《Antioxidants》：Activation of the Nrf2 Signaling Pathway by a Ginseng–Salvia Root–Notoginseng Composite Alleviates Ulcerative DSS-Induced Colitis via Restoring Gut Microbiota and the Intestinal Barrier
Xinao Lyu,
Liurong Zhang,
Jia Si,
Shasha Dai,
Huaiyu Su,
Shuhuan Lyu,
Lin Chen,
Jianwei Sun,
Xiangqun Jin and
Haiyan Li
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本研究开发了人参、丹参和三七口服液(GSNS)，并系统评价了其对右旋葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠结肠炎的治疗潜力与多靶点作用机制。通过激活Nrf2/HO-1信号通路，GSNS有效抑制促炎因子、增强抗氧化防御、上调紧密连接蛋白Occludin表达以修复肠道屏障，并通过调节肠道菌群（如增加普雷沃菌科，抑制大肠杆菌-志贺菌）重塑肠道微生态。本研究为这一传统中药复方治疗溃疡性结肠炎(UC)提供了现代药理学依据，揭示了其通过“抗氧化-抗炎-屏障修复-菌群调节”协同网络发挥疗效的多维机制。
1. 引言
溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性、复发性炎症性肠病，其病理核心涉及上皮屏障破坏、氧化应激、失控的炎症反应和肠道菌群失调构成的恶性循环。当前的疗法常难以同时解决这些多因素问题。人参(Panax ginseng)、丹参(Salvia miltiorrhiza)和三七(Panax notoginseng)是传统中药经典配伍，其活性成分（如人参皂苷、丹酚酸、三七皂苷）具有抗炎、抗氧化、调节菌群和修复屏障的潜力。然而，其复方(GSNS)在UC中的整体疗效、物质基础及整合机制尚不明确。本研究旨在系统评估GSNS对DSS诱导结肠炎小鼠的治疗作用，并从炎症、氧化应激、屏障修复和肠道菌群多维度阐明其作用机制。
2. 材料与方法
2.1. 主要化学试剂与动物
实验所用草药购自国内药企。采用雄性C57BL/6J小鼠，随机分为对照组、模型组(DSS)、阳性药(5-ASA)组及GSNS低、中、高剂量(40, 80, 160 mg/kg/天)组。通过灌胃给药，实验周期7天。
2.2. GSNS的制备与化学表征
将人参、丹参和三七按1:1:1重量比混合，经回流提取、浓缩、冻干制得GSNS干粉。通过超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术，鉴定出25种主要生物活性成分，包括多种人参皂苷、丹酚酸B和三七皂苷R1等，明确了其物质基础。
2.3. 药效学与组织病理学评估
每天记录小鼠体重、粪便性状和便血情况，计算疾病活动指数(DAI)。实验结束后测量结肠长度，并取结肠组织进行苏木精-伊红(H&E)染色，评估病理损伤程度。
2.4. 炎症与氧化应激指标检测
采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清和结肠组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-1β、IL-10等炎症因子水平，以及髓过氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)等氧化应激标志物。
2.5. 分子生物学与蛋白表达分析
通过蛋白质印迹法(Western Blot)检测结肠组织中核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶-1(HO-1)和紧密连接蛋白Occludin的表达。通过实时荧光定量PCR(qPCR)检测Keap1、GCLC、SRXN1等mRNA及miR-146a-5p的表达。采用免疫组织化学(IHC)分析结肠组织中Nrf2蛋白的表达与定位。
2.6. 超微结构与肠道菌群分析
