利用甲氧苄啶筛选型等位基因交换及mini-Tn7回补方法对洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cenocepacia）中purM基因的功能分析

《Microbiology Spectrum》：Functional analysis of purM in Burkholderia cenocepacia using a trimethoprim-selectable allelic exchange and mini-Tn7 complementation approach

　　

摘要 洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cenocepacia）是洋葱伯克霍尔德菌复合体（Burkholderia cepacia complex, Bcc）的成员，对免疫功能低下个体，特别是囊性纤维化患者构成重大威胁。对其发病机理的理解进展一直受到高效遗传学工具可用性的阻碍。研究人员选择purM基因进行功能分析，因为该基因在嘌呤限制条件下对生长、胞内生存及其近缘种（Burkholderia pseudomallei）的毒力至关重要。研究人员采用基于优化sacB反向筛选策略的非复制性甲氧苄啶抗性（trimethoprim-resistance, TMPr）载体pEDL1005，在洋葱伯克霍尔德菌中进行无标记基因缺失，实现了在参考菌株K56-2和临床分离株SCBC075中框内删除编码磷酸核糖基氨基咪唑合成酶（phosphoribosylaminoimidazole synthetase）的purM基因。值得注意的是，高效的基于sacB的反向筛选需要菌株特异性的蔗糖浓度（K56-2为20%，SCBC075为25%）。为恢复purM功能，研究人员采用了基于mini-Tn7的回补系统（pUC18T-mini-Tn7T-TMP），用于在该细菌中鉴定出的四个glmS同源基因之一的下游进行位点特异性染色体插入。基于聚合酶链式反应（PCR）的方法验证了插入发生在每个靶位点下游18-20 bp处。功能分析表明，ΔpurM突变体是严格的腺嘌呤营养缺陷型，证实了purM在嘌呤从头合成（de novo purine biosynthesis）中的关键作用，这与在B. pseudomallei中的发现一致。然而，与B. pseudomallei不同，SCBC075的ΔpurM突变体在RAW264.7巨噬细胞内的胞内存活未显示出显著衰减。这些结果验证了pEDL1005和mini-Tn7系统是用于洋葱伯克霍尔德菌无标记基因缺失和染色体回补的有效工具，扩展了针对该病原体的分子工具包，并为未来的基因功能、代谢和发病机理研究提供了可能。

论文解读

一、 研究背景与目的

洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cenocepacia）是洋葱伯克霍尔德菌复合体（Burkholderia cepacia complex, Bcc）中的一个重要成员，为专性需氧的革兰氏阴性杆菌。作为一种机会性病原体，它对免疫功能低下人群，特别是囊性纤维化（cystic fibrosis, CF）和慢性肉芽肿病（chronic granulomatous disease, CGD）患者构成严重威胁，可引发危及生命的“洋葱伯克综合征”。其多药耐药性和院内传播能力使其治疗面临重大挑战。该菌的一个关键致病机制是其能在宿主免疫细胞（如巨噬细胞）内存活和复制，通过主动延迟吞噬溶酶体成熟来逃避宿主防御。然而，对其胞内致病性和代谢的分子机制研究一直受到其基因组结构复杂、抗生素耐药性强以及可用遗传学工具有限的阻碍。

为了深入理解基因功能，研究人员需要高效、灵活的遗传操作系统，能够在不同菌株中进行无标记基因敲除和稳定的回补验证。尽管已有基于自杀载体携带反向选择标记（如pheS、sacB和I-SceI）的等位基因交换系统以及转座子（transposon）系统用于标记缺失突变或染色体回补，但这些系统在洋葱伯克霍尔德菌中的应用仍有不足。目前尚缺乏一种能够使用单一抗生素标记（如甲氧苄啶，trimethoprim, TMP）同时完成无标记缺失和位点特异性回补的简化流程。TMP因其在洋葱伯克霍尔德菌中高效、可靠的筛选能力而具有显著优势。

purM基因编码磷酸核糖基氨基咪唑合成酶，是嘌呤从头合成和硫胺素代谢中的必需酶。在近缘病原体Burkholderia pseudomallei中，purM已被证实对嘌呤限制条件下的生长、胞内生存和毒力至关重要，暗示其在细菌适应宿主营养免疫（nutritional immunity）环境中的重要性。然而，purM基因在洋葱伯克霍尔德菌中的功能尚未被表征。

