《Journal of Ethnopharmacology》：Study on the anti-pulmonary fibrosis mechanism of Renshen Pingfei formula by inhibiting M2 macrophage polarization and regulating TGF - β/SMAD signaling pathway
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人参复肺方通过抑制TGF-β/Smad信号通路和M2巨噬细胞极化改善博来霉素诱导的小鼠肺纤维化，减少胶原沉积并调节炎症因子。
洪玲玲|孙宇波|侯海慧|张静静|史伟伟|杨瑶静|范新生|朱金峰
南京中医药大学中医学院，南京，210023，中国
摘要
民族药理学相关性
人参平肺方（RSPF）是一种传统中药方剂，历史上在中国被用于治疗“肺痹”（肺瘀症），其症状和发病机制与特发性肺纤维化（IPF）一致。研究目的
本研究旨在探讨RSPF对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化的影响，并探索其对TGF-β/SMAD信号通路和M2型巨噬细胞极化的调节作用。材料与方法
采用LC-MS/MS技术检测和鉴定RSPF的主要活性成分。体内实验使用48只C57BL/6小鼠，分为六组（每组8只）：对照组、博莱霉素（BLM）组、低剂量RSPF组、中等剂量RSPF组、高剂量RSPF组以及尼达尼布（Nintedanib）组（剂量分别为8.8、17.5或35 mg/kg）。通过气管内注射5 mg/kg的博莱霉素建立肺纤维化小鼠模型。利用苏木精-伊红（HE）、Masson染色和Sirius red染色方法评估肺组织的病理变化。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中的IL-1β和TNF-α水平。免疫荧光分析用于测定Arg-1+/F4/80+和CD206+/F4/80+细胞的表达水平。流式细胞术用于检测间质巨噬细胞（IMs）和肺泡巨噬细胞（AMs）中的CD206表达。此外，体外实验中，将RSPF应用于IL-4刺激的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs），并与肺泡上皮细胞共培养，通过流式细胞术量化M1（CD86）和M2（CD206）的极化情况。RT-qPCR、Western blot和免疫荧光技术用于检测纤维化/上皮间质转化（EMT）相关标志物（E-钙黏蛋白、Vimentin、α-平滑肌肌动蛋白[α-SMA]、纤维连接蛋白[FN]、I型胶原[Collagen I]、TGF-β1以及Smad2/3的磷酸化水平）。结果
在RSPF中鉴定出78种活性成分。体内实验显示，RSPF增加了小鼠的体重，改善了IPF中的胶原沉积和纤维化情况，上调了E-钙黏蛋白蛋白水平，并下调了Vimentin、α-SMA、FN和Collagen I等与纤维化相关的标志物表达。此外，RSPF降低了BALF中的IL-1β和TNF-α水平，并抑制了TGF-β、p-Smad2/Smad2和p-Smad3/Smad3的蛋白表达。进一步机制研究表明，RSPF下调了Arg-1+/F4/80+和CD206+/F4/80+的表达，并减少了IMs中的CD206表达。体外实验中，RSPF抑制了M2型巨噬细胞的极化（CD206、Arg1），下调了纤维化标志物（Collagen 1α1、α-SMA），并抑制了TGF-β1/Smad信号通路。结论
RSPF减轻了IPF小鼠肺组织的病理损伤和纤维化，从而延缓了IPF的进展。其抗纤维化机制涉及双重抑制TGF-β1/Smad信号通路和M2型巨噬细胞的极化。引言
特发性肺纤维化（IPF）是一种进行性、不可逆的间质性肺疾病，其特征是细胞外基质过度沉积、成纤维细胞异常激活以及免疫微环境改变（Moss等人，2022年）。肺纤维化由多种致病因素引起，包括物理损伤、药物不良反应以及病毒或细菌感染（如SARS-CoV-2），导致弥漫性肺水肿和急性呼吸衰竭。尽管最近引入的抗纤维化疗法（如吡非尼酮和尼达尼布）已被证明能够减缓肺功能下降的速度，但这些疗法既不能促进恢复，也不能阻止IPF典型的功能下降和结构改变（Richeldi等人，2017年）。因此，仍迫切需要更有效的治疗策略来阻止甚至逆转这种致命疾病的进展。
巨噬细胞在维持肺免疫稳态和协调宿主防御中起着关键作用（Anderson等人，2021年）。尽管经典的M1型和M2型极化状态不能完全涵盖巨噬细胞的复杂性，但M1型巨噬细胞通常具有抗微生物和促炎功能，而M2型巨噬细胞则与组织修复反应相关。在IPF背景下，越来越多的证据表明，尤其是表现出M2型特征的巨噬细胞通过放大促纤维化信号通路而促进纤维化（Yunna等人，2020年）。这些细胞分泌转化生长因子（TGF）和血小板衍生生长因子（PDGF）等介质，驱动成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化和细胞外基质的过度沉积。因此，IPF的进展受到肺巨噬细胞极化状态和功能重编程的强烈影响（Aitcheson等人，2021年）。
