一种基于粘菌素与五水硫酸铜反应的牛奶样品中粘菌素测定新电化学方法

《Microchemical Journal》：A novel electrochemical approach for colistin determination in milk samples based on its reaction with copper sulfate pentahydrate

　　Mridupavan Dutta|Panchanan Puzari印度阿萨姆邦特兹普尔，特兹普尔大学化学科学系，邮编784028摘要本研究提出了一种电化学方法，通过检测多粘菌素硫酸盐与五水合硫酸铜的反应，并结合差分脉冲伏安法进行灵敏检测。FTIR、UV–vis、PXRD及电化学研究均表明，多粘菌素与铜之间形成了化学键，从而产生了电活性物质。研究提出了合理的反应机制，该方法已成功用于实际牛奶样本中多粘菌素硫酸盐的检测。该方法的检测限为0.77?μM，灵敏度为0.077?μA/μM，在30-300?μM的线性范围内相关系数R2高达0.99，非常适合用于牛奶中多粘菌素硫酸盐的检测。通过干扰试验评估了酪蛋白、乳糖、葡萄糖、胆固醇、抗坏血酸及白蛋白的干扰作用，结果均处于可接受范围。这些牛奶成分的干扰程度在2.73%至11.37%之间，其中酪蛋白的干扰程度仅次于乳糖。鉴于该方法具有稳定性强、选择性高、灵敏度好以及检测限低等优点，有望成为现场检测牛奶质量的有效工具。1. 引言抗生素多粘菌素（又称多粘菌素E）由环状七肽核心和由三个氨基酸组成的线性侧链构成，其N端由脂肪酸酰化[1]。它是一种复杂的混合物，至少包含13种不同成分，主要成分是多粘菌素A（多粘菌素E1）和多粘菌素B（多粘菌素E2），二者仅侧链脂肪酸的结构不同。在临床应用中，多粘菌素有两种制剂：多粘菌素硫酸盐和多粘菌素甲磺酸盐，后者也是一种带负电荷的钠盐衍生物。在兽医领域，这种抗生素的硫酸盐常被用作药物或饲料添加剂，用于治疗由革兰氏阴性菌引起的各种感染疾病。尤其是用于治疗肠道感染的多粘菌素，通常以液体或固体药物预混剂的形式添加到动物饲料中，而非以标准剂量给予[2]。与大多数治疗药物一样，多粘菌素硫酸盐也可能带来肾毒性和神经毒性等不良反应[3]。由于广泛使用多粘菌素，尤其是通过质粒介导和可转移的mcr基因，导致耐多粘菌素菌株的出现速度加快，这类基因已在从人类和养殖动物中分离出的肠杆菌科菌株中被发现。首个多粘菌素耐药性移动机制MCR-1于2015年在中国被发现。此后两年内，该基因已在30多个国家或地区被发现[4]、[5]、[6]、[7]、[8]。此外，一项回顾性研究表明，MCR-1最早出现于20世纪80年代中期，这表明在动物饲料中使用多粘菌素可能引发了MCR-1在人类和动物中的传播[9]。鉴于这一严峻形势，中国农业部宣布，自2017年4月30日起，不得再将多粘菌素硫酸盐作为促进生长的饲料添加剂[1]。与此同时，2016年6月，欧洲药品管理局修订了其在欧洲使用多粘菌素的建议[9]。在印度，卫生和家庭福利部于2019年发布指令，禁止生产、销售和分发用于食品生产动物、水产养殖、家禽及动物饲料添加剂的多粘菌素及其制剂[10]、[11]、[12]。因此，为保障食品安全和公共健康，有必要持续监测畜牧业中多粘菌素的使用情况。为控制多粘菌素的使用，世界各国卫生当局都在动物组织、蛋类和牛奶中设置了相应的最大残留限量[4]。由于多粘菌素被视为最后手段的抗生素，加之抗生素耐药性问题日益严重，对其检测显得尤为重要。目前有多种技术可用于不同基质中多粘菌素的检测。传统的多粘菌素检测方法主要包括各类色谱技术及联用技术，如高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法[4]、[13]、HPLC-荧光检测器法[2]、[14]、[15]、[16]，以及一些基于酶的方法，如酶联免疫吸附试验法[17]、[18]等。不过，色谱法的缺点是需要技术熟练的操作人员，且样品前处理较为复杂，包括固相萃取和蛋白质沉淀等步骤[2]、[5]、[13]、[14]、[15]、[16]。而酶法如ELISA的缺点则是成本较高。