《Biology》：Sustainable Endoglucanase Production from Lignocellulosic Waste Through Fungal Co-Culture Technology: A Step Towards Circular Economy
Imran Ali,
Hira Butt,
Roheena Abdullah,
Afshan Kaleem,
Mahwish Aftab,
Mehwish Iqtedar,
Irfana Iqbal and
Xiaoming Chen
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本研究聚焦于利用由少根根霉（Rhizopus arrhizus）与烟曲霉（Aspergillus fumigatus）组成的特异性真菌共培养体系优化内切葡聚糖酶（endoglucanase, EC 3.2.1.4）的生产。该共培养体系经形态学与18S rDNA
本研究聚焦于利用由少根根霉（Rhizopus arrhizus）与烟曲霉（Aspergillus fumigatus）组成的特异性真菌共培养体系优化内切葡聚糖酶（endoglucanase, EC 3.2.1.4）的生产。该共培养体系经形态学与18S rDNA分析鉴定，在使用碱预处理底物的发酵72小时后获得最高酶产量。扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy, SEM）观察显示，预处理后的生物质结构发生显著破坏，增强了酶的可及性。在测试的多种底物中，豌豆壳被证明是产酶效果最佳的基质。研究人员采用实验设计（Design of Experiments, DOE）方法对物理和营养参数进行了统计优化，具体使用Plackett–Burman设计（PBD）进行筛选，并使用中心复合设计（Central Composite Design, CCD）进行精细优化。在优化条件——温度27.5 °C、pH 5.5、接种龄3.5天，并补充1.5%果糖、1.25%酵母提取物、1.25%硝酸钠和1.25% Tween 80下，获得了119.58 U/mL/min的最大内切葡聚糖酶活性。方差分析（Analysis of Variance, ANOVA）证实了这些参数及其相互作用在95%置信水平下的显著性，模型拟合度高（R2= 0.9052）。该研究证明了废弃豌豆壳作为一种经济高效的产酶底物的潜力，通过可持续的生物质利用支持废弃物增值，并为循环生物经济做出贡献。
论文解读
研究背景与意义
随着2015年循环经济概念的提出，全球资源管理正从线性的“资源—产品—废弃物”模式向减量化、再利用、再循环的可持续闭环系统转型。农业与林业活动每年产生大量富含木质纤维素的废弃物，若处置不当将带来环境与经济负担，但若能有效转化则极具价值。内切葡聚糖酶（Endoglucanase, EC 3.2.1.4）作为降解纤维素的关键水解酶，在工业领域需求巨大，然而其高昂的生产成本限制了广泛应用。传统单一微生物发酵效率有限，且木质纤维素致密的抗降解屏障（Recalcitrance）阻碍了其水解。因此，开发低成本、高效率的酶生产策略成为当务之急。本研究发表于《Biology》，旨在通过真菌共培养技术结合废弃物资源化利用，探索一条降低内切葡聚糖酶生产成本、推动循环生物经济发展的新途径。
关键技术方法
研究人员首先从巴基斯坦拉合尔地区的土壤和堆肥中分离筛选具有高纤维素降解潜力的真菌菌株，并通过形态学观察与18S rDNA测序进行分子鉴定。通过兼容性测试筛选出具有协同作用的菌株组合。研究选用多种农业废弃物作为底物，采用碱预处理去除木质素以提高纤维素可及性。发酵过程采用固态发酵（Solid State Fermentation, SSF）模式。实验设计方面，综合运用了Plackett–Burman设计（PBD）快速筛选关键物理因子，中心复合设计（CCD）对物理与营养因子进行精细优化，并利用响应面法（Response Surface Methodology, RSM）分析变量间的交互作用。酶活测定采用二硝基水杨酸（DNS）法，酶解产物通过还原糖释放量进行评估。
