综述：基于接触性未修饰反义DNA生物技术（CUADb）的寡核苷酸杀虫剂和RNA生物防治剂：分子基础及其在植物保护中的潜力

《Current Issues in Molecular Biology》：Contact Unmodified Antisense DNA Biotechnology (CUADb)-Based Oligonucleotide Insecticides and RNA Biocontrols: Molecular Bases and Potential in Plant Protection Vol Oberemok, Kate Laikova, Jamin Ali, Ilyas Chachoua and Nikita Gal’chinsky

　　

分子遗传学、核酸合成和生物信息学的最新进展为植物抵御害虫提供了新的机遇。目前，DNA和RNA均可作为活性杀虫成分，超越了其作为遗传信息载体的传统角色。这种新型活性通过两种根本不同的机制实现。其一是DNA遏制（DNAc），采用基于接触性未修饰反义DNA生物技术（CUADb，亦称"基因拉链"技术）的寡核苷酸杀虫剂。其二是RNA干扰（RNAi），采用基于双链RNA（dsRNA）技术的RNA生物防治剂。核酸反义活性分子机制的研究始于20世纪60年代初。虽然RNA通过干扰（RNAi）在基因沉默中的反义效应在20世纪90年代末被记录为线虫的抗病毒免疫反应，但CUADb反义方法最初于2008年作为一种针对鳞翅目害虫的强大防治策略出现。CUADb方法依赖于破坏核糖体RNA（rRNA）的生物合成和核糖体生成，而RNAi则在信使RNA（mRNA）降解方面显示出最佳效果，且针对rRNA尚未知有高效结果。这些方法的功效似乎具有物种依赖性。例如，CUADb对胸喙类（如蚜虫、粉蚧、木虱和介壳虫）、蓟马和螨类表现出最佳活性。而RNAi策略则对拟步甲科和叶甲科的甲虫显示出强大的杀虫潜力。本文将综述这两种技术之间的差异、其作用机制以及当前面临的应用挑战。

1. 引言

害虫防治领域不断革新，老一代化学药剂（氨基甲酸酯类和有机磷类）持续被当代药剂（新烟碱类和双酰胺类）所取代。然而，遗传抗性这一棘手难题使得此循环持续存在，这要求杀虫剂具有更长的效用、更高的选择性、更强的生物可降解性以及更低的碳足迹。生物分子作为克服这些挑战的有前途的工具最近崭露头角。DNA和RNA都已展现出显著的杀虫效果，这得益于分子遗传学、合成技术和生物信息学的进步。这导致了两种不同技术的发展：1. 基于接触性未修饰反义DNA生物技术（CUADb，亦称"基因拉链"技术）的寡核苷酸杀虫剂（一种由11个碱基的反义寡核苷酸与害虫前rRNA/rRNA的目标序列形成的DNA-RNA双链体，随后被RNase H降解）；2. 利用双链RNA（dsRNA）技术的RNA生物防治剂。与主要用于害虫防治的基因编辑工具CRISPR/Cas技术一起，这些技术共同代表了害虫防治的三种主要反义方法，各自采用独特的分子机制。RNAi通过被Argonaute核酸酶切割的向导RNA-mRNA双链体发挥作用，而CUADb则通过DNA(-RNA杂交体)引导的RNase（如RNase H1）处理向导DNA-rRNA双链体发挥作用。反义技术提供类群特异性的功效，可实现组合策略；它们不同的分子靶点排除了普遍适用性，但增加了高效靶向不同生物体的机会。

经过二十年发展，RNAi仍缺乏用于可靠杀虫剂开发的标准化设计算法。相比之下，CUADb拥有一个经过验证的设计框架，针对至少10-15%的害虫具有潜在效力，特别是在胸喙类（如蚜虫和粉蚧）和广义的准新翅类中表现出特殊功效。而RNA生物防治剂则主要对鞘翅目显示出最强的活性。这些独立的"孪生兄弟"，dsRNA技术和"基因拉链"技术（CUADb），在开发高选择性、下一代害虫防治剂方面具有协同潜力。本文评述了向基于核酸的解决方案的范式转变，并特别关注CUADb作为一种以新颖的DNAc机制和先进杀虫特性为特征的创新技术。

