《Marine Drugs》：Characteristics of a Dinophysis cf acuminata Population from a Tidewater Glacier Lagoon in a Temperate Latitude: Applications to Dinophysis Studies
Patricio A. Díaz,
María García-Portela,
Gonzalo álvarez,
Francisco Rodríguez,
Iván Pérez-Santos,
Daniel Varela,
Michael Araya,
Camila Schwerter,
ángela M. Baldrich and
Beatriz Reguera
+ 1 author
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这篇研究描述了在智利巴塔哥尼亚圣拉斐尔冰川泻湖中发现的一个独特的Dinophysis cf acuminata种群。该种群是该泻湖中观察到的唯一鳍藻属物种，能在寒冷（4-7°C）、低盐（14-15）的极端但稳定环境中常年存在，并含有单一的扇贝毒素-2（PTX2）。通过形态学、分子系统发育（ITS和23S rDNA）和毒素分析，研究确认了其属于D. acuminata复合体，并揭示了其捕食/质体来源为红色中缢虫（Mesodinium rubrum + major复合体）。该研究强调了这个受气候变化影响的原始泻湖可作为研究D. acuminata复合体生态生理学、种群动态及其毒素（特别是PTXs）对海洋生物慢性暴露影响的天然实验室，为相关监测和预警提供了独特视角。
1. 引言
在众多有害藻华（HABs）及其影响中，产毒微藻（有毒HABs）引发的藻华对公共卫生（人类中毒）以及贝类（捕捞禁令）、鱼类（大规模死亡）和水产养殖业危害最大。一些微藻产生强效毒素，即使在低细胞浓度下也能被滤食性动物积累、转化并通过食物网传递。过去二十年积累的证据表明，毒素会通过细胞外排泄或泄漏到环境中。在实验室实验中，细胞外毒素部分可能占鳍藻（Dinophysis）产生的总毒素的65-90%。换句话说，仅测量颗粒态毒素会低估实际产生的毒素量以及对海洋生物造成危害的潜力。
鳍藻属（DinophysisEhrenberg）包含全球超过一百个物种，其中10种与贝类中毒有关。有毒的鳍藻物种产生一组或两组亲脂性毒素：(i) 大田软海绵酸及其衍生物（腹泻性贝类毒素，DSP）和(ii) 扇贝毒素。扇贝毒素传统上与田软海绵酸类一同被归入DSP复合物，因为它们都由鳍藻产生，且在用标准毒素测试的脂溶性溶剂萃取时被共同提取。大田软海绵酸及其衍生物是蛋白磷酸酶抑制剂，是唯一具有致腹泻效应的毒素。扇贝毒素通过腹腔注射可能杀死小鼠并导致肝毒性，但经口摄入无害。根据最近的毒理学研究，世界卫生组织认为PTXs不会对人类健康构成风险，因此这组毒素不再受监管。然而，扇贝毒素是肌动蛋白聚合酶抑制剂，影响细胞运动性，并且有越来越多关于PTXs对双壳类和鱼类早期幼虫阶段有害影响的体外研究。关于对人类健康的亚急性影响，大田软海绵酸及其衍生物被认为是肿瘤促进剂，而PTX2被发现对癌细胞具有选择性凋亡效应。因此，同一生物体（鳍藻物种）既产生肿瘤促进剂，也产生肿瘤抑制剂。
鳍藻物种，特别是那些属于“Dinophysis acuminata复合体”的物种，是许多具有重要贝类资源的沿海地区的特有种。监测鳍藻物种可能因多种原因而困难。首先，它们形成低生物量藻华。每升几百个细胞的浓度就与贝类毒性有关，而细胞数量超过103个/L即被视为藻华，但它们可能在一年中的大部分时间低于传统监测项目的检测限（40-100 个/L）。其次，它们表现出高度的种内形态和毒素学变异性，即同一物种不同品系之间在大小、形状以及毒素组成和含量上的差异，可能大于同一地点不同物种之间的差异。最后，通常用于区分形态相近物种并用于设计其鉴定分子探针的核（LSU、SSU和ITS区域）和线粒体基因（cox1和cob）序列的种间变异性很低。考虑到通常用于诊断鳍藻物种的形态特征是大下壳板的形状、相对大小和纹饰，当形态相似的物种（每个物种都有其一系列形态型）同时出现在同一样本中，且分子探针对解决不确定性帮助不大时，物种鉴定可能很繁琐。
