《Cell Proliferation》：ITGA5 as a Dual Regulator of Epithelial-Mesenchymal Transition and Epithelial Cell Anoikis Resistance: Functional Validation and Drug Prediction
编辑推荐：
本文报道了整合素α5（ITGA5）在哮喘患者中显著上调，并通过激活PI3K/Akt通路，同时驱动气道上皮细胞发生上皮-间质转化（EMT）和获得失巢凋亡抵抗，共同促进气道重塑。研究进一步通过分子对接和药效学实验，发现白藜芦醇（Res）和M200是潜在的ITGA5抑制剂，可有效逆转上述病理过程。该工作为阐明哮喘气道重塑的机制提供了新见解，并提出了针对ITGA5靶点干预的潜在治疗新策略。
3 Results
3.1 ITGA5 Was Upregulated in Airway Epithelial Cells of Asthma Patients and TGF-β1-Induced EMT Models
对公共数据库的分析揭示，在哮喘患者的气道刮取物、痰细胞及支气管刷样本中，整合素α5（ITGA5）的表达均显著上调。在重度哮喘患者中，其表达水平高于轻中度患者，且与较差的肺功能指标（如ΔFEV1、FEV1%预测值、FVC%预测值、FEV1/FVC%预测值）呈负相关。在转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导的体外支气管上皮细胞上皮-间质转化（EMT）模型中，ITGA5的表达同样升高，且与间质标志物（纤连蛋白Fibronectin、N-钙黏蛋白N-cadherin、波形蛋白Vimentin）水平呈正相关，与上皮标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）呈负相关。这些数据表明，ITGA5在哮喘气道重塑中表达增高，并与疾病严重程度及EMT进程密切相关。
3.2 TGF-β1 Induced EMT Phenotype in Bronchial Epithelial Cells
用TGF-β1（10 ng/mL）刺激人支气管上皮细胞（HBE135-E6E7）成功建立了EMT模型。刺激48小时后，上皮标志物E-钙黏蛋白、紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达显著下调，而间质标志物纤连蛋白、N-钙黏蛋白和波形蛋白的表达显著上调。同时，ITGA5的蛋白和荧光表达强度在TGF-β1诱导后也显著增加。对ITGA5的蛋白质相互作用网络预测显示，它与纤连蛋白等EMT调控蛋白有强关联，并富集于包括“负调控失巢凋亡”在内的多个生物学通路。
3.3 Proteomic Profiling Identified DEPs Enriched in the Negative Regulation of Anoikis
采用基于数据非依赖性采集（DIA）的定量蛋白质组学技术，在TGF-β1诱导的EMT细胞模型中鉴定出大量差异表达蛋白（DEPs）。基因本体（GO）富集分析显示，上调的DEPs显著富集于“上皮-间质转化”、“负调控失巢凋亡”等生物过程以及“整合素α5β1复合体”等细胞组分。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析表明，上调的DEPs在“PI3K/Akt信号通路”中富集显著。进一步的失巢凋亡实验证实，TGF-β1诱导的支气管上皮细胞确实表现出失巢凋亡抵抗，表现为钙黄绿素-AM（活细胞）/碘化丙啶（PI，死细胞）荧光强度比值的降低。同时，失巢凋亡抵抗标志物TrkB的蛋白水平和荧光强度在模型组中显著升高。
3.4 ITGA5 Might Serve as a Potential Predictive Marker for Anoikis Resistance in the TGF-β1-Induced EMT Model