2. 基于CUADb的寡核苷酸杀虫剂

2008年，该研究组展示了使用短的未修饰反义DNA寡核苷酸作为接触性杀虫剂。最初在舞毒蛾上的研究表明，使用寡核苷酸杀虫剂（oligoRING和oligoRIBO-11）进行有效基因沉默关键在于靶标基因及其表达水平。后续研究确定rRNA为主要靶点，并于2019年开发了基于与害虫rRNA互补的11个碱基DNA序列的寡核苷酸杀虫剂。rRNA是一个理想的靶点，因为其丰度高（约占细胞RNA的80-85%），并且核糖体生产和维持需要大量的能量投入（>60%的细胞能量）。昆虫rRNA包括28S rRNA（~3900 nt）、18S rRNA（~1920 nt）、5.8S rRNA（~160 nt）、5S rRNA（~120 nt）以及线粒体rRNA（包括16S rRNA（~1140 nt）和12S rRNA（~600 nt））。核糖体RNA是核糖体的基本框架，是协调蛋白质合成的重要细胞器。不同于携带蛋白质组装遗传指令的信使RNA，rRNA是一种非编码RNA，在核糖体内催化蛋白质合成的实际过程；这包括与mRNA和tRNA配对、维持核糖体结构以及氨基酸之间肽键的形成。首次成功的rRNA靶向是使用未修饰反义DNA寡核苷酸针对舞毒蛾的5.8S rRNA实现的。基于CUADb的寡核苷酸杀虫剂使用DNAInsector程序或通过害虫前rRNA和成熟rRNA的GenBank序列手动设计。合成采用亚磷酰胺法，通过液相或固相合成，使用ASM-800、OligoPilot?、PolyGen 10-Column DNA Synthesizers等仪器。液相合成DNA的市场领导者之一，住友化学株式会社，提供1公斤长度11个碱基的未修饰寡核苷酸合成，价格为25,000美元。

寡核苷酸杀虫剂对胸喙类（如蚜虫、粉蚧、木虱和介壳虫）、蓟马和螨类显示出高效力，已在多个物种中成功靶向：卫矛矢尖蚧、英伦圆蚧、吹绵蚧、日本蜡蚧、月桂围盾蚧和褐软蚧的28S rRNA；葡萄粉蚧的18S rRNA；线粒体16S rRNA；菊姬长管蚧、松毛大蚜以及枯梢叶蝉的ITS2区域；以及二斑叶螨，证明了寡核苷酸杀螨剂具有很高的杀虫潜力。在100 ng/μL浓度下的单次接触处理（叶面上每平方米1 mg DNA，溶于10 mL溶液，或每公顷10 g，溶于100 L），通常可在3-14天内实现约80%的害虫死亡率。虽然在半翅目上高度有效，在包括舞毒蛾在内的鳞翅目上中等有效，但其在鞘翅目如科罗拉多马铃薯甲虫上的效力明显较低，且需要进一步研究其对这种方法的抗性。11个碱基的长度提供了物种特异性，唯一性频率超过1/4.19×10⁶，覆盖大多数农业应用。此外，先前对英国栎、苹果和小麦的生化参数，以及对烟草天蛾、小地老虎和大蜡螟的存活率研究表明，寡核苷酸杀虫剂对非靶标生物是安全的。然而，假设寡核苷酸杀虫剂与rRNA的非完美位点之间可能发生非经典碱基配对，例如A:C和G:U，并导致非特异性效应。毫无疑问，在设计寡核苷酸杀虫剂时应考虑非经典碱基配对，以免伤害非靶标生物。rRNA的丰度和种间变异性的双重优势使其优于浓度较低的细胞mRNA作为靶点。接触施用优于口服施用，因为半翅目昆虫具有消化DNase和口外唾液屏障，会干扰口服递送。

2008年接触性寡核苷酸杀虫剂的发现出乎意料，它挑战了已建立的观点，即未修饰的寡脱氧核糖核苷酸会被DNase快速降解，以及rRNA能够抵抗反义DNA介导的降解。先前的研究完全集中于基因下调，忽视了杀虫潜力。寡核苷酸杀虫剂通过两步DNA遏制（DNAc或"基因拉链"）机制反驳了这些假设（图1；左半部分）：首先，靶标rRNA被"捕获"，停止核糖体功能并触发rDNA转录过度补偿，随后靶标rRNA被DNA(-RNA杂交体)引导的RNase（如RNase H1）降解。这种"基因拉链"机制诱导代谢向基于脂质的能量合成转变，增强了线粒体中核糖体的生物合成和ATP产生。最终，广泛的激酶下调（包括通过mTORC1调节核糖体生物合成的mTOR）由于ATP不足导致"激酶灾难"，同时在DNAc过程中RNase H1显著上调。值得注意的是，在科学文献已知的任何导致不同核仁应激反应的外源性触发物中，尚未观察到昆虫细胞中这种基因表达模式。