上述大多数方法仅适用于实验室环境，无法快速批量筛查样品[17]、[18]、[19]。由于传统方法的这些局限，开发更先进的技术，如生物传感器和电化学免疫传感器，在多粘菌素检测领域变得越来越重要，因为这类技术成本更低、灵敏度和准确性更高，所需样品量少，且能检测多种分析物[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]。目前关于多粘菌素电化学检测的研究较少，且大多基于多粘菌素与抗多粘菌素的相互作用[19]、[25]。在本研究中，我们开发了一种非酶类电化学方法用于多粘菌素检测，该方法由于使用了廉价且易获得的试剂（如硫酸铜和缓冲盐），且无需昂贵的酶或抗体等生物识别元件，因此具有较高的灵敏度、良好的长期稳定性以及成本优势。由于多粘菌素本身电化学性质不活泼，我们的首要任务是将其化学转化为电化学活性物质。已有大量研究表明，金属-配体协同作用可通过促进电子转移并产生清晰的氧化还原信号来提升电化学活性。在此研究中，我们通过让多粘菌素与硫酸铜盐发生反应实现了这一目标[26]、[27]、[28]。尽管Stokowa-So?tys等人于2015年报道了Cu2+-多粘菌素复合物的生成，但他们并未研究该复合物的电化学行为[26]。因此，我们研究了该复合物的电化学行为，发现所形成的Cu2+-多粘菌素复合物具有电化学活性，且反应的电化学响应与多粘菌素浓度之间存在定量关系。基于此，我们开发了一种多粘菌素电化学传感方法，并证明了其在牛奶样本中多粘菌素定量检测中的应用价值。该方法利用铂电极即可实现简单且经济的多粘菌素电化学测定。2. 实验2.1. 化学品、试剂和仪器多粘菌素硫酸盐（CAS编号1264-72-8）、纯度高的二钾氢磷酸盐（CAS编号7758-11-4）、超纯胆固醇AR（CAS编号57-88-5）、脱脂超纯酪蛋白（脂肪含量0.2%，CAS编号9000-71-9），均由SRL公司提供；磷酸二氢钾（CAS编号7778-77-0）由RANKEM公司提供；葡萄糖（CAS编号50-99-7）、氯化钾（CAS编号7447-4-7）均来自Merck公司；五水合硫酸铜（CAS编号7758-99-8）、白蛋白（CAS编号9048-46-8）、乳糖（CAS编号63-42-3）、抗坏血酸（CAS编号50-81-7）则来自sigma Aldrich公司。电化学分析采用Biologic SP-300-EC-Lab软件系统完成。傅里叶变换红外光谱分析使用Perkin Elmer Frontier MIR-FIR仪器，UV–Vis光谱分析则采用Shimadzu UV-2600I仪器，HPLC分析则使用Waters公司的仪器系统，该系统配备了紫外-可见检测器（2489）、折射率检测器（2414）以及HPLC泵（515）。X射线衍射分析则使用Bruker AXS D8 Focus衍射仪，表面形貌观察则借助JEOL JSM-6390LV扫描电子显微镜完成。2.2. 溶液制备多粘菌素硫酸盐溶液是在0.1?M磷酸盐缓冲液中制备的，该缓冲液是通过将适当量的二钾氢磷酸盐和磷酸二氢钾溶解在0.1?M KCl溶液中制得的。此外，还在0.1?M磷酸盐缓冲液中制备了100?mM的五水合硫酸铜溶液。将五水合硫酸铜溶液和多粘菌素硫酸盐溶液视为空白溶液，按10:1的比例混合后得到测试溶液。2.3. 电化学和光谱分析方法为了研究五水合硫酸铜与多粘菌素硫酸盐在磷酸盐缓冲液中的反应机制，采用了差分脉冲伏安法和循环伏安法。同时，还利用FTIR和UV–Vis光谱分析为反应机制提供进一步证据。差分脉冲伏安法主要用于参数优化、确定多粘菌素硫酸盐的检测限、干扰试验以及实际样本（牛奶）的分析。在所有电化学分析中，经过充分打磨的裸铂电极作为工作电极，Ag/AgCl/KCl（3.5?M）电极作为参比电极，铂丝则作为对电极。差分脉冲伏安法测量时的电位范围为?1.0?V至1.0?V，脉冲高度为2.5?mV，脉冲宽度为100?ms，阶跃高度为5.0?mV，阶跃时间为500?ms。为研究电化学行为和反应机制，循环伏安法测量时的电位范围也为?1.0?V至1.0?V，而脉冲电位谱的测量频率范围则为1?MHz至100 mHz。