研究结果
3.1 真菌菌株的分离与筛选
研究人员成功分离并筛选出多株产纤维素酶真菌。通过兼容性测试发现，烟曲霉（Aspergillus fumigatus）与少根根霉（Rhizopus arrhizus）组成的共培养体系（LBT-4）表现出最强的协同效应，其内切葡聚糖酶（CMCase）活性达到50.63 U/mL/min，显著高于单一菌株。形态学特征结合18S rDNA序列分析（GenBank登录号PP943377和PP940183）证实了菌种鉴定的准确性。扫描电镜（SEM）观察进一步揭示了两菌的微观形态特征。
3.2 碱预处理对木质素-纤维素组成及形貌的影响
碱预处理显著改变了生物质的化学组成与物理结构。处理后，豌豆壳的木质素含量降至18%，纤维素含量提升至80%以上，同时SEM图像显示其表面结构遭到破坏，比表面积增大，有效消除了底物的抗降解屏障，极大提升了后续的酶解效率。
3.3 内切葡聚糖酶生产的底物筛选
在多种木质纤维素底物中，碱预处理后的豌豆壳表现最优。统计学分析（单因素方差分析与t检验）证实，豌豆壳组的酶活显著高于稻壳、甘蔗渣和纸板等其他底物，这归因于其高纤维素含量、适宜的碳氮比及良好的保水性。
3.4 孵育时间的影响
酶产量随孵育时间动态变化。在72小时达到峰值（56.80 U/mL/min），随后因营养物质耗尽、代谢副产物积累及蛋白酶降解等原因导致酶活下降。
3.5 基于Plackett-Burman设计的物理因子筛选
PBD实验评估了温度、pH、接种量、接种龄、底物浓度和湿度六个因素。结果表明温度（30 °C）、pH（7.0）和接种龄（5天）是影响酶产量的关键因素。建立的线性模型拟合度高（R2= 0.954），验证了实验设计的可靠性。
3.6 基于CCD的关键物理因子优化
针对筛选出的三个关键因素进行CCD优化。模型预测最佳条件为27.5 °C、pH 5.5、接种龄3.5天，验证实验获得81.29 U/mL/min的酶活，较初始筛选提升了约20–25%。
3.7 营养因子的单因素分析（OFAT）
研究人员评估了外源营养对产酶的影响。结果显示，果糖是最佳碳源，酵母提取物是最佳有机氮源，硝酸钠是最佳无机氮源，Tween 80作为表面活性剂能显著提高酶活，可能与其增加细胞膜通透性和底物可及性有关。
3.8 基于CCD的关键营养因子优化
进一步对营养因子进行CCD优化。确定最佳配比为1.5%果糖、1.25%酵母提取物、1.25%硝酸钠和1.25% Tween 80。在此条件下，实验验证获得最大酶活119.58 U/mL/min，较未优化前总体提升了近48%，模型预测值与实验值吻合良好（R2= 0.9052）。
3.9 优化酶的酶解效率
将优化获得的酶制剂用于生物质水解。在72小时内，预处理豌豆壳释放的还原糖达412.3 mg/g干底物，水解率为68.5%；水稻秸秆释放356.8 mg/g，水解率为59.7%。这表明该酶系具有优异的水解性能，且豌豆壳兼具“产酶底物”与“水解原料”的双重价值。
3.10 烟曲霉的生物安全考量
研究人员特别指出，烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是一种机会性致病菌。虽然实验室规模的受控发酵风险可控，但在未来工业化放大过程中，必须考虑潜在的生物安全风险，建议评估使用非致病性工业菌株替代的可能性。
讨论与结论
本研究成功构建了一个高效的烟曲霉与少根根霉共培养体系，并确立了利用废弃豌豆壳通过固态发酵生产内切葡聚糖酶的最佳工艺参数。研究通过系统的统计学优化，实现了酶活性的大幅提升。更重要的是，该研究展示了豌豆壳在生物炼制中的双重用途：既可作为廉价底物生产高附加值酶制剂，又可作为原料转化为可发酵糖，真正实现了“变废为宝”。这一策略不仅降低了酶的生产成本，还解决了农业废弃物的环境污染问题，为循环生物经济的发展提供了一个切实可行的范例。尽管烟曲霉的使用涉及一定的生物安全考量，但这并不妨碍该工艺在严格管控下的应用前景。总体而言，这项工作为木质纤维素废弃物的高值化利用提供了重要的理论与技术支撑。