2011年，即此发现三年后，Wang等人将接触概念应用于dsRNA杀虫剂。关键的是，DNAc下调了关键的RNAi酶，强调了其与RNAi机制上的区别。因此，CUADb中的单链DNA和RNAi中的双链RNA代表了根本不同的反义技术，并暗示了两种机制之间的拮抗作用，尽管在害虫治理中可能存在协同潜力。

一个工作假说提出，DNA和RNA病毒（利用其互补的基因组序列）可能利用在DNA遏制机制初始步骤中观察到的rRNA基因表达过度补偿，来增加病毒复制所必需的细胞核糖体数量。生物信息学研究表明，病毒劫持宿主基因是常见的。鉴于rRNA的主导地位（约占细胞RNA的80%）以及核糖体生产的巨大能量投入（>60%），DNA病毒可能在共同进化过程中采用了rRNA样序列，但其功能未知，基于获得的实验数据，我们推测这些病毒rRNA样序列参与了rRNA合成的触发。同样，作为一个需要进一步研究的假说，细胞可能以类似于冈崎片段的方式产生自身的反义DNA，用于调节rRNA合成和一般基因表达。值得注意的是，对于RNA病毒，DNAc机制也可能发挥重要作用。从生物信息学上，我们在一些RNA病毒的基因组中，在依赖于RNA的RNA聚合酶序列附近发现了rRNA样序列。在这种情况下，互补的rRNA-病毒RNA相互作用也可能促进病毒复制所需的宿主rRNA产生。rRNA样序列在病毒基因组中与RNA依赖性RNA聚合酶基因邻近，暗示了与细菌基因组中CRISPR/Cas系统等遗传系统紧凑布局的相似性。

从实际角度看，针对害虫rRNA基因的保守区域设计寡核苷酸杀虫剂可以延缓靶点位点抗性的发展，因为突变在这些区域发生频率较低。当抗性产生时，可以通过将靶点位点转移到rRNA基因内抗性区域附近来设计新的有效CUADb杀虫剂。许多文章指出，最具抗性的害虫是螨类和半翅目昆虫。因此，鉴于寡核苷酸杀虫剂已证明对这些害虫有效，预计该技术对约30%最具抗性的节肢动物有效，对胸喙类和叶螨显示出显著的活性。作为一个额外优势，还可以创建针对rRNA多个位点的单链DNA片段混合物，使得害虫对这类"寡核苷酸混合物"产生抗性的可能性极低。

作用后，寡核苷酸杀虫剂通过非生物因素和生物因素在环境中快速、清洁地生物降解。舞毒蛾、科罗拉多马铃薯甲虫、吹绵蚧、英伦圆蚧、月桂围盾蚧及其寄主植物组织匀浆中的脱氧核糖核酸酶在27°C下24小时内降解寡核苷酸杀虫剂，而菊姬长管蚧的核酸酶可在1小时内实现降解。与固相方法相比，基于亚磷酰胺化学的现代DNA合成减少了温室气体排放，应对了气候问题。

总之，克服广泛的农药抗性需要开发新型、高特异性的农药类别以减少环境影响。寡核苷酸杀虫剂代表了一项显著进步，它使用未修饰的反义寡核苷酸。仿效治疗性寡核苷酸通过持续研究和投资克服早期挑战的轨迹，基于CUADb的杀虫剂提供了选择性作用、快速生物降解和日益经济高效的生产，呈现出一种极具前景的方法。基于我们的估计，"基因拉链"技术有可能通过一个简单灵活的算法控制至少15%的害虫。寡核苷酸杀虫剂可以使用DNAInsector程序或手动使用GenBank数据库中的害虫前rRNA和rRNA序列进行设计。现在个人完全有可能手动构建任何匹配胸喙类害虫前rRNA或rRNA序列的寡核苷酸杀虫剂，并具有高效力的高可能性。值得注意的是，如果发生杀虫剂抗性，可以采用不同的策略。通常，可以创建新的寡核苷酸杀虫剂，将靶点从rRNA或前rRNA的寡核苷酸杀虫剂抗性位点向左或向右移动。配方添加剂可能会提高对其他昆虫目的效力，有待环境安全评估。此外，优化的寡核苷酸设计算法和多靶点组合可以提高基于CUADb的害虫防治剂的性能。未来的研究无疑将揭示DNAc机制及其潜力的更深层次细节。CUADb为可持续、无外源性化学物质的农业铺平了道路，将寡核苷酸杀虫剂定位为害虫防治中潜在的基石药剂。经过近二十年的研究和大量投资，"基因拉链"技术现在已成为一种引人注目且快速发展的方法。值得注意的是，基于反义寡核苷酸的CUADb在作物保护领域已获得普及和推广。另一种基于核酸的植物保护技术基于dsRNA，具有其独特的特点、优势和挑战。通过RNAi进行序列特异性mRNA降解的双链RNA应用，正在成为开发新型基于RNA的可持续害虫管理策略的重要工具，将在下文讨论。