FTIR光谱的采集波数范围为4000至400?cm?1，UV–Vis光谱的记录波长范围则为200至800?nm。2.4. 反应参数优化在确定检测限、干扰效应及实际样品分析之前，首先对反应条件进行了优化，包括pH值和反应时间。pH值优化是通过测定一系列含有固定浓度多粘菌素硫酸盐但缓冲液pH值不同的测试溶液的差分脉冲伏安响应来进行的。通过分析平均峰电流与其对应缓冲液pH值之间的关系，确定了最佳pH值。反应时间优化则是在使用前述最佳pH值下，配制固定浓度多粘菌素硫酸盐的测试溶液，然后在不同反应时间下进行差分脉冲伏安测量，反应时间范围为0至1200?s。通过将峰电流值与反应时间作图，找到响应最大的点，从而确定最佳反应时间。每种情况下均进行了三次重复测量。2.5. 干扰作用研究了包括酪蛋白、乳糖、葡萄糖、胆固醇、抗坏血酸及白蛋白在内的各种牛奶成分可能带来的干扰作用。在最佳反应时间下，对添加了不同浓度上述干扰物质的测试溶液进行了差分脉冲伏安测量。干扰百分比是通过公式(1)计算得出的。(1)干扰百分比=初始峰电流?最终峰电流/初始峰电流×100%2.6. 实际样品分析以牛奶为目标样本进行了实际样品分析。在最佳反应时间下，对添加了不同浓度多粘菌素的1?mL牛奶样本进行了差分脉冲伏安测量。根据稀释因子以及回收率，从平均氧化峰电流值出发，确定了原始牛奶中的多粘菌素浓度。同时，还采用了基于HPLC的方法对检测结果进行了验证。3. 结果与讨论3.1. 电化学行为通过比较相同pH条件下空白溶液和测试溶液的差分脉冲伏安图及循环伏安图，分析了其电化学行为。如图1所示，五水合硫酸铜的差分脉冲伏安图（曲线a）出现了两个明显的氧化峰，分别标记为X（0.012?V）和Y（0.227?V），而多粘菌素硫酸盐的差分脉冲伏安图（曲线b）则未检测到明显的氧化还原峰。在测试溶液的差分脉冲伏安图（曲线c）中，峰X的强度显著减弱，同时出现了一个新的氧化峰，标记为P（0.504?V）。这一趋势在循环伏安图记录中也有体现，见补充材料SF.1(A)。下载：下载高分辨率图像（244KB）下载：下载完整尺寸图像图1. 不同溶液的差分脉冲伏安图：(a)五水合硫酸铜溶液，(b)多粘菌素硫酸盐溶液，(c)测试溶液（五水合硫酸铜溶液与多粘菌素硫酸盐溶液的混合液）。脉冲电位谱的测量结果进一步证实了这些观察结果。如补充图SF.1(B)所示，多粘菌素硫酸盐的电荷转移电阻值非常高，为6320.80?Ω，这表明它具有电化学惰性以及表面阻隔作用[29]。相比之下，五水合硫酸铜溶液的电荷转移电阻值要低得多，仅为130.25?Ω，这说明自由扩散的Cu2+离子能够高效地发生电子转移。值得注意的是，测试溶液的Rct值处于中间水平（293.33 Ω），这表明形成了具有电化学活性的Cu–多粘菌素复合物，该复合物能够促进电荷转移。但由于配体配位效应，其电阻略高于游离的Cu2+。3.2 pH值优化通过DPV技术，在pH 5.0至7.5的范围内分析了pH值对氧化峰P的影响，具体结果见补充材料SF.2。选择这一pH范围是因为牛奶的典型pH值在6.5到6.7之间[30]、[31]。在磷酸盐缓冲液中检测铜-多粘菌素反应混合物时，氧化峰的高度受铜的形态、磷酸根离子的相互作用以及多粘菌素的配位能力共同影响。在较低pH值（5.0–6.0）下，多粘菌素中的胺基保持质子化状态（NH?+），从而限制了其与Cu2+结合的能力，导致复合物形成较弱，氧化峰高度也相应降低。在中等pH值（6.5–7.0）下，多粘菌素胺基的部分去质子化（变为NH?）增强了与铜的结合能力，同时游离Cu2+的存在也有利于形成最佳复合物，从而使氧化峰高度达到最大。在较高pH值（7.5）下，磷酸根离子（HPO?2?、PO?3?）和氢氧根离子会与多粘菌素竞争结合Cu2+，进而形成铜-磷酸盐或铜-氢氧化物物质。这种竞争降低了铜-多粘菌素复合物的浓度，从而使氧化峰高度下降。因此，氧化峰高度的顺序为：pH 6.5 > pH 7.0 > pH 6.0 > pH 7.5 > pH 5.5 > pH 5.0（见SF.2(b)），这一现象反映了复合物形成效率及铜形态随pH变化的规律[32]、[33]、[34]。