因此，本研究旨在扩展洋葱伯克霍尔德菌的遗传工具包，通过优化基于pEDL1005载体的无标记基因敲除和基于mini-Tn₇的染色体回补系统，建立一个使用单一TMP标记的简化操作平台。并以此为工具，以purM基因为例，在参考菌株K56-2和临床分离株SCBC075中对其进行功能分析，以揭示其在细菌代谢和致病力中的作用，同时也为未来在该病原体中进行基因功能、代谢和发病机制研究提供有力的技术支持。本文的研究工作发表在《Microbiology Spectrum》期刊上。

二、 主要关键技术方法

研究人员采用了以下关键技术方法：1. 构建了针对两个不同洋葱伯克霍尔德菌菌株（参考株K56-2和临床分离株SCBC075）的purM基因框内缺失（in-frame deletion）的等位基因交换（allelic exchange）质粒pEDL1005ΔpurM_K56-2和pEDL1005ΔpurM_SCBC075。2. 通过三亲本接合（triparental mating）将构建的质粒从辅助菌株Escherichia coli RHO3转移至目标洋葱伯克霍尔德菌株，并通过基于sacB基因的蔗糖反向筛选，成功筛选出purM缺失突变体。3. 利用mini-Tn₇转座子系统，构建了携带purM完整基因及其上游调控序列的回补质粒pUC18T-mini-Tn7T-TMP::purM_K56-2，通过电穿孔（electroporation）与辅助质粒pTNS3共转化至K56-2ΔpurM突变体中，实现了purM功能的染色体位点特异性回补。4. 通过生长曲线分析和胞内生存实验（intracellular survival assay）在RAW 264.7小鼠巨噬细胞中，评估了野生型、突变体和回补菌株在富养（LB）和贫养（M9）培养基中的生长特性以及其在巨噬细胞内的生存能力。

三、 研究结果与发现

1. 利用蔗糖优化的pEDL1005等位基因交换系统成功在洋葱伯克霍尔德菌中删除purM基因

研究人员成功地将基于sacB反向筛选的TMP^r基因置换质粒pEDL1005应用于洋葱伯克霍尔德菌。通过优化发现，高效的反向筛选需要菌株特异性的蔗糖浓度：K56-2菌株在20%蔗糖下可获得100%的突变体回收率，而SCBC075菌株则需25%蔗糖。在优化的蔗糖浓度下，通过颜色筛选（X-Gluc）和营养缺陷型表型（M9G不生长，M9GAT生长）初步筛选，并经PCR和Sanger测序确认，成功获得了K56-2和SCBC075的purM基因框内缺失突变体。结果表明，基于pEDL1005的等位基因交换系统是洋葱伯克霍尔德菌中进行无标记基因缺失的有效工具。

2. 回补purM缺失突变体及表征洋葱伯克霍尔德菌K56-2中glmS相关插入位点

研究人员利用mini-Tn₇系统成功回补了K56-2ΔpurM突变体的嘌呤原养型（prototrophy）。通过全基因组分析，在K56-2中鉴定出四个glmS基因位点（glmS1-glmS4）。利用位点特异性PCR和测序验证，确认了mini-Tn₇元件可插入到所有四个glmS位点的下游，插入点位于下游18-20 bp处。在对8个转化子的分析中，插入发生在glmS1、glmS3和glmS4下游的频率相近，而glmS3是最常被利用的插入位点（3/8）。这证实了mini-Tn₇系统可在洋葱伯克霍尔德菌染色体上实现稳定的、位点特异的单拷贝基因整合，为基因回补和功能研究提供了可靠平台。