3. RNA生物防治剂

RNA干扰的基础由Andrew Fire和Craig Mello的开创性发现奠定，他们发现双链RNA中的反义链介导序列特异性基因沉默——这一突破性成果获得了2006年诺贝尔生理学或医学奖。这一关键工作催化了农业和林业研究中植物保护的广泛生物技术应用。RNAi通过转录后和翻译水平抑制基因表达发挥作用，利用通常超过200个碱基对、与靶基因互补的dsRNA分子。其机制始于RNase III酶（Dicer）将长链dsRNA切割成20-30个核苷酸的小干扰RNA。这些siRNA随后与Argonaute家族蛋白结合，形成细胞质mRNA降解的RNA诱导沉默复合体，或核基因抑制的RNA诱导转录沉默复合体。一个平行途径涉及PIWI相互作用RNA，它们是生殖系特异性分子，与PIWI亚家族蛋白复合，通过不同的沉默机制抑制转座因子。这些RNAi途径共同在昆虫个体发育中发挥着关键的调节作用，最终通过靶向mRNA降解或翻译阻断来破坏特定蛋白质的生物合成。

RNAi的功效在经济上重要的害虫中表现出深刻的分类学差异。鞘翅目通常表现出较高的系统性效率，而直翅目和蜚蠊目通常表现出强烈的反应。由于其效率在膜翅目和半翅目中是可变的，这主要归因于刺吸式昆虫的RNA指导的RNA聚合酶活性有限，导致系统性扩散不足。鳞翅目和双翅目通常对RNAi表现出较低的敏感性。因此，商业化RNAi生物杀虫剂的开发在很大程度上仍局限于鞘翅目靶标，靶向mRNA涵盖调控发育、解毒和繁殖的基因。

迄今为止，RNAi已开发出两种主要的递送策略：表达dsRNA的转基因植物，以及配方化喷雾产品的局部施用。GM方法在生物技术法规框架下经历漫长的监管评估，而喷雾制剂（归类为生化农药）则提供了潜在的时间和成本优势，其注册时间取决于最终产品组成。目前，商业应用的RNAi产品很少。里程碑式的SmartStax? PRO玉米结合了两种Bt杀虫蛋白与针对玉米根虫囊泡运输的DvSnf7 dsRNA。这种三重作用模式的金字塔实现了对西部玉米根虫和北部玉米根虫幼虫99%的抑制，尽管dsRNA诱导的死亡率比Bt毒性显现得更慢。靶向的Snf7蛋白在调节跨膜蛋白分选和降解的ESCRT-III通路中发挥作用，文献记载DvSnf7 RNAi和Bt毒素之间不存在交叉抗性。实验性转基因作物证明了对多种害虫有效，包括草地贪夜蛾、蚜虫、科罗拉多马铃薯甲虫和叶螨。dsRNA方法的一个优势是可以创建长的嵌合dsRNA，它可以被切割成靶向害虫基因组中保守序列的siRNA池，并且预计靶点对此类dsRNA制剂的抗性不会快速发展。

首个外源性喷雾型dsRNA生物杀虫剂Calantha?于2023年由GreenLight Biosciences公司商业化，用于防治科罗拉多马铃薯甲虫。以9.4 g/ha施用，能在2-3天内诱导几乎完全停止取食，并在11-26天内对1-2龄幼虫实现90-95%的死亡率。其操作限制包括严格的幼虫阶段特异性、需要连续施用以及建议与具有不同作用模式的杀虫剂轮换使用。概念验证成功涵盖了众多类群，但均未超越实验阶段。