将差异表达蛋白与已知的失巢凋亡抵抗相关基因（ARRGs）取交集，得到45个重叠靶点。共表达网络分析显示这些ARRGs间存在强相互作用，且ITGA5与大多数ARRGs的表达呈显著正相关。这些ARRGs均在正常人气道上皮中有表达。贝叶斯网络通路推理分析显示，ITGA5富集在PI3K/Akt信号通路内，且纤连蛋白可能是其上游调节因子。根据ITGA5表达中位数将样本分为高、低表达组，差异分析显示ITGA5高表达组在“正调控上皮-间质转化”、“负调控失巢凋亡”、“PI3K/Akt信号通路”等条目上显著富集。这些结果提示ITGA5在EMT和失巢凋亡抵抗中扮演关键角色，其作用可能与PI3K/Akt通路相关。
3.5 Interactions and Co-Localised Expression Among ITGA5, PI3K and TrkB
通过计算模拟，预测了ITGA5与PI3K、ITGA5与TrkB之间存在广泛的相互作用界面和稳定的结合能。表面等离子共振（SPR）实验进一步证实了ITGA5与PI3K之间存在直接、稳定的相互作用（KD= 7.43e-07 M）。免疫荧光共定位分析显示，在TGF-β1诱导的支气管上皮细胞中，ITGA5、PI3K和TrkB的荧光强度均显著增强，并且三者之间呈现明显的空间共定位信号，为它们的功能性相互作用提供了直观的细胞学证据。
3.6 Resveratrol and M200 Were Identified as Candidate Compounds for Targeted Intervention of ITGA5
通过比较毒物基因组学数据库（CTD）的药物预测，发现天然化合物白藜芦醇（Res）是排名靠前的潜在ITGA5抑制剂。分子对接显示Res与ITGA5具有良好的结合亲和力（最佳结合能为-7.5 kcal/mol），主要通过氢键、Pi-Pi堆积等相互作用结合在ITGA5的PHE-62和PHE-209等位点。分子动力学模拟（MD）表明Res-ITGA5复合物结构稳定。此外，人源化单克隆抗体M200被证实可通过特异性阻断α5β1整合素与纤连蛋白的结合来抑制ITGA5功能。二者被确定为靶向干预ITGA5的候选化合物。
3.7 Sh-ITGA5 Inhibited the TGF-β1-Induced EMT Phenotype, Attenuated Activation of the PI3K/Akt Signalling Pathway and Alleviated Anoikis Resistance in Bronchial Epithelial Cells
为验证ITGA5的功能，研究构建了稳定敲低ITGA5的支气管上皮细胞系。结果显示，ITGA5敲低可显著逆转TGF-β1诱导的EMT表型：下调纤连蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白的表达，同时上调E-钙黏蛋白、ZO-1、Occludin的表达。同时，ITGA5敲低有效抑制了TGF-β1引起的PI3K和Akt磷酸化水平升高，即阻断了PI3K/Akt信号通路的激活。此外，ITGA5敲低还下调了抗凋亡蛋白XIAP、MCL-1及TrkB的表达，上调了凋亡启动子（Caspase-9、Cleaved-caspase-9）和执行子（Caspase-3、Cleaved-caspase-3）的水平，并恢复了细胞对失巢凋亡的敏感性。免疫荧光显示ITGA5敲低减弱了其与PI3K、TrkB的共定位信号。这些结果证明ITGA5是驱动EMT、激活PI3K/Akt通路并诱导失巢凋亡抵抗的关键因子。
3.8 Res and M200 Pharmacologically Inhibited ITGA5, Improved EMT and Reduced PI3K/Akt Signalling Pathway Activation and Anoikis Resistance in Bronchial Epithelium Cells
