《Non-coding RNA Research》：CircEif3c/miR-96–5p/PHF20L1/MEOX2 axis in perivascular preadipocyte exosomes mediates fibroblast dysfunction and vascular remodeling
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本期推荐：糖尿病血管重构是心血管疾病的重要病理基础，其机制复杂。本研究聚焦血管周前脂肪细胞与血管外膜成纤维细胞间的交互作用，首次揭示了高糖条件下，PVPAC源性外泌体通过携带circEif3c，作为分子海绵吸附miR-96-5p，进而调控PHF20L1/MEOX2信号轴，从而驱动AFs增殖、迁移及抑制凋亡，最终加剧血管重构。该研究不仅阐明了糖尿病血管病变的新机制，也为靶向干预提供了潜在的治疗靶点。
动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）是导致人类致残和死亡的主要原因，而糖尿病是其重要的、可改变的危险因素。长期高血糖状态下，血管会发生结构和功能的异常改变，即血管重构，这是多种心血管疾病的共同病理基础。在血管壁的“外圈”——血管外膜及其周围，存在着两种关键细胞：血管周前脂肪细胞（PVPACs）和血管外膜成纤维细胞（AFs）。传统上，PVPACs所在血管周围脂肪组织（PVAT）和外膜被视为血管的“保护垫”和能量库。然而，近年来研究发现，在肥胖、糖尿病等病理状态下，PVAT会发生不良改变，分泌大量致病因子，从血管“外”向“内”驱动疾病进展，即“由外向内”理论。AFs是外膜中最主要的常驻细胞，处于血管稳态的核心，被认为是血管重构的“主要驱动力”。虽然解剖位置毗邻，但PVPACs与AFs之间是否存在直接的、活跃的“对话”？这种对话是如何发生的？又在糖尿病血管重构中扮演了怎样的角色？这些问题在很大程度上仍是未解之谜。解开这个谜团，对于深入理解糖尿病血管并发症的发病机制、寻找新的干预策略具有重要意义。近期，发表在《Non-coding RNA Research》上的一项研究，为我们揭开了这层神秘面纱的一角。
为了探究上述问题，研究者们设计并开展了一系列严谨的体内外实验。他们首先建立了持续高糖条件下的PVPACs和AFs共培养体系，以及小鼠血管周增殖模型。利用差速超速离心法分离外泌体，并通过透射电镜、纳米颗粒追踪分析（NTA）和外泌体标志物（如CD63、TSG101）进行鉴定。通过高通量RNA微阵列技术分析了PVPAC源性外泌体中的RNA谱，并利用qRT-PCR和原位杂交验证了circEif3c、miR-96-5p、PHF20L1和MEOX2的表达。机制研究整合了生物信息学预测、CRISPR-Cas9基因编辑以及多种功能实验，包括RNA pull-down、RNA免疫共沉淀（RIP）、双荧光素酶报告基因实验、免疫共沉淀（Co-IP）和蛋白质相互作用分析，以阐明circEif3c/miR-96-5p/PHF20L1/MEOX2调控轴。最后，通过体内外拯救实验评估了外泌体circEif3c在AFs功能及血管重构中的作用。研究使用的细胞和小鼠样本来源明确：PVPACs和AFs分别从小鼠血管周围脂肪组织和血管外膜分离培养；动物实验使用了雄性野生型C57BL小鼠、circEif3c基因敲除（circEif3c(?/?)）小鼠和MEOX2条件性敲除（MEOX2(±)）小鼠，并建立了ob/ob糖尿病模型。
3.1. 不同浓度葡萄糖对PVPACs生物学功能的影响
研究首先成功建立了PVPACs和AFs的原代培养体系，并通过免疫荧光和流式细胞术对细胞进行了鉴定。实验发现，与正常葡萄糖（NG，5.5 mM）相比，高葡萄糖（HG，30 mM）能显著增强PVPACs的增殖、迁移和分化能力。这提示高糖环境本身就能激活PVPACs。
3.2. AFs和PVPACs通过外泌体相互作用
通过建立PVPACs/AFs共培养模型，研究者发现两者之间存在活跃的通讯。透射电镜和NTA证实了外泌体的成功分离。将PKH67标记的PVPAC源性外泌体与AFs共孵育后，在AFs胞质内观察到了大量的荧光信号，证明AFs能有效摄取PVPACs分泌的外泌体。功能上，PVPACs来源的外泌体能显著促进AFs的迁移和增殖，而使用外泌体分泌抑制剂GW4869预处理则能削弱这种效应。Western blot结果显示，在高糖刺激下，尤其是在PVPAC/AFs共培养或经PVPAC-Exo预处理后，外泌体标志蛋白CD9、CD63、TSG101和HSP70的表达水平最高。这些结果共同表明，PVPACs分泌的外泌体是介导其与AFs之间细胞通讯、并调控AFs生物学功能的关键载体。
3.3. circEif3c在PVPAC-Exos中被鉴定并富集
研究者对高糖刺激下共培养体系中的外泌体RNA进行微阵列分析，结合生物信息学筛选，发现circEif3c是PVPAC源性外泌体中差异表达最显著的环状RNA。通过反向引物扩增、Sanger测序、放线菌素D处理和RNase R耐受实验，证实了circEif3c具有稳定的环状结构。RNA pull-down实验进一步验证了针对circEif3c反向剪接位点设计的探针具有高效的特异性富集能力。
3.4. circEif3c作为miR-96-5p的分子海绵发挥作用
