA研究发现85个独特的疫霉菌物种或复合体。然而，将eDNA测序方法应用于园艺环境监测，需要稳健、可重复且实用的采样和检测方法。采样方法对监测数据的准确性有重要影响，与eDNA分析的实验室和生物信息学部分相比，一致的采样方法更难实现。在选择eDNA样本类型和采样方法时，必须考虑多种因素，包括病原体传播途径（如疫霉（Phytophthora capsici）主要通过水传播）、成本、可及性、样本稳定性和储存，以及园艺设施布局的多样性。

3.3. 针对不同植物病原体类群的采样基质优化

3.3.1. 植物病原体生命周期与eDNA检测

卵菌

卵菌是一类真核生物，包括疫霉属（Phytophthora）、腐霉属（Pythium）和霜霉病等许多重要植物病原体。许多卵菌物种存在于土壤中，常以休眠孢子越冬。疫霉和腐霉在潮湿土壤中繁殖，其游动孢子可分散。卵菌通过水传播（游动孢子或土壤颗粒中的休眠孢子）或空气传播（孢子囊）扩散。因此，检测卵菌的eDNA需要仔细考虑采样类型。疫霉属物种主要通过水中的游动孢子传播，因此通常被认为是土传病原体。水和生长介质是苗圃中疫霉菌传播的关键途径。土壤传播的疫霉菌在潮湿土壤条件下感染植物根部和根颈区域。一些疫霉菌种类产生可脱落孢子囊，感染寄主植物的嫩枝、叶、树皮和果实，并可通过风和风雨传播。空气和水样中均已检测到多种疫霉菌。疫霉菌DNA可在干燥土壤中持续检测长达90天。腐霉属物种是重要的植物病原体，可在水样和土壤样本中检测到。它们在苗圃环境中主要通过灌溉水和盆栽混合物的移动传播，不产生可脱落孢子囊，因此不由空气传播。霜霉病寄主范围窄，依赖寄主生长和繁殖。它们可以休眠卵孢子在土壤中存活，并通过根引发感染，但主要通过空气传播的孢子囊在寄主叶片下表面形成特征性霜霉斑块传播。有研究通过显微镜在空气样本中检测到霜霉病菌，但分子分析未能成功。然而，最近一项研究发现，土壤微生物群比叶片微生物群更能预测霜霉病（Plasmopara viticola）的发病率。

真菌

真菌导致约70%的植物病害，全球已发现超过19,000种植物病原真菌。许多重要真菌病原体感染观赏植物，如灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、镰刀菌（Fusarium）等。可通过检测受感染植物材料来检测植物病原真菌。许多真菌物种产生大量孢子通过风传播，如白蜡枯梢病（Hymenoscyphus fraxineus）的病原体。真菌孢子通过风、水、土壤和动物媒介传播。空气样本的eDNA已被用于检测许多真菌物种，并成功应用于森林苗圃。来自空气采样的真菌DNA可准确反映区域尺度白蜡枯梢病的流行率。植物病原真菌也可通过水样eDNA检测。雨水收集器（一种装有漏斗和筛网以防止碎屑的容器）已在森林中成功用于检测多种植物病原真菌。许多真菌存在于土壤中，植物病原真菌通常是土传的，感染植物的根部和地下部分。分子方法已被用于检测土壤中的植物病原真菌，例如通过实时PCR检测导致栗疫病的寄生隐丛赤壳菌（Cryphonectria parasitica）。来自土壤的eDNA可用于评估真菌多样性，是监测环境健康的有效工具。

细菌

许多重要的植物病原体是细菌，具有广泛的生存策略，可定殖植物表面和内部组织。基于本系统性综述，目前文献在利用eDNA技术检测园艺苗圃中的细菌性植物病原体方面存在巨大空白。然而，可根据当前对细菌性植物病原体的知识做出一些推断来指导eDNA的使用。植物病原细菌DNA可以从受感染的成株组织和种子中分离。植物病原细菌通过多种方式传播。许多细菌物种具有鞭毛，具有一定程度的自主运动能力。水流和风有助于细菌在土壤中或表面的被动移动。植物病原细菌也可通过动物媒介传播。许多植物病原细菌物种仅限于韧皮部的筛管或木质部的导管，主要通过嫁接接种传播，大多由在木质部或韧皮部取食的昆虫媒介传播。多种昆虫类群可在植物间传播细菌病原体。eDNA从空气样本中提取可用于检测昆虫媒介，因此有可能通过空气、土壤或水样回收细菌eDNA。在园艺环境中，水样可能为细菌提供有用的eDNA结果，因为已有报道在无土栽培系统的水样中检测到植物病原细菌eDNA。空气采样也有潜力，已在塑料隧道采集的空气样本中检测到植物病原细菌eDNA。由于细菌在生长介质中移动性有限，生长介质样本的结果可能因介质异质性而不可预测。苗圃中的灌溉和排水系统是静态和可预测的，因此水样可能比空气和生长介质采样更能代表苗圃系统中细菌类群的存在情况。生长介质渗滤液的水样可能更适于评估生长介质中存在的细菌种类。关于细菌在生长介质中的存在如何转化为生长介质渗滤水中细菌/细菌DNA的存在，需要更多研究。HTS极为灵敏，应能检测到渗滤液中极少量的细菌。据报道，多种植物病原细菌存在于开放水源和/或灌溉系统中，但在利用eDNA测序检测灌溉系统中的植物病原细菌方面，缺乏明确的方法学指南。