如SF.2(b)所示，pH 6.5时氧化峰电流的变化幅度最大，说明该pH值最适合用于多粘菌素的定量检测。3.3 反应时间优化在缓冲液pH值为6.5且多粘菌素硫酸盐浓度固定的条件下，通过测试溶液对反应时间进行了优化。只有存在多粘菌素硫酸盐时才会出现的氧化峰“P”被用来确定最佳反应时间。如图SF.3所示，当反应时间为120秒时，DPV峰电流达到最大值，此后随着时间延长，氧化峰电流逐渐下降。这说明电活性强的多粘菌素-Cu2+复合物浓度正在逐步降低。最初混合时，多粘菌素中的胺基会迅速与Cu2+离子结合，形成具有高氧化峰的电活性复合物。但随着时间推移，多种因素会导致峰电流下降。首先，复合物形成的平衡逐渐发生偏移，导致复合物部分解离，溶液中电活性物质的数量减少。其次，复合物可能发生结构重排或聚集，从而降低其电化学活性，甚至可能引发沉淀，进一步减少可用于氧化的反应物浓度。此外，缓冲液中的磷酸根离子也会逐渐与多粘菌素竞争结合Cu2+，形成不会产生氧化峰的铜-磷酸盐物质。另一个潜在因素是多粘菌素-Cu2+复合物可能逐渐吸附在电极表面，导致电极钝化，减少电子传递的可利用表面积，进而降低氧化峰强度。综合来看，这些因素表明该复合物的电化学行为受时间影响，同时还受到竞争反应、复合物稳定性以及溶液相中各种相互作用的影响，因此该反应的最佳时间为120秒。3.4 动力学行为研究在恒定pH值和固定浓度的CLS条件下，通过改变扫描速率从10 mV/s到450 mV/s，记录了测试溶液的循环伏安图。伏安图显示，在CLS存在时，氧化峰P和还原峰Q是最显著的特征峰（见图2(A)）。（详见图3。）下载：下载高分辨率图像（329KB）下载：下载全尺寸图像图2. (A) 在相同pH值和固定浓度的CLS条件下，不同扫描速率下获得的循环伏安图，扫描速率分别为a) 10 mV/s，b) 25 mV/s，c) 50 mV/s，d) 100 mV/s，e) 150 mV/s，f) 200 mV/s，g) 250 mV/s，h) 300 mV/s，i) 350 mV/s，j) 400 mV/s，k) 450 mV/s；(B) 阳极峰电流（iaP）与阴极峰电流（icQ）随扫描速率平方根变化的曲线。下载：下载高分辨率图像（439KB）下载：下载全尺寸图像图3. (A) 在优化后的缓冲液pH值（6.5）下，不同浓度多粘菌素硫酸盐的测试溶液所对应的差分脉冲伏安图，浓度分别为(a) 0，(b) 30 μM，(c) 60 μM，(d) 100 μM，(e) 150 μM，(f) 200 μM，(g) 250 μM，(h) 300 μM，(i) 350 μM，(j) 400 μM；(B) 以多粘菌素硫酸盐浓度的平均值（n=3）为横坐标，氧化峰电流的平均值为纵坐标所绘制的校准曲线。为了研究反应动力学，将对应于峰P的阳极电流（Ia(P)）和对应于峰Q的阴极电流（Ic(Q)）分别与扫描速率的平方根（ν1/2）作图（见图2(B)）。如图2(B)所示，阳极峰电流和阴极峰电流都与扫描速率的平方根呈线性关系，相关系数非常高（R2=0.98）。这些结果表明该反应主要受扩散控制。3.5 检出限的测定在保持最佳pH值的前提下，针对不同浓度多粘菌素的测试溶液进行了DPV测量，并据此绘制了校准曲线，以氧化峰电流的平均值作为纵坐标，多粘菌素浓度作为横坐标。此外，还对空白溶液进行了DPV测量，以确定在没有分析物时的平均电流和标准偏差。多粘菌素的浓度是通过校准曲线确定的，而系统的检出限（LOD）则是根据公式（1）计算得出的：(2) LOD=3Sb/m，其中“Sb”表示空白溶液的标准偏差，“m”则表示校准曲线所得的斜率，或者更确切地说，就是电化学传感器的灵敏度。图3(A)展示了在相同缓冲液pH值但多粘菌素硫酸盐浓度不同的溶液所对应的差分脉冲伏安图，浓度范围为30至400 μM。用于计算系统检出限的氧化峰标记为“P”。图3(B)显示了以多粘菌素浓度为横坐标、氧化峰电流平均值为纵坐标的校准曲线。可以看出，在较高浓度（超过300 μM）时，该曲线不再呈线性。这可能是因为当浓度达到300 μM后系统已达到饱和状态，多余的未反应多粘菌素硫酸盐会堵塞电极表面，使得氧化过程效率降低。