《Journal of Dairy Science》：Long-term metabolic and developmental effects of in vitro embryo technologies in female cattle
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人工生殖技术(ART)可能对后代产生长期影响，这在奶牛中尚未得到研究。这项纵向研究调查了通过不同ART（包括人工授精(AI)和胚胎移植(ET)）受孕的胚胎受体牛的生殖结局和跨代效应，其中ET使用了新鲜、冷冻和玻璃化胚胎。为此，将体外生产(IVP)胚胎移植到同步
人工生殖技术(ART)可能对后代产生长期影响，这在奶牛中尚未得到研究。这项纵向研究调查了通过不同ART（包括人工授精(AI)和胚胎移植(ET)）受孕的胚胎受体牛的生殖结局和跨代效应，其中ET使用了新鲜、冷冻和玻璃化胚胎。为此，将体外生产(IVP)胚胎移植到同步发情的受体牛中（来自AI的298次ET，以及来自IVP-ET来源的84次ET）。记录了第40天和第62天的妊娠率、足月分娩率和妊娠期长度。从出生到成年，监测了犊牛的形态测量（体重、体尺和胸围）（n=142头），并分析了外周血淋巴细胞中的IGF2甲基化和表达（n=113个样本）。比较了由AI和ET出生的同步发情受体牛在发情周期第0天（n=179个样本）和第7天（n=176个样本）的血浆代谢组以及代谢调控通路。数据采用广义混合模型（参数）和Kruskal-Wallis检验（非参数）进行分析。AI和ET受体牛的妊娠率和分娩率没有差异。然而，来自ET出生受体牛的母牛在分娩时更重，并且它们的犊牛表现出跨代效应，包括出生体重、体尺、妊娠期长度和日增重均高于AI受体牛的犊牛。只有来自冷冻胚胎的犊牛在第30天表现出短暂的IGF2低甲基化，随后消失。相比之下，来自冷冻保存胚胎的犊牛在第0天和第30天IGF2表达降低，而来自玻璃化胚胎的2-14月龄犊牛IGF2表达升高，但此后各组之间无差异。在>6月龄的雌性中，来自冷冻胚胎和AI的雌性比来自玻璃化和新鲜胚胎的雌性更重更高。第0天和第7天某些代谢物浓度在受体组之间存在差异，主要是必需氨基酸和单碳生成单位代谢物。总体代谢差异（马氏距离矩阵）在第0天AI雌性高于ET冷冻保存雌性，在第7天AI雌性高于ET新鲜胚胎雌性。这些发现表明ART诱导了表观遗传和代谢变异，可能影响营养效率。
**研究背景与问题**
早期发育影响成年健康的概念起源于Barker等研究者，最初母体营养是发育编程的主要焦点，后来扩展到化学物质暴露、父本效应和辅助生殖技术(ART)。早期胚胎发育受精细调控的表观遗传和转录组机制影响，在牛中，胚胎基因组激活期间的发育编程高度依赖于母体营养，影响早期和晚期妊娠及后代生长。母体应激可引发胚胎表观遗传改变，并传递给后代。生殖技术导致胚胎表观遗传改变，可传递给后代，导致长期效应。体外培养结合胚胎冷冻保存可能比单独技术产生更大影响。在反刍动物中，体外胚胎技术(IVP)与胎儿和犊牛异常相关，包括胎盘异常和后代体重增加，称为大胎儿综合征(LOS)或异常后代综合征。出生体重与胰岛素样生长因子2(IGF2)转录本丰度相关。关于ART个体健康的长期研究在人类中很多，但在牛中很少，大多数集中在出生后最初几天或第一年。因此，研究人员开展了此项研究，探索通过不同ART出生的胚胎受体牛的怀孕能力，以及对下一代产生的影响，并调查了IGF2甲基化和表达、生长形态，以及成年后代的代谢组。
**研究内容与结论**
研究人员对通过不同ART（人工授精AI和胚胎移植ET，ET包括新鲜、冷冻、玻璃化胚胎）出生的雌性牛进行了纵向研究，监测了它们的生育力（作为受体牛）、后代生长、IGF2表观遗传和表达，以及成年后血浆代谢组。结论：怀孕和分娩率无差异，但ET出生母牛的后代表现出跨代效应，体重更大等；冷冻胚胎导致短暂IGF2低甲基化；代谢组存在差异，主要涉及氨基酸和单碳代谢。意义：ART诱导表观遗传和代谢变异，可能影响营养效率，为补偿性营养策略和基因组选择提供信息。论文发表在《Journal of Dairy Science》。