3. purM的缺失导致腺嘌呤营养缺陷并损害洋葱伯克霍尔德菌K56-2和SCBC075在嘌呤限制性培养基中的生长

生长分析显示，在富含营养的LB培养基中，K56-2和SCBC075的ΔpurM突变体生长速率和最终OD₆₀₀均低于各自的野生型菌株。在补充腺嘌呤后，突变体生长得到恢复并与野生型相当。在M9G基本培养基中，两个菌株的ΔpurM突变体完全无法生长。补充腺嘌呤（M9GA）或同时补充腺嘌呤和硫胺素（M9GAT）可完全恢复突变体的生长，而单独补充硫胺素（M9GT）则无效。K56-2ΔpurM突变体经mini-Tn₇回补purM基因后，其在M9G中的生长能力完全恢复至野生型水平。这些结果证实，purM缺失导致洋葱伯克霍尔德菌K56-2和SCBC075均成为严格的腺嘌呤营养缺陷型（adenine auxotrophic），purM是细菌在嘌呤限制条件下生长的必需基因。

4. purM缺失对洋葱伯克霍尔德菌菌株在RAW264.7巨噬细胞内生存的影响存在差异

研究人员利用RAW264.7巨噬细胞进行了胞内生存实验。结果表明，在感染后3小时，K56-2ΔpurM突变体的胞内细菌数量显著低于野生型，表明其在早期胞内适应或进入方面存在缺陷。虽然在8小时后恢复，但在24小时后其数量再次显著降低。回补菌株在所有时间点均表现出与野生型相当的生存能力，证实功能恢复。然而，在临床分离株SCBC075中，purM的缺失对其在巨噬细胞内的生存能力没有显著影响，突变体与野生型在所有时间点的菌落形成单位（colony-forming unit, CFU）计数均无统计学差异。这些发现揭示了purM在洋葱伯克霍尔德菌胞内生存中的作用具有菌株依赖性。该基因对参考菌株K56-2的早期胞内适应至关重要，但对临床分离株SCBC075则显得非必需，这暗示了不同菌株在利用宿主嘌呤或嘌呤补救途径（purine salvage pathway）方面可能存在代谢灵活性或策略差异。

四、 讨论与结论总结

讨论部分总结：

洋葱伯克霍尔德菌是一种临床重要的病原体，但其遗传工具的限制阻碍了对发病机制的研究。本研究通过功能分析证实purM是洋葱伯克霍尔德菌嘌呤合成代谢的关键基因，但其表型效应表现出显著的菌株异质性。两个菌株的ΔpurM突变体均表现出严格的腺嘌呤营养缺陷，但在生长恢复和胞内生存方面存在差异。K56-2ΔpurM在巨噬细胞内存活受损，而SCBC075ΔpurM则未受影响，这表明不同菌株对嘌呤从头合成的依赖程度不同，SCBC075可能更有效地利用宿主来源的嘌呤或拥有更高效的补救途径。这种差异突显了即使在同一种内，毒力的代谢决定因素也可能具有高度背景和菌株特异性。

在遗传操作层面，尽管基于sacB的反向筛选系统在两种菌株中都有效，但成功的突变体回收需要经验性地优化蔗糖浓度（K56-2为20%，SCBC075为25%）。这强调了在洋葱伯克霍尔德菌种内，生理异质性会显著影响常用反向选择系统的性能，遗传框架必须通过菌株特异性优化来适应这种变异性。

研究人员利用mini-Tn₇系统成功回补了purM功能，并系统评估了K56-2基因组中glmS相关的attTn₇插入位点。所有四个鉴定的glmS位点都支持mini-Tn₇插入，但插入频率存在差异，其中glmS3是最常利用的位点。这表明glmS3可能是洋葱伯克霍尔德菌中进行稳定、单拷贝回补的有利基因组“着陆点”。本研究的一个实际优势是使用甲氧苄啶（TMP）作为单一筛选标记，同时用于等位基因交换和染色体回补，简化了克隆流程，避免了多重抗性标记的积累，为常规遗传操作提供了稳健实用的工具。

结论翻译：

总而言之，本研究确立了purM是洋葱伯克霍尔德菌中的一个关键代谢决定因素，其对生长和胞内适应性的菌株特异性效应凸显了该物种内显著的生理异质性。通过将等位基因交换和位点特异性回补整合到单一TMP筛选工具包中，本工作扩展了可用于研究这种固有耐药病原体代谢、适应性和毒力的分子遗传学能力，并提供了一个可适用于洋葱伯克霍尔德菌复合体其他成员及类似挑战性细菌物种的框架。