不过在30至300 μM的范围内，曲线呈线性，R2值非常高，为0.99。该直线的斜率为0.077，代表电化学传感器的灵敏度，截距为8.02。空白溶液的标准偏差为0.02，据此计算得出，300 μM以下浓度的检出限为0.77 μM。因此，该曲线线性部分的方程为y=0.077x+8.02。这表明所提出的方法能够有效检测牛奶中与该物质检测相关的浓度范围内的多粘菌素硫酸盐。表1总结了该方法与其他已报道的牛奶中多粘菌素检测方法的R2值和检出限的对比情况。在表1中，所有检出限值都是根据牛奶密度1.0220 g/cm3[49]以及多粘菌素硫酸盐的摩尔质量2801.27 g/mol换算成微摩尔浓度数值的。（详见表2。）表1. 本方法与其他牛奶多粘菌素检测方法的性能比较。序号 方法 R2值 线性范围 检出限 参考文献1 超高效液相色谱-串联质谱法（UHPLC-MS/MS） 0.99 45–50 μg/kg ≈ 1.83–18.31 μM 2 μg/kg ≈ 0.730 μM [4]2 高性能液相色谱结合荧光检测法（HPLC-FLD） 0.99 510–500 μg/L ≈ 3.57–178.5 μM 10 μg/L ≈ 3.57 μM [14]3 间接竞争酶联免疫吸附测定法（ELISA） 1.0–80 ng/mL ≈ 0.357–28.56 μM 0.4 ng/mL ≈ 0.143 μM [17]4 液相色谱法（LC）结合酶联免疫吸附测定法（ELISA） LC法的检出限为9.16–366.2 μM，对应浓度为9.3 μg/kg ≈ 3.39 μM；ELISA法的检出限为10.9 μg/kg ≈ 3.97 μM [18]5 使用裸铂电极的差分脉冲伏安法 0.99 0330–300 μM 0.77 μM 本研究表2. 不同浓度干扰成分存在时对牛奶中多粘菌素信号的干扰百分比。溶液 添加到多粘菌素硫酸盐溶液中的成分浓度（mM） P峰的平均氧化电流（μA） 相对标准偏差（%） 干扰百分比（%）测试溶液（TS） 0 30.44 ± 0.06 120.21% – TS + 凝乳蛋白 11.9 27.91 ± 0.35 61.53% 8.31% 13.9 27.40 ± 0.31 261.37% 9.99% 15.9 26.98 ± 0.46 602.25% 11.37% TS + 乳糖 128 29.09 ± 0.04 040.19% 4.44% 137 28.69 ± 0.32 511.58% 5.75% 147 28.06 ± 0.21 231.07% 7.82% TS + 白蛋白 0.002 29.61 ± 0.035 10.13% 2.73% 0.004 29.59 ± 0.13 450.48% 2.79% 0.006 29.56 ± 0.05 030.18% 2.89% TS + 胆固醇 0.25 929.05 ± 0.097 20.39% 4.57% 0.388 28.98 ± 0.075 80.30% 4.80% 0.517 28.93 ± 0.41 201.66% 4.96% TS + 抗坏血酸 0.11 029.37 ± 0.041 80.16% 3.52% 0.112 29.29 ± 0.045 10.18% 3.78% 0.124 29.25 ± 0.10 060.39% 3.91%3.6 干扰研究为了研究干扰因素，我们检测了原始牛奶中的主要成分，包括乳糖、凝乳蛋白、抗坏血酸、胆固醇和白蛋白，以此评估它们对氧化峰“P”的DPV电流测量的影响（见SF.4）。为评估乳糖的干扰作用，我们测试了4.5至5.2 g/100 g（约128 mM至147 mM）三种不同浓度，这一浓度范围对应牛奶中天然存在的乳糖含量。对于凝乳蛋白、胆固醇、白蛋白和抗坏血酸，我们也分别测试了三种浓度，以评估它们的干扰程度。牛奶中凝乳蛋白的含量约为2.8 g/100 g（约13.9 mM），胆固醇的含量在10–20 mg/100 mL之间（约0.259 mM至0.517 mM），白蛋白的含量约为0.3 g/L（约0.0451 mM）[50]，而抗坏血酸的平均含量为19.7 mg/L（约0.112 mM）[51]。