预测鳍藻物种有毒藻华及随后的贝类污染的关键问题与其营养来源（纤毛虫猎物）和生活史策略（越冬细胞和接种体或“种群来源”的起源）有关。鳍藻物种是“质体专性非组成型混合营养生物”（pSNCM），即它们的质体不是固有的，而是从非常特定的猎物（专性）窃取的（盗食质体）。二十年前，实验室培养建立了一个三物种食物链——D. acuminata捕食纤毛虫Mesodinium rubrum，后者又捕食隐藻微鞭毛虫——后来也用于其他有毒鳍藻。然而，有野外鳍藻种群含有Teleaulax/Geminigera分支以外的盗食质体的记录，这暗示了替代猎物的可能性。鉴于鳍藻物种的混合营养性质，将已确认的纤毛虫猎物（Mesodinium rubrum+ major复合体或任何其他疑似携带质体的纤毛虫）添加到生长方程中，对于可靠的藻华预测模型至关重要。但到目前为止，很少有以鳍藻为重点的调查包括对伴生的潜在猎物（携带质体的微型纤毛虫）的分析，也没有对捕食者和疑似猎物的质体序列进行分析以确认它们共同的隐藻起源。
此外，与其他HAB甲藻物种（如Alexandrium和Protoceratium）不同，鳍藻物种似乎不依赖于底栖阶段（有性包囊）进行接种。其复杂的多态性生活史包括有性过程和动合子形成。这些可移动的二倍体动合子可以进行分裂产生营养细胞，从而缩短了有性包囊阶段。因此，整个生活史包括出现在水柱中的自由游动形式（全浮游生活史）；下一季的接种体将由以某种休眠状态越冬、分散在水柱中或存在于某个未知的滞留区充当“浮游种子库”的自由可移动形式形成。这个术语由Smayda创造，用来描述在上涌锋面积累的甲藻，像“浮游种子”一样，当下涌期间被平流到海岸时，能够作为未来种群的接种体。
本文描述了在圣拉斐尔泻湖发现的一个独特的Dinophysis acuminata种群，这是一个相对未经勘探的、拥有原始水域和壮观景色的偏远潮水冰川泻湖。圣拉斐尔泻湖是豹海豹（Hydrurga leptonyx）小型群落和其他受保护动物的栖息地，是圣拉斐尔冰川国家公园的一部分，于1979年被联合国教科文组织指定为世界生物圈保护区。这个位于智利西北部巴塔哥尼亚最南端（即温带纬度）的国家公园，是北巴塔哥尼亚冰原（3500平方公里）的所在地，这是南半球继南极洲和南巴塔哥尼亚冰原之后的第三大冰原。这些特征使圣拉斐尔公园及其水域成为观测气候变化对冰川动力学影响的高度敏感观测站。然而，只有少数尝试研究了圣拉斐尔泻湖的浮游生物群落（主要是浮游动物），这是一个由同名冰川退缩形成的极端环境。只有一次调查是在20世纪90年代初的国际罗利探险期间，描述了一个由少数硅藻物种组成的低多样性网采浮游植物群落。
这里描述的鳍藻标本来自在季节性海洋学调查期间进行的机会性采样，这些调查旨在研究泻湖和相邻水域的水文和水团环流。在采用“健康一体化”方法研究有毒藻华的框架下，毒素对人类产生的单向影响并不是唯一需要考虑的危害。圣拉斐尔泻湖地处偏远，没有水产养殖或开发的贝类养殖场，没有人为污染，环境条件稳定，并且在不同的季节调查（包括冬季）中只出现一种鳍藻物种，即Dinophysiscf acuminata，这使其成为研究一种世界性鳍藻物种生态生理学和种群动力学的天然中宇宙。它可以作为一个模型案例研究，探讨在稳定环境条件下，鳍藻的生物活性（颗粒或细胞外）化合物对长期暴露于单一亲脂性毒素生产者的低多样性地方动物群的影响。
2. 结果
2.1. 水文条件与鳍藻分布
在春季（2020年11月）、夏季（2021年2月）和冬季（2021年8月）通过CTD测量了物理性质的垂直分布。夏季表层水和底层水（>90米）之间在温度（T）和盐度（S）上存在轻微差异。冬季，从>70米深度到底部存在非常轻微的温度逆增。因此，泻湖提供了一个寒冷（5.2至8.3°C）和低盐（14.6-16.9）但非常稳定的环境，变异性范围很窄。
Dinophysiscf acuminata是在三次季节性调查期间收集的样本中出现的唯一鳍藻物种。冬季表层细胞的出现量（500 ± 445 个/L）远高于使用Uterm?hl方法进行显微镜计数的常规监测项目的检测限（40-100 个/L）。春季（2800 ± 980 个/L）和夏季（1000 ± 630 个/L）出现了中等藻华水平。鳍藻细胞的垂直分布随季节变化；细胞最大值在冬季出现在表层，而在春季和夏季出现在5米深度的明显最大值处。这个5米深度与CTD剖面中观察到的微弱（可能是昼夜的）温跃层的底部重合。低垂直分辨率采样（每5米一个水样瓶）使得无法探索垂直微观结构并确定鳍藻细胞是否主动聚集在薄层中。尚不确定观察到的鳍藻细胞峰值是否与假设薄层的最大强度重合。