**主要关键的技术方法**
研究人员在SERIDA-Deva实验牧场（西班牙）开展研究，样本来源包括来自外部商业牧场的AI出生雌性，以及来自IVP胚胎的ET出生雌性（共131头IVP犊牛，来自2011-2023年）。主要技术方法：1) 体外胚胎生产：从屠宰场卵巢采集卵母细胞，进行体外成熟和体外受精(IVF)，培养至第7天，移植或冷冻保存（冷冻/玻璃化）。2) 生育力评估：将胚胎移植到同步发情的受体牛，记录第40天、第62天及足月妊娠率。3) 形态测量：每月监测体重、体尺、胸围至17月龄。4) IGF2分析：从外周血淋巴细胞提取DNA和RNA，通过亚硫酸盐测序和定量PCR(qPCR)分析IGF2甲基化和表达。5) 代谢组学：使用核磁共振(NMR)分析血浆代谢物，采集第0天（发情期）和第7天（早期黄体期）样本，通过马氏距离和通路分析（MetaboAnalyst 6.0）比较组间差异。统计方法为广义混合模型和Kruskal-Wallis检验。
**研究结果**
**实验1：ART出生雌性用作受体牛时的生育力**：通过分析AI和ET（新鲜、冷冻、玻璃化）出生受体牛的胚胎移植结果，发现各组间妊娠率（第40天、第62天）和分娩率无显著差异，表明ART出生雌性作为受体牛的生育力与AI出生者相当。
**实验2：ART出生动物的产后犊牛生长和形态测量**：每月测量体重、体尺和胸围至15月龄，发现断奶后组间差异显著。冷冻胚胎(F/T)和AI出生的雌性体重和体尺显著高于玻璃化(V/W)和新鲜胚胎(F)出生的雌性，体尺差异最显著。指数回归曲线显示F/T vs. F和V/W在体重、体尺和胸围上均有显著差异。
**实验3：ART出生动物中IGF2基因的纵向研究**：分析外周血淋巴细胞中IGF2甲基化和表达，发现冷冻胚胎出生的犊牛在第30天出现短暂IGF2低甲基化，随后恢复；冷冻保存胚胎（F/T和V/W）出生的犊牛在第0天和第30天IGF2表达降低，而V/W犊牛在2-14月龄表达升高，但成年后（>14月龄）各组间无差异。甲基化和表达与年龄无整体相关，但F和V/W组中甲基化与年龄呈负相关。
**实验4：ET和AI出生受体牛所生犊牛的出生体重和形态测量**：比较AI、冷冻保存IVP和新鲜IVP出生母牛所生第二代的出生体重、体尺、胸围、妊娠期长度和日增重。发现IVP出生母牛的后代出生体重更大、体尺更大、妊娠期更长、日增重更高，且母牛分娩时体重更重，差异具有统计学意义。
**实验5：成年雌性的代谢组学研究**：通过NMR分析第0天和第7天血浆代谢物，发现AI和ET出生雌性间代谢物浓度存在差异，主要涉及必需氨基酸（如亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸）和单碳生成单位代谢物。第0天AI与冷冻保存ET间马氏距离最大，第7天AI与新鲜ET间距离最大。通路分析显示第0天和第7天均富集了甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸代谢，以及柠檬酸循环等通路。
**讨论与结论**
讨论部分指出，IVP胚胎来源的雌性组与AI组在代谢上存在差异，且形态差异可传递给后代，但生育力未受影响。IGF2变化在成年后消失，但生长差异持续。代谢差异可能源于表观遗传基础，尤其是单碳代谢。结论翻译：由胚胎移植(ET)出生的母牛作为受体牛时，其怀孕率和分娩率与人工授精(AI)出生的母牛同样有效。然而，在这些母牛所生的犊牛中观察到了跨代差异，它们通常产下第二代超重女儿，反映了其母牛出生时的表型。胚胎处理影响了犊牛淋巴细胞中IGF2（一种以时间依赖性方式调控生长的重要基因）的甲基化和表达。然而，尽管对IGF2的影响在成年后消失，但超重（体重和体尺）仍然区分了AI和冷冻胚胎(F/T)出生的雌性与新鲜和玻璃化(V/W)出生的雌性。在同步发情受体牛收集的血浆中观察到的代谢差异（覆盖围受孕期），表明AI和ET雌性之间存在表观遗传基础和潜在不同的营养效率。需要更多研究来探索这些差异。该研究的结果提供了关于使用体外生产(IVP)新鲜和冷冻保存胚胎所影响的过程和表型的见解，可能为这些动物提供补偿性营养策略，并提示在基因组选择中应考虑的要素。