我们对这些牛奶成分的干扰百分比进行分析后发现，干扰范围在2.73%到11.37%之间。在所有成分中，乳糖之后的干扰程度最高。尽管乳糖的浓度高于凝乳蛋白，但后者对干扰的贡献更为显著。这可能是因为凝乳蛋白含有多种功能基团，包括胺基（–NH?）、羧基（–COO?）和磷酸基（–PO?3?），这些基团可能与Cu2+离子有很强的亲和力，从而使凝乳蛋白能够有效地与多粘菌素竞争结合Cu2+。相比之下，乳糖作为一种二糖，仅含有羟基（–OH）基团，其金属结合能力较弱。此外，凝乳蛋白还可能吸附在电极表面，形成一层阻隔层，阻碍电子传递，从而降低氧化信号，而乳糖体积较小且不具备吸附性，不会明显导致电极污染。尽管存在凝乳蛋白和乳糖的干扰，但由于牛奶样品中的蛋白质成分可以通过乙腈处理及后续处理有效去除，如3.7节所述，因此这些干扰不会影响实际样品的分析。3.7. 牛奶样品分析及方法验证我们从阿萨姆邦索尼特普尔省纳帕姆附近的泰兹普尔大学附近的一家奶牛场采集了用于分析的牛奶样品。牛奶样品的提取方法是参照穆罕默德等人描述的方法，并稍作修改而进行的[52]。首先，向所有样品中加入多粘菌素硫酸盐，然后使用磁力搅拌器搅拌2分钟。接着在持续搅拌的情况下逐滴加入乙腈，以促进脱蛋白过程。得到的浑浊混合物在6000 rpm下离心10分钟，之后分离上清液，并在55°C下加热蒸发，直至体积降至1毫升。最终得到的提取样品用pH为6.5的磷酸盐缓冲液稀释，再通过0.2 μm的Whatman滤纸过滤后进行检测。根据获得的氧化峰电流平均值，并考虑稀释因子，即可确定原始牛奶中多粘菌素的含量（见SF.5）。此外，还计算了回收率，其范围在95.57%至97.14%之间（见补充材料ST2）。此外，还使用标准的HPLC–UV分析技术对该方法进行了验证，以确认其可靠性和准确性。（详见补充材料5.1节。）3.8 信号重复性通过在完全相同的实验条件下对测试溶液进行四次独立的DPV测量，评估了所提出的电化学方法的重复性。实验结果显示，氧化峰电流的变化非常小，相对标准偏差仅为1.34%，表明该方法的重复性良好（见SF.7）。这说明所开发的电化学传感方法在相同的实验条件下能够给出稳定可靠的检测结果。3.9 FTIR光谱分析通过FTIR分析，我们可以更深入地了解可能的反应机制。CuSO?·5H?O的FTIR光谱（见补充材料SF.8(a)）在大约3454 cm?1、1631 cm?1和1112 cm?1处有特征峰。3454 cm?1处的峰对应于晶体结构中的结晶水，而波长较低的峰则源于氧原子与非金属原子之间的振动相互作用[35]。在SF.8(b)中，对多粘菌素硫酸盐溶液的IR光谱进行了分析，发现其在大约3460 cm?1、1638 cm?1和1103 cm?1处有峰。这些峰分别对应于多粘菌素中的伯胺和仲胺以及肽键的NH伸缩振动、酰胺I（C=O）伸缩振动以及CN伸缩振动[36]、[37]。SF.8(c)展示了反应混合物的IR光谱，可以看到NH伸缩振动出现宽化并且波长向低频方向移动，这说明多粘菌素中的胺基已经与铜离子发生了配位。此外，在1534 cm?1处出现了一个新的显著峰，这一峰是由于铜离子的配位导致酰胺II吸收带发生位移而产生的[38]。这种光谱位移表明铜与多粘菌素的胺基发生了相互作用，从而改变了相邻化学键的电子环境。3.10 紫外-可见光谱分析通过对反应混合物及其各组分进行紫外-可见光谱分析，可以更深入地了解复杂物质形成过程中的反应机制。补充材料中的图9(a)展示了五水合硫酸铜的紫外-可见光谱，其在261纳米附近存在一个宽吸收峰。该峰源于配体到金属的电荷转移过程，即水分子或硫酸根阴离子与Cu2+离子结合，将其电子传递给铜离子的空d轨道。由于自旋和拉波特禁阻效应，Cu2+的d-d跃迁本身就很弱，因此在可见光区域几乎没有吸收[39]、[40]、[41]。图9(b)为硫酸多粘菌素的光谱，其主要特征是存在两个吸收峰，一个在230纳米左右，另一个在285纳米左右。285纳米处的峰对应于n→π*跃迁，很可能是由多粘菌素肽键中羰基（C=O）组内的非键电子被激发到反键π*轨道所导致的。230纳米处的峰则与肽主链中的π→π*跃迁有关，尤其是涉及酰胺基和芳香族基团[42]、[43]、[44]、[45]。