通过整合微阵列数据和生物信息学数据库（如TargetScan、circBank），研究者预测并筛选出miR-96-5p是可能与circEif3c相互作用的关键miRNA。RNA pull-down实验证实，circEif3c探针能特异性富集miR-96-5p，而非其他候选miRNA。AGO2-RIP实验显示circEif3c和miR-96-5p均能与AGO2蛋白结合。双荧光素酶报告基因实验证明，miR-96-5p mimic能显著抑制野生型circEif3c报告基因的活性，而对突变型无影响。共聚焦显微镜观察也显示了Cy5标记的circEif3c与Cy3标记的miR-96-5p在AFs胞质中的共定位。这些证据链条完整地证明了circEif3c能够作为“分子海绵”吸附miR-96-5p。
3.5. 外泌体circEif3c促进AFs的生物学功能
功能获得与缺失实验表明，来源于PVPACs的外泌体circEif3c（Exo-circEif3c）能够被AFs摄取，并随时间推移在AFs内表达升高。敲低Exo-circEif3c可显著抑制AFs的迁移和增殖，而过表达Exo-circEif3c则产生相反的效果。流式细胞术分析显示，Exo-circEif3c促进AFs增殖、抑制其凋亡。Western blot结果与此一致，敲低circEif3c导致vimentin和PHF20L1表达下调，MEOX2表达上调。
3.6. miR-96-5p通过PHF20L1/MEOX2信号通路调控AFs生物学功能
研究发现，PVPAC-Exo处理可随时间推移上调AFs中miR-96-5p的表达。过表达miR-96-5p抑制AFs迁移和增殖，而敲低miR-96-5p则促进这些过程。生物信息学分析和双荧光素酶报告基因实验证实，PHF20L1是miR-96-5p的直接靶标。Western blot显示，过表达miR-96-5p可降低PHF20L1蛋白水平，但对MEOX2蛋白水平无直接影响。进一步的生信分析和Co-IP实验则揭示，PHF20L1与MEOX2蛋白之间存在直接的相互作用。这表明，miR-96-5p可能通过靶向抑制PHF20L1，间接影响其互作蛋白MEOXX2的信号，从而调控AFs功能。
3.7. PVPAC-(Exo-)circEif3c通过miR-96-5p/PHF20L1/MEOX2信号轴促进AFs的迁移和增殖
综合性的功能回复实验证实了完整的调控轴。过表达circEif3c和PHF20L1，或敲低miR-96-5p和MEOX2，可促进AFs的生物学功能；反之则抑制。重要的是，过表达circEif3c可以逆转miR-96-5p或MEOX2过表达对AFs的抑制作用。与直接转染相比，通过外泌体递送这些效应分子（如Exo-circEif3c mimic）对AFs功能的调控作用更为显著。免疫荧光共定位也直观显示了circEif3c、miR-96-5p和MEOX2在细胞内的空间关系。
3.8. circEif3c/miR-96-5p/PHF20L1/MEOX2信号分子对血管重构影响的体内验证
在ob/ob糖尿病模型小鼠中，研究者通过在颈动脉周围局部应用含有不同效应分子的凝胶进行了体内实验。结果显示，局部应用Exo-circEif3c mimic或Exo-siR-miR-96-5p可显著增加血管内-中膜厚度（IMT）、总血管壁厚度和管腔狭窄率，加剧血管重构，并伴随PHF20L1、vimentin等蛋白表达上调及MEOX2下调。相反，应用Exo-siR-circEif3c、Exo-miR-96-5p mimic或Exo-MEOX2则能有效改善血管重构，表现为血管壁变薄、管腔扩大，蛋白表达变化趋势相反。活体成像显示，DiR标记的外泌体在病变血管局部富集，而Ad-MEOX2干预可抑制这种外泌体的局部积累。体内实验有力地印证了体外研究的结论。
研究结论与讨论
本研究首次系统性地揭示了在糖尿病高糖环境下，血管周脂肪组织通过外泌体介导的细胞间通讯新机制。研究确立了一条完整的信号轴：PVPACs来源的外泌体富含circEif3c，其被AFs摄取后，作为竞争性内源RNA（ceRNA）吸附miR-96-5p，从而解除miR-96-5p对PHF20L1的抑制。PHF20L1表达上调后，通过与转录因子MEOX2相互作用，抑制了MEOX2的信号（MEOX2已知可抑制细胞增殖、促进凋亡），最终导致AFs增殖、迁移增强，凋亡减少，驱动了病理性血管重构。
这项研究的意义重大。首先，在理论上，它填补了PVPACs与AFs这两个解剖相邻但功能关联长期未被重视的细胞类型之间通讯机制的空白，从“由外向内”的角度深化了我们对糖尿病血管病变，特别是血管重构启动机制的理解。其次，它首次将circEif3c/miR-96-5p/PHF20L1/MEOX2这一调控网络与糖尿病血管疾病联系起来，拓展了非编码RNA在心血管代谢疾病中的功能图谱。最后，在转化医学层面，该研究为抗击糖尿病相关血管病理提供了新的潜在治疗靶点。研究表明，靶向抑制外泌体circEif3c或递送MEOX2，能够有效改善血管重构，提示针对此通路的干预（如利用MEOX2进行基因治疗或基于外泌体的靶向递送）有望成为治疗ASCVD的新策略。总之，这项研究不仅揭示了糖尿病血管重构的一个关键驱动轴，也为开发相应的诊断生物标志物和新型疗法奠定了坚实的理论基础。