2.2. 形态学观察
这里显示的显微照片来自夏季（二月）样本，这是唯一出现小型形态较多的季节。在圣拉斐尔泻湖观察到的鳍藻标本表现出相当规则和恒定的形状（大下壳板的轮廓），并且在三次季节性（春、夏、冬）采样中呈现出两个明显的大小等级或形态型。大型形态为亚卵形且略不对称，大下壳板纹饰良好，外观粗糙，类似于冷温带物种Dinophysis norvegica。细胞测量值为长度（L）= 43.53 ± 2.32 μm，背腹深度（D）= 39.03 ± 2.32 μm，样本数n = 44；L:D 比为 1.12 ± 0.05。较小的形态更呈卵圆形且对称，测量值为 L = 27.68 ± 3.41 μm，D = 25.90 ± 3.65 μm，n = 9；L:D 比为 1.07 ± 0.08。
2.3. 23S rDNA序列的一般比对和系统发育分析
质体来源的23S rDNA序列比对包含43条序列，总比对长度为381 bp。所得的最大似然系统发育树恢复了隐藻的主要分支。作为质体来源的序列，所得的系统发育反映了鳍藻细胞保留的盗食质体的隐藻起源，而不是鳍藻宿主本身的系统发育位置。从鳍藻获得的两条质体来源序列与Teleaulax–Plagioselmis-Geminigera类群聚类在一起。本研究中获得的两条序列与T. amphioxeia和Plagioselmis序列在一个亚支中聚在一起。这两条鳍藻来源的23S rDNA序列与这些隐藻序列显示出非常高的相似性。这些结果证实，来自圣拉斐尔的鳍藻细胞中的质体属于Teleaulax/Plagioselmis型隐藻分支。
2.4. ITS rDNA序列的一般比对和系统发育分析
总共有71条ITS rDNA序列被纳入最终比对，长度为646 bp。ITS rDNA系统发育显示了鳍藻属的特征模式，其中几个物种形成密切相关的谱系，由于该组内较低的遗传分化和广泛的rDNA重叠，更深层的关系仅得到部分解析。D. acuminata复合体表现为一个遗传异质性的集合，包括被鉴定为D. acuminata和D. norvegica的序列，后者形成一个高支持度的内部亚支。值得注意的是，被鉴定为D. ovum和D. sacculus的额外序列也落在这个复合体内，反映了D. acuminata–D. sacculus–D. ovum–D. norvegica集合成员之间缺乏清晰的ITS界限。序列AY040569，虽登录为D. acuta，但被置于D. acuminata复合体支内，与本研究中获得的七条D. acuminata序列具有99.4-99.8%的一致性。相反，它与另外两条与D. acuminata复合体分开聚类的D. acuta序列的一致性明显较低。这些结果强烈表明AY040569被错误鉴定，很可能对应于D. acuminata标本，而不是D. acuta。
在ITS rDNA树中，具有99/1/99支持度的节点对应于D. norvegica支。我们的序列PX494341（被鉴定为D. acuminata）不属于这个群体，而是作为其直接的姐妹谱系出现。这种拓扑结构反映了D. acuminata和D. norvegica之间非常短的遗传距离。此外，成对比较显示，PX494341与D. norvegica序列共享96.3-98.6%的一致性，但与同样被鉴定为D. acuminata的OM939692和PX494342具有更高的99.6%的一致性。PX494341来自对应于小型形态型细胞的DNA提取物，而其余分离株对应于较大的形态型。尽管存在这些形态差异，D. acuminataPX494341与较大形态型序列聚在一起，并表现出几乎相同的核苷酸组成。
2.5. 颗粒毒素分析
对2021年夏季（2月）和冬季（8月）收集的浮游生物网样提取物进行的亲脂性毒素LC-MS分析显示，仅存在扇贝毒素（PTX2）。在7.26分钟处检测到一个色谱峰，其母离子质量[M-H]为876.5082 m/z，对应于PTX2；其存在通过其特征性的MS/MS碎片m/z 841.4736、823.4628、805.4525和787.4401 m/z得到确认。2021年2月，总PTX-2为50.2 ng NT-1，而在2021年8月，相同毒素的总含量略低（35.9 ng NT-1）。假设垂直拖网期间海水通畅（无偏转和/或堵塞）地通过网具，每个网样的这些值将分别相当于2月80 pg PTX2/L和8月57 pg颗粒PTX2/L。