图9(c)显示了反应混合物的紫外-可见光谱，可以看到多粘菌素的特征吸收峰从230纳米 shifts到了220纳米，同时其强度也有所增加。这一变化可归因于铜的配位作用——铜与多粘菌素的胺基结合后改变了局部电子环境，从而导致颜色向蓝色方向偏移。此外，在260纳米处出现了一个较强的吸收峰，与该位置五水合硫酸铜的LMCT峰重合。这一强度的增加表明多粘菌素与铜形成了复合物，其中多粘菌素中的氮配体影响了LMCT跃迁过程。另外，反应混合物中285纳米处的峰消失了（该峰与多粘菌素中的n→π*跃迁相关），这说明铜的配位作用通过减少电子密度或限制酰胺基或羟基上的孤对电子可用性，改变了或抑制了这些跃迁[39]、[46]、[47]、[48]。3.11 PXRD分析五水合硫酸铜的PXRD图谱（补充材料中的图11(a)）在2θ范围内显示出许多尖锐且强度较高的衍射峰，这表明它具有高度结晶性以及良好的长程结构有序性。这些衍射峰与已报道的结晶态五水合硫酸铜的衍射峰十分吻合[53]。相比之下，硫酸多粘菌素的PXRD图谱（图11(b)）则呈现为宽而模糊的衍射轮廓，没有明显的衍射峰，这说明它主要是无定形或结晶度很低的物质。这一特征与多粘菌素的聚合肽结构一致，也与其在循环伏安法和差分脉冲伏安法中表现出的电化学惰性，以及傅里叶变换红外光谱中观察到的宽振动带相符[54]、[55]。值得注意的是，Cu-CLS反应混合物的PXRD图谱（图11(c)）与各单一组分的图谱有显著差异。五水合硫酸铜的特征衍射峰明显减弱且变宽，这表明其与多粘菌素相互作用后，原有的硫酸铜晶格被破坏了。与此同时，在2θ约为20°的位置出现了一个新的衍射峰，而纯五水合硫酸铜和纯硫酸多粘菌素中均不存在该峰，这进一步证实了由于Cu2+与多粘菌素配位而形成了新的固相。峰数的减少以及峰形的变宽表明Cu-CLS产物具有有限的短程有序性，结晶度较低，这符合金属-配体配位复合物的特点，而非结构明确的无机盐[56]。这一结构变化很好地支持了紫外-可见光谱的结果——由于配体到金属的电荷转移作用出现了新的吸收带，同时也与傅里叶变换红外光谱的结果相符，后者显示-NH、-OH以及酰胺基团的吸收带发生了变化，这些都证明了Cu2+离子与多粘菌素的官能团发生了配位作用。3.12 扫描电镜分析五水合硫酸铜的扫描电镜图像（补充材料中的图12(A)）显示出了形态规整、体积较大的晶体颗粒，这些颗粒边缘清晰，呈片状或块状结构。由于五水合硫酸铜具有高度结晶性，这些颗粒相对致密且紧凑。这一形态与其PXRD图谱中出现的尖锐且强度高的衍射峰一致，进一步证明了该物质具有良好的长程结晶有序性[57]。相比之下，硫酸多粘菌素的扫描电镜图像（图12(B)）则呈现出完全不同的形态。其表面极为不规则，多孔且呈松散聚集状态，没有明显的晶面结构。该物质由质地粗糙的细小团块组成，这正是无定形或结晶度很低的有机化合物的典型特征。这一形态与硫酸多粘菌素缺乏特征的PXRD图谱相吻合，同时也与其电化学惰性以及由其聚合肽结构所导致的宽红外振动带一致[55]、[58]。Cu-CLS反应混合物的扫描电镜图像（图12(C)）则显示出与两种起始物质都截然不同的形态变化。五水合硫酸铜原本清晰的晶体特征已不再可见，取而代之的是表面由不规则的融合团块构成，质地粗糙且不均匀。这些颗粒似乎部分被包覆或嵌入在无定形基质中，这表明Cu2+离子与多粘菌素分子之间存在着强烈的相互作用。这种形态变化说明原有的硫酸铜晶格已被破坏，同时形成了新的Cu2+–多粘菌素配位复合物[56]。总体而言，扫描电镜观察结果有力地支持了PXRD分析的结果——即该物质的结晶度降低，并且出现了新的物相；同时也有助于解释紫外-可见光谱和傅里叶变换红外光谱的结果，这些分析都证明了Cu2+离子与多粘菌素的官能团发生了配位作用。此外，Cu-CLS产物的表面形态变化也有利于电化学过程的进行，因为表面粗糙度的增加以及结构的复杂性有助于电子传输，这一特点与在循环伏安法和差分脉冲伏安法中观察到的增强电化学响应现象是一致的。4. 讨论：该反应的合理机制途径通过傅里叶变换红外光谱、紫外-可见光谱、差分脉冲伏安法以及pH值相关研究的数据，我们可以阐明铜与多粘菌素形成复合物的机制。