在古代中医文献中，IPF没有特定的疾病名称，常根据症状和发病机制被归类为“肺痹”“肺瘀”等病症。人参平肺方（RSPF）是一种基于《正阴脉治》的传统中药方剂，历史上在中国被用于治疗“肺痹”（Qin，2006年）。RSPF的药材包括人参（Panax ginseng）C. A. Mey、桑树（Morus alba）L.、枸杞（Lycium chinense）Mill.、麦冬（Anemarrhena asphodeloides）Bge、芦笋（Asparagus cochinchinensis）（Lour.）Merr.、柑橘（Citrus reticulata）Blanco、丹参（Salvia miltiorrhiza）Bge和甘草（Glycyrrhiza uralensis）Fisch.，主要用于治疗由气阴亏虚、痰湿积聚和气血瘀滞引起的肺纤维化。临床研究表明，将传统治疗与RSPF结合使用，可以显著改善IPF患者的临床症状和生活质量，减缓其肺功能下降，并通过调节脂质代谢发挥抗纤维化作用（Sun等人，2021年；Yan等人，2023年）。我们之前的研究显示，RSPF可以显著缓解博莱霉素（BLM）诱导的大鼠肺纤维化。这些结果为RSPF在治疗肺纤维化中的作用提供了临床和实验依据（Xu，2017年）。然而，该方剂的主要成分及其作用机制尚不清楚。
本研究旨在进一步阐明RSPF在BLM诱导的IPF模型中的潜在作用机制。通过使用肺纤维化小鼠模型和骨髓来源巨噬细胞与肺泡上皮细胞的共培养系统，我们评估了RSPF缓解肺纤维化和调节巨噬细胞极化的能力。我们的发现还提供了初步证据，表明RSPF可以调节TGF-β信号通路并影响M2型巨噬细胞的功能状态。
试剂与仪器
本研究中使用的试剂包括ECL化学发光底物试剂盒（MILLIPORE，批号：WBKLS0500）、BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Scientific?，批号：20341）、IL-1β和TNF-α的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（Dakowei Biotechnology，批号：2011-1、2312-1）、PerCP抗小鼠CD45、APC抗小鼠F4/80、CD11b BV785、Siglec F BV421、Alexa Fluor? 647抗小鼠I-A/I-E以及FITC抗小鼠CD206（BioLegend，批号：B236192、B281627、B311639、B312137、B358685、B284677、B270130）。
RSPF主要化学成分的鉴定
基峰色谱图（BPC）是通过连续显示每个时间点质谱中最强离子的强度获得的谱图。图1显示了RSPF水提取物在正离子模式和负离子模式下的BPCs。通过使用自建的二级质谱数据库和相应的碎片模式匹配方法，最终鉴定出78种化合物。主要化学成分包括
讨论
IPF是一种进行性、慢性的间质性肺疾病，由于其复杂的发病机制，其治疗仍然是一个重大的临床挑战（Richeldi等人，2017年）。作为一种破坏性的间质性肺疾病，IPF的特点是细胞损伤、组织重塑和最终的肺纤维化（Spagnolo等人，2021年）。在IPF过程中，活化的成纤维细胞分泌的纤维化介质以正反馈的方式持续作用于其他成纤维细胞，导致细胞外基质的沉积
结论
总之，体内实验表明，RSPF抑制了IMs中的CD206表达，这表明骨髓来源的巨噬细胞在肺组织修复和纤维化进展中起着关键作用。RSPF可能通过抑制TGF-β/Smad信号通路来调节M2型巨噬细胞，从而减少细胞外基质的沉积和上皮-间质转化，从而对BLM诱导的肺纤维化发挥治疗效果。体外实验进一步表明，RSPF还抑制了
CRediT作者贡献声明
洪玲玲：撰写——初稿、研究、数据分析、概念化。孙宇波：撰写——初稿、方法学设计、研究、数据分析。侯海慧：资源获取、研究、数据分析。张静静：撰写——初稿、验证。史伟伟：撰写——初稿、方法学设计、数据分析。杨瑶静：方法学设计、数据分析。范新生：撰写——审稿与编辑、监督、资源获取、资金申请
资助
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：82174258）、江苏省中医药资源产业化协同创新中心的关键项目（项目编号：ZDXM-2020-22）以及NATCM的高水平中医药学科建设项目（GSPZDXK）的支持。此外，还得到了南通中医药联盟项目（项目编号：TZYK202310）的部分资助。利益冲突声明
作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