病毒

植物病原病毒是小型专性寄生生物，由蛋白质衣壳内的核酸分子组成，是全球植物健康的最重大威胁之一。植物病原病毒存在于水中，如烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）等一些病毒在环境水中可长期保持传染性。许多病毒寄主范围极广，易在寄主间传播。植物病毒主要通过花粉、种子和媒介三种途径自然传播，也可通过无性繁殖传播，例如在通过茎插繁殖期间接触传播，这可能对苗圃生产系统构成特殊威胁。因此，理论上检测这些基质中的任何一种样本都可以检测到病毒eDNA。基于本综述结果，植物材料是检测病毒eDNA最常用的样本介质。文献中有许多最近利用HTS在植物材料中检测病毒的案例。使用植物组织以外的替代样本类型具有潜力。许多高致病性植物病毒由昆虫媒介传播。因此，能够检测昆虫媒介的样本可能有助于植物病毒监测。有研究概述了利用作物表面eDNA检测虫害的方案，并已成功应用于检测传播病毒的昆虫物种。飞虫也可能存在于空气样本中，可检测其中是否存在植物病原病毒。已有研究从花粉中成功提取病毒RNA以检测病毒，这说明了花粉采样在植物病毒监测中的潜在效用。不同的采样方法将检测不同类型的病毒。一些植物病原病毒是土传的，但本文献综述未发现在苗圃环境中通过eDNA/eRNA研究在生长介质中检测这些病毒的报道。

3.3.2. eDNA样本基质与方法

水样采集

水样采集相对于其他基质有几个优势。水用于灌溉，因此在大多数园艺环境中大量存在。许多植物病原体通过水传播，使其在监测方面具有高潜力。根据采集位置，水样可涵盖比植物材料或生长介质样本大得多的集水区。然而，其缺点在于，如果在某个水样中检测到特定病原体，可能无法确定是哪株植物（如果有的话）被感染，根除病虫害可能需要销毁健康植物。尽管苗圃中水很丰富，但灌溉和排水系统差异很大，难以制定一致且可重复的通用采样方案。水样通常需要现场过滤以保存eDNA。现场过滤便于运输和封存可能含有病原体的样本，但可能耗时且需要专门设备。为最大限度发挥水样采集在eDNA应用中的效用，必须制定明确的指南。用于eDNA提取的水样采集通常包括收集和随后过滤水样。大多数eDNA水样采集工具是为比苗圃中更大的水体开发的，因此通常需要对标准采样方法进行一些修改以适应苗圃环境。从苗圃采集的水可能含有大量碎屑，这意味着可能需要某种程度的预过滤以去除大颗粒。采样量和过滤器类型至关重要。通常，采集较大水量可提高DNA产量。过滤器可由多种材料制成，孔径也至关重要。研究表明，孔径为5 μm、厚度为125 μm的聚偏二氟乙烯过滤器是过滤时间和回收率方面的最佳选择。不过，使用较大孔径过滤可能无法检测到细菌等较小生物。可以在不进行过滤的情况下保存eDNA样本，但需要更多研究来量化未过滤样本中微生物随时间的变化。

生长介质采样

生长介质采样在检测植物病原体方面有几个关键优势，尤其是在苗圃环境中。通常采集相对大量的生长介质样本，均质化后取子样本进行后续检测。大多数苗圃植物生长在某种生长介质中，因此易于获取且广泛存在。许多重要植物病原体存在于根际。由于地上部症状常在晚期出现且指示性不强，及时识别根病的致病因子很困难。一些研究说明了土壤采样在植物病原体监测中的效用。生长介质采样也有一些缺点。例如，由于生长介质具有异质性，可能难以采集足够大的样本以代表整体多样性。在盆栽植物中，土壤可能紧密且难以移除，并可能含有大量根材料。从盆栽植物根部附近采集大量土壤可能严重损害植物健康和销售价值。叶部病原体也可能被遗漏。此外，生长介质含有不同的微生物群落，因此获得的数据可能因大量非病原体DNA序列“噪音”而难以分析。微生物细胞密度和相应基因组大小也可能引入对某些病原体检测的偏差。土壤还具有高腐殖酸含量，可作为PCR抑制剂并负面影响DNA产量。