傅里叶变换红外光谱分析表明，铜主要与多粘菌素的胺基发生相互作用，这一点可从振动频率的变化中看出来。在1534厘米^-1处出现的一个峰对应于酰胺II吸收带，这一现象有力地证明了复合物的形成，因为它反映了多粘菌素肽链结构中NH弯曲振动和CN伸缩振动发生了变化。这种光谱位移表明，铜的配位作用会使其电子效应在整个多粘菌素的环状结构中传播[第3.9节]。这一配位过程还得到了PXRD分析和扫描电镜分析的进一步验证（3.11 PXRD分析，3.12扫描电镜分析），这些分析显示五水合硫酸铜的衍射峰强度降低且变宽，同时在2θ约为20°的位置出现了一个新的反射峰；此外，Cu-CLS产物中原本清晰的晶体形态消失了，取而代之的是不规则的融合团块，这一切都证实了新的Cu2+-多粘菌素配位相的形成。紫外-可见光谱也为复合物的形成提供了进一步的支持，它显示反应混合物在220纳米和260纳米处存在明显的吸收峰。260纳米处的峰源于配体到金属的电荷转移过程，而220纳米处的肩峰则是由铜与多粘菌素中含氮配体之间的配位作用所引发的电子跃迁所导致的。这些光谱变化表明，当两者形成复合物后，铜和多粘菌素的电子环境都发生了显著变化[第3.10节]。差分脉冲伏安法分析结果显示，该复合物的氧化峰强度与pH值密切相关。值得注意的是，在实验条件下，多粘菌素本身具有电化学惰性，因为在没有多粘菌素存在时并未观察到任何氧化还原反应。而当多粘菌素与铜形成复合物后，则会出现明显的阳极差分脉冲伏安峰，这说明电化学信号源自Cu-多粘菌素复合物中的铜中心，而多粘菌素则作为配位剂，起到稳定铜离子并调节其电子环境的作用。具体来说，阳极差分脉冲伏安峰对应于复合物中铜中心的氧化反应（Cu+ → Cu2+），因此整体的电化学响应可归因于由配体介导的Cu2+/Cu+氧化还原过程。在pH值为6.5时，氧化峰的强度最高，此时多粘菌素中的胺基处于部分去质子化状态，有利于铜离子与之结合。在较低的pH值下，胺基过度质子化会导致配位作用减弱；而在较高的pH值下，磷酸根或氢氧根离子的竞争则会降低复合物的稳定性。这种对pH值的敏感性凸显了质子化-去质子化平衡以及竞争性配体在调控铜与多粘菌素相互作用中的作用[3.1 电化学行为，3.2 pH值优化，3.3 反应时间优化]。综合这些研究结果，我们可以全面理解铜与多粘菌素形成复合物的机制：铜离子与多粘菌素的胺基结合，进而引发其环状肽主链的结构和电子结构发生变化。复合物形成的程度和稳定性还受到pH值的影响，pH值既会影响胺基的质子化状态，还会影响其他竞争性配体的作用。这些由多种光谱技术和电化学技术所支持的见解，为我们提供了关于铜与多粘菌素相互作用机制的详细认识（详见补充材料中的图1）。5. 结论我们成功开发了一种基于电化学方法的检测牛奶中硫酸多粘菌素的技术，该方法利用硫酸铜五水合物在pH值为6.5的磷酸盐缓冲溶液中的电化学氧化反应来实现检测。通过分析差分脉冲伏安法和循环伏安法所获得的电化学响应，并结合光谱数据，我们初步了解了多粘菌素-铜复合物形成及其后续电氧化过程的机制。在优化了pH值和反应时间等关键参数后，我们使用差分脉冲伏安法进行了检测。该方法的检测限低至0.77微摩尔，在30至300微摩尔的浓度范围内，相关系数高达0.99，显示出极高的准确性。我们在含有酪蛋白、乳糖、葡萄糖、胆固醇、抗坏血酸以及白蛋白等多种牛奶成分的样品中进行了干扰试验，结果表明该方法具有很高的选择性。在经过脱蛋白处理后，我们对实际牛奶样品进行了检测，结果显示添加的多粘菌素硫酸盐的回收率在95.57%到97.14%之间，这一数值充分体现了该方法的高灵敏度。此外，这种电化学检测方法成本较低，而且无需复杂的样品前处理步骤，也不需要特殊的电极改造，因为使用普通的铂电极即可实现检测。值得一提的是，这种新型的一锅法电化学检测硫酸多粘菌素的技术，是通过先将硫酸多粘菌素转化为具有电活性的物质来实现的，整个过程无需使用任何酶。作者贡献说明Mridupavan Dutta：负责原文撰写、软件应用、资源获取、方法设计、实验实施、正式分析以及数据整理工作。Panchanan Puzari：负责文章的审阅与编辑、结果可视化、结果验证、研究指导以及概念构思工作。