细胞毒性实验确定了Res（0.25和0.5 μM）和M200（40 nM）的非毒性工作浓度。药效学实验表明，Res和M200处理可显著降低TGF-β1诱导的支气管上皮细胞中ITGA5的蛋白水平。同时，二者能有效逆转EMT表型：抑制间质标志物表达，促进上皮标志物表达。此外，Res和M200处理也抑制了PI3K和Akt的磷酸化，下调了XIAP、MCL-1和TrkB，促进了Caspase-9/3及其剪切体的表达，并增强了细胞在悬浮状态下的失巢凋亡。免疫荧光分析进一步证实，Res和M200降低了ITGA5、PI3K和TrkB的荧光强度及它们之间的共定位信号。
3.9 Res and M200 Inhibited ITGA5 Expression, PI3K/Akt Pathway Activation, and Anoikis Resistance to Alleviated EMT in Asthma Mice
在屋尘螨（HDM）致敏的哮喘小鼠模型中，肺组织内ITGA5表达显著升高，并伴有PI3K/Akt通路激活以及XIAP、MCL-1等抗凋亡蛋白的上调。Res和M200干预可剂量依赖性地抑制这些变化。免疫组织化学和免疫荧光结果显示，哮喘小鼠气道上皮中ITGA5和TrkB表达增强，且ITGA5、PI3K、TrkB与气道上皮标志物EpCAM存在共定位，而Res和M200处理能有效抑制它们的表达与共定位。Western blot分析证实，Res和M200能抑制哮喘小鼠肺组织中间质标志物的表达，恢复上皮标志物的表达，从而在体内逆转EMT。
3.10 Res and M200 Alleviated Airway Pathological Structural Changes and Improved Lung Function in HDM-Sensitised Asthma Mice
组织病理学染色显示，Res和M200能显著减轻哮喘小鼠气道周围的炎症细胞浸润、上皮细胞排列紊乱与增生、基底膜增厚、黏液过度分泌以及胶原沉积。肺功能检测表明，Res和M200处理降低了哮喘小鼠的气道阻力，恢复了肺动态顺应性。此外，二者还降低了支气管肺泡灌洗液（BALF）中的总炎症细胞计数，以及总IgE和Th2型细胞因子（IL-4、IL-5、IL-13）的水平。这些结果综合表明，靶向抑制ITGA5能有效改善哮喘的气道炎症、重塑和功能障碍。
4 Discussion
本研究发现并验证了ITGA5在哮喘气道上皮EMT和失巢凋亡抵抗中的双重调控作用。ITGA5在哮喘患者及模型中表达上调，与疾病严重程度和肺功能下降相关。机制上，ITGA5可能通过直接与PI3K相互作用，激活PI3K/Akt促生存信号通路，从而协同驱动EMT进程并赋予细胞失巢凋亡抵抗能力。失巢凋亡抵抗使得发生EMT的细胞在脱离基质后仍能存活，可能促进了气道重塑的慢性和进展性特征。这为理解哮喘气道重塑提供了新的视角。研究首次将失巢凋亡抵抗的概念引入非肿瘤性的哮喘气道疾病模型。
针对这一新靶点，研究通过计算预测和实验验证，发现天然小分子化合物白藜芦醇（Res）和单克隆抗体M200是潜在的ITGA5抑制剂。二者在体外和体内模型中均能有效抑制ITGA5，进而阻断PI3K/Akt通路、逆转EMT表型、恢复失巢凋亡敏感性，最终减轻哮喘小鼠的气道炎症和重塑。Res作为多酚化合物，具有来源广泛、成本相对较低的潜力；M200作为人源化抗体，则提供了高特异性的靶向干预策略。这为开发针对哮喘气道重塑的新疗法提供了有前景的候选药物和作用靶点。
当然，本研究也存在一定局限，如ITGA5与哮喘气道重塑的因果关系仍需大规模临床研究验证；HDM小鼠模型虽能模拟部分特征，但更接近人体免疫系统的人源化小鼠模型可能提供更临床相关的见解；EMT与失巢凋亡抵抗在哮喘进展中的精确互作机制也有待深入挖掘。
5 Conclusions
综上所述，本研究首次明确了ITGA5在哮喘气道上皮EMT中的关键调控作用，并阐明了其通过PI3K/Akt通路同时影响EMT和失巢凋亡抵抗的潜在机制。更重要的是，研究预测并验证了白藜芦醇和M200通过药理学抑制ITGA5来缓解EMT和失巢凋亡抵抗的潜力。这些发现为理解哮喘EMT的病理生理学提供了新见解，确立了ITGA5作为潜在预测生物标志物和治疗靶点的重要性，并为开发旨在减轻哮喘气道重塑的新疗法提供了有希望的新策略。