空气采样

空气传播是病原体传播的常见且有据可查的机制。从空气样本中提取的eDNA可能有助于检测任何产生空气传播孢子的病原体，包括许多真菌和一些卵菌植物病原体。空气采样已在多个不同时空尺度的研究中得到应用。研究表明，广泛用于监测花粉计数的永久性空气生物学网络不仅可以检测森林病原真菌，还可以提供关于其区域丰度的见解。检测空气样本中的eDNA需要考虑多个因素，包括要使用的采样器、采样器的放置位置和高度、要采集的空气体积以及采集空气的时间段。空气采样可通过不同方法实现：过滤、旋风、撞击或冲击技术。基于过滤的方法通过泵使空气通过滤膜。旋风采样器利用离心力在采样器表面捕获生物气溶胶。撞击采样使空气通过喷嘴，并在空气进入液体时在液体收集介质中收集生物气溶胶。冲击采样涉及通过喷嘴采集空气样本，随后将其冲击到明胶或琼脂平板等表面上。据报道，基于过滤的方法比基于撞击或冲击的空气采样方法能回收更高的DNA产量。空气的DNA研究倾向于使用基于过滤的技术或基于旋风的技术。可商购的空气采样器包括基于过滤的MD8空气采样器和旋风Coriolis空气采样器。空气传播真菌多样性也已通过从装有粘胶带的体积采样器中提取eDNA成功评估。

植物材料采样

采样和检测植物材料是检测植物病原体最常用的技术。这些样本取自植物的任何部分，包括叶、花、根和茎。植物组织采样的一些优势包括易于收集、如果病原体存在则检测机会更高以及成本较低。用于eDNA提取的植物材料样本应使用液氮立即冷冻并储存于-70°C，或在密封容器中用10倍过量的硅胶干燥。许多研究已使用植物材料的HTS来鉴定病原体，并取得了良好结果。可针对植物的有症状区域进行采样，因此不太可能遗漏致病因子。用于监测目的的植物组织采样的一个主要缺点是集水区相对较小，只能阐明用于分析的那部分植物中存在的病原体。还应考虑选择受感染材料所需的时间和劳动力成本。无症状叶片的eDNA不会检测到附近叶片或其他植物上存在的病原体。这与空气或水采样形成鲜明对比，后者可检测环境中存在并被空气或水捕获的多种病原体。许多病原体存在于土壤中并感染植物根部，这些可能不太可能存在于植物的地上部分。

未来方向

本系统性文献综述总结了现有文献，并讨论了在园艺环境中使用eDNA元条形码检测不同植物病原体类群（病毒、卵菌、真菌、细菌、线虫）的各种采样方法的实际意义。进一步研究调查检测特定植物病原体类群的最佳eDNA样本类型，对于让这些技术发挥其潜力至关重要。在某些情况下，所讨论的方法尚未专门应用于植物病原体，而是应用于其他类群和非植物系统。例如，关于水样eDNA的现有文献主要集中在脊椎动物物种上。非植物病原体的例子可能为植物-病原体系统中的类似研究提供有用的起点。细菌eDNA，特别是植物病原细菌eDNA检测的研究，远不及真菌、卵菌和病毒的研究深入。这代表了文献中的一个显著空白，应在常规使用基于eDNA的方法进行植物病原体监测之前加以解决。其他领域（如人类健康）中使用的新兴eDNA采样技术可应用于园艺。本文认为，在适当情况下，应优化并采用水检测来检测园艺苗圃中的多种植物病原体。这是因为径流灌溉水比其他采样方法具有更大的集水区，理论上可以深入了解苗圃中的病原体风险状况。水样的元条形码特别适用于高风险疫霉属病原体，因为几项研究已经说明了其效用，并且水已被确定为观赏苗圃中其传播的高风险途径。然而，其缺点在于，如果样本对某种植物病原体呈阳性，可能很难在苗圃中找到受感染的植物。开发回溯系统，涉及测试排水系统中的一系列关键点，可能将受感染植物三角定位到苗圃的特定区域，并采取适当的植物检疫措施。然而，这依赖于苗圃物理组织、检验服务收集的样本类型以及常规应用于植物病原体调查的诊断类型的重大变化。需要进一步研究将病害存在与环境中的植物病原体eDNA存在联系起来。DNA可根据条件在环境中长期存在，难以区分死亡和存活的生物体。RNA在细胞死亡后迅速降解，因此可以更准确地反映是否存在活的病原体。许多植物病原体可能以低水平存在于环境中，因此从植物病理学角度来看，将环境中的eDNA数量与病害存在联系起来也至关重要。例如，如果在苗圃的径流水中检测到受管制病原体，诊断必须稳健，并且能够高度确定病原体存在。如果未能建立这些联系，可能导致苗圃主的巨大损失。关于受管制植物病原体的法规可能需要修改，以允许这些病原体在环境中存在可忽略的水平，但当然需要更多工作来定义这些“可忽略”的水平。在实验环境中测试来自故意接种植物的径流灌溉水，可以弥合这一知识差距，确认传染性植物病原体会将可检测的eDNA释放到环境中，并在许多先前研究中观察到。它还可以比较eDNA检测与传统目视检查。eDNA植物病原体监测要成为常规，需要稳健、可重复的方法。这需要在测试的所有阶段制定详细方案：采样、DNA提取和后续生物信息学分析。需要开展工作来验证这些方法，以便使用eDNA检测植物病原体能够获得认证并广泛应用。