喷雾型RNAi杀虫剂的开发和部署引发了许多超越功效和递送技术考量之外的伦理、法律和社会影响，包括建立公众对喷雾型RNAi生物杀虫剂的信任和接受度。从法律角度看，喷雾型RNAi生物杀虫剂提出了监管分类和协调的挑战。支持者主张澄清监管模糊之处，并采用适当和标准化的基于科学的风险评估来评估喷雾型RNAi杀虫剂。一些人认为，植物保护产品风险评估应进行调整，以评估与喷雾型dsRNA杀虫剂相关的独特风险，而另一些人则坚持认为这些产品应作为另一种形式的基因工程进行监管。尽管dsRNA技术前景广阔，但仍存在限制其应用的主要挑战。由于补偿性细胞反应，包括蛋白质稳定性、旁系同源基因间的功能冗余以及转录反馈回路，靶基因的选择缺乏共识。半衰期长的蛋白质即使在mRNA水平显著降低后也可能持续存在，延迟或减弱可观察到的表型效应。基因表达水平和功能冗余也影响RNAi结果。此外，补偿性反馈机制可能响应基因敲低而出现。因此，一种策略是选择没有相关补偿基因或冗余途径的基因。功效因发育阶段、组织类型和递送方法而有显著差异。喷雾诱导基因沉默范式存在机制模糊性，即dsRNA摄取主要是通过体壁渗透还是口服摄入仍未解决，这妨碍了优化工作。脱靶效应可能源于少至15个连续碱基匹配，或与序列无关的免疫激活，辅料可能增强非靶标暴露。dsRNA在土壤/叶际中通过微生物核酸酶、紫外线辐射和降水径流而快速环境降解，昆虫血淋巴和唾液中的核酸酶能在短时间内降解dsRNA，干扰强大的杀虫效果。

虽然通过无细胞平台，dsRNA的生产成本已经降低，但dsRNA并非公开可获得，且可负担的价格似乎存疑。MEGAscript? RNAi Kit允许以约3000美元生产10 mg dsRNA。第三种选择是通过发酵生产dsRNA。预计后者将成为实验室大规模生产dsRNA最易得和最具成本效益的方法，目标成本接近4美元/克。然而，这些价格尚未达到商业可行的程度，定制体外转录构建体仍按≥500美元/10 mg收费。RNA生物防治剂仍面临比传统杀虫剂致死速度更慢、残留活性更短的挑战。与转基因作物相比，喷雾型dsRNA具有理论优势，但需要对RNAi通路有更深入的机制理解并进行环境安全验证。此外，新型递送系统和dsRNA的化学修饰可能显著增强RNAi技术在植物保护实践中的应用。

4. 结论

尽管CUAD生物技术和双链RNA技术都使用核酸作为活性成分，但它们代表了具有不同机制和应用的根本不同的杀虫方法。寡核苷酸杀虫剂主要通过接触施用短的未修饰反义DNA片段，通过DNA遏制机制降解害虫的靶向核糖体RNA。DNA片段的脱氧核糖主链赋予其比基于RNA的对应物更强的抗环境水解能力，而其紧凑的大小（约11个核苷酸）实现了卓越的靶向精度。核糖体RNA约占细胞RNA的80%，因其丰度和代谢重要性而成为最佳靶点，目前的效力在刺吸取食的胸喙类中最显著。相比之下，RNA生物防治剂利用通过接触或口服途径施用的较长双链RNA分子，通过RNA干扰途径降解信使RNA。这些分子的核糖主链增加了对环境水解的敏感性，而其延伸的长度以及随后酶切成更小片段使得选择性控制复杂化，需要对非靶标生物进行仔细的风险评估。目前，dsRNA杀虫剂需要优化的设计算法和扩大的靶害虫谱，而基于CUADb的寡核苷酸杀虫剂主要需要在更多害虫类群中进行更广泛的验证。值得注意的是，基于CUADb的杀虫剂和RNAi杀虫剂可以互补作用，并用于针对广泛害虫的复合配方中。同时靶向不同的自然机制（DNAc和RNAi）将避免对新型核酸基杀虫剂快速产生抗性。

两类杀虫剂都受益于经济高效的合成：DNA寡核苷酸的液相亚磷酰胺法和dsRNA的无细胞酶法生产。值得注意的是，虽然RNAi机制在实用dsRNA杀虫剂出现前数年已被阐明，但DNAc机制是在害虫防治中反义寡脱氧核苷酸的持续应用研究之后发现的。这些创新技术很可能针对特定害虫类群表现出最佳功效，通过精心设计和在靶向多种害虫的配方中潜在的协同整合，提供更长的效用。与对非靶标生物和生态系统的传统化学杀虫剂相比，它们结合了高选择性、快速环境生物降解和创新机制，这使基于核酸的杀虫剂具有更有利的安全特性，并将其定位为可持续农业未来不可或缺的生物分子。