通过透射电子显微镜(TEM)观察结肠上皮细胞的紧密连接等超微结构。收集盲肠内容物，进行16S rRNA基因测序，分析α多样性（如Chao1、Shannon指数）、β多样性（主坐标分析，PCoA），并在门、科、属水平分析群落组成，利用线性判别分析效应量(LEfSe)和相关性网络分析揭示菌群变化。
3. 结果
3.1. GSNS改善DSS诱导的结肠炎表型
与对照组相比，模型组小鼠出现显著的体重下降、DAI评分升高和结肠长度缩短。GSNS中、高剂量治疗能剂量依赖性地逆转这些变化，减轻体重损失，降低DAI评分，并显著恢复结肠长度，其效果与阳性药5-ASA相当。
3.2. GSNS抑制炎症与氧化应激
模型组血清和结肠中促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著升高，抗炎因子IL-10水平改变。GSNS治疗能剂量依赖性地抑制这些促炎因子的过度表达。同时，GSNS降低了结肠中氧化应激标志物MPO活性和MDA含量，并提升了抗氧化酶SOD活性和GSH水平。
3.3. GSNS改善结肠组织病理并激活Nrf2通路
H&E染色显示模型组结肠黏膜结构严重破坏，伴有大量炎症细胞浸润。GSNS治疗剂量依赖性地改善了病理损伤，减少了炎症浸润。IHC结果显示，模型组结肠组织中Nrf2蛋白的阳性面积比、面积密度和核表达强度(H-Score)均显著降低。GSNS中、高剂量治疗可显著促进Nrf2的表达和核转位。
3.4. GSNS修复肠道上皮屏障超微结构
TEM观察显示，对照组结肠上皮细胞微绒毛密集，紧密连接结构完整。模型组则出现微绒毛稀疏脱落、细胞间隙增宽、紧密连接模糊或消失、线粒体肿胀等超微结构损伤。GSNS高剂量治疗可显著修复这些损伤，使上皮结构接近正常。
3.5. GSNS在基因和蛋白水平增强抗氧化与屏障功能
Western Blot结果显示，模型组结肠组织中核Nrf2、HO-1和Occludin的蛋白表达均显著下降。GSNS高剂量治疗能显著上调这些蛋白的表达。qPCR结果进一步显示，GSNS下调了Keap1 mRNA的表达，上调了抗氧化基因GCLC和SRXN1的表达，并将异常升高的miR-146a-5p恢复至接近正常水平。
3.6. GSNS调节肠道菌群结构与生态网络
16S rRNA测序分析表明，DSS建模显著改变了肠道菌群结构，降低了微生物的丰富度(Chao1)和均匀度(Shannon)。GSNS治疗能剂量依赖性地恢复这些α多样性指数。β多样性分析显示，GSNS处理组的菌群结构更接近于对照组。在菌群组成上，GSNS逆转了DSS引起的厚壁菌门(Firmicutes)减少和拟杆菌门(Bacteroidetes)增加的趋势。LEfSe分析发现，模型组中与炎症相关的变形菌门(Proteobacteria)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和大肠杆菌-志贺菌(Escherichia-Shigella)等显著富集；而GSNS高剂量组则显著促进了普雷沃菌科(Prevotellaceae)等有益菌的富集。相关性网络分析进一步揭示，GSNS干预后，微生物相互作用网络得以重塑，以乳酸杆菌(Lactobacillus)为代表的有益菌之间的正向协同增强，网络复杂性及稳定性得到改善。
4. 讨论
本研究综合药效学、分子生物学和微生物组学分析表明，GSNS通过多靶点机制缓解DSS诱导的结肠炎。其核心机制在于激活Nrf2/HO-1信号通路，从而协同发挥抗炎、抗氧化作用。同时，GSNS上调紧密连接蛋白Occludin的表达，修复上皮屏障超微结构。此外，GSNS还能重塑紊乱的肠道菌群，抑制有害菌，促进有益菌，并改善菌群生态网络的稳定性。这三大作用——激活抗氧化通路、修复物理屏障、调节微生态——相互关联，构成了GSNS治疗UC的整合作用框架。该研究为中药复方“多成分-多靶点-多通路”治疗复杂疾病提供了实证，其通过Nrf2通路协同调节“氧化应激-炎症-屏障-菌群”轴的作用模式，为开发系统性恢复肠道稳态的创新策略奠定了基础。
5. 结论
本研究表明，人参-丹参-三七口服液(GSNS)能有效缓解DSS诱导的小鼠结肠炎。其作用机制是通过激活Nrf2信号通路对抗氧化应激与炎症，通过上调Occludin修复肠道屏障完整性，并通过调节肠道菌群恢复微生态平衡。这些效应共同构成了一个协同互作的网络。该研究为这一传统中药复方在结肠炎治疗中的应用提供了现代药理学依据，并明确了激活Nrf2通路是其发挥多靶点疗效的核心机制之一。
