《Genes》：Forensic Validation of the 95K SNP Panel and the Parabon Fx Forensic Analysis Platform for Identification of US Military Unknowns Using Extended Kinship Inference
Jacqueline Tyler Thomas,
Courtney L. Cavagnino,
Kimberly Sturk-Andreaggi,
Ellen M. Greytak,
Julie A. Demarest,
Suzanne M. Barritt-Ross,
Timothy P. McMahon and
Charla Marshall
编辑推荐：
研究人员报告了一个雄性红鞭蛇（*Masticophis flagellum piceus*）的染色体水平基因组组装，该组装完全基于纳米孔测序生成。使用Hifiasm-ONT进行组装，RagTag进行支架抛光，研究人员生成了一个1.61 Gb的核基因组，包含8条
研究人员报告了一个雄性红鞭蛇（*Masticophis flagellum piceus*）的染色体水平基因组组装，该组装完全基于纳米孔测序生成。使用Hifiasm-ONT进行组装，RagTag进行支架抛光，研究人员生成了一个1.61 Gb的核基因组，包含8条大染色体和10条小染色体，BUSCO完整度评分为97.7%。利用LiftOn进行注释，发现19,832个位点，包括18,025个蛋白质编码基因。使用MitoHiFi组装、MitoFinder注释的线粒体基因组为17,119 bp，包含13个编码基因、22个tRNA和2个rRNA。所有测序均在模拟移动实验室中使用便携式测序仪和笔记本电脑进行，分析同时在本地和远程完成。这些结果突显了去中心化基因组学的可行性及其加速全球生物多样性研究的潜力。
**研究背景与问题**
当前高质量基因组时代的到来依赖于长读长测序技术和组装软件的进步，但这些工作通常需要在大型设施中完成，涉及昂贵的设备和复杂的信息学投入。然而，在偏远地区获取高质量样本并运输到测序中心而不降解，以及提取高分子量DNA（HMW DNA）的困难，严重限制了基因组学在资源匮乏社区的发展。此外，跨国样本收集与材料转移还涉及伦理和法律问题。为解决这些限制，研究人员尝试在野外模拟环境中使用便携式设备实现样本采集、处理、测序和组装的完整流程，以验证去中心化基因组学的可行性。
**研究内容与结论**
研究人员在模拟移动实验室（改装房车）中使用牛津纳米孔技术（ONT）P2 solo便携测序仪和笔记本电脑，对一只雄性红鞭蛇（*Masticophis flagellum piceus*）的尾组织样本进行DNA提取、文库构建和测序。共构建4个文库，运行4次测序，累计获得67×覆盖深度和18.3 kb的N50。使用Hifiasm-ONT进行de novo组装，结合RagTag基于近缘种*Masticophis lateralis*参考基因组进行支架连接，最终得到1.61 Gb核基因组，包含18条染色体（8条大染色体和10条小染色体），BUSCO完整度97.7%。LiftOn注释发现19,832个位点，其中18,025个为蛋白质编码基因；Earl Grey注释了转座元件家族。线粒体基因组利用MitoHiFi组装为17.12 kb，包含13个蛋白质编码基因、22个tRNA和2个rRNA。通过D-Genies点图与*Elaphe schrenckii*的比较显示染色体高度共线性。该研究发表在《Genes》期刊。
**主要关键技术方法**
（1）使用ONT LSK-114连接文库试剂盒和R10.4.1流动池在P2 solo便携测序仪上进行三代纳米孔测序；
（2）采用Hifiasm-ONT（v0.25.0-r726）进行de novo基因组组装，并通过RagTag（v2.1.0）基于近缘种参考基因组连接支架；
（3）利用LiftOn基于已注释的*Thamnophis sirtalis*基因组进行蛋白质编码基因注释，Earl Grey v6.3.5用于转座元件家族注释；
（4）线粒体基因组使用MitoHiFi（Galaxy v3.2.3）组装，MitoFinder进行基因注释，参考序列为*Elaphe bimaculata*（NC_024743.1）。样本来源为美国内华达州南部路杀个体（坐标36.435145, ?115.371807），无需许可。
**研究结果**
**3.1 核基因组组装与质量**
通过Hifiasm-ONT初始获得152个支架，经RagTag连接后减少至120个，其中18个被分配至染色体（8条大染色体、10条小染色体），102个未定位支架总长3.116 Mb（占 reads 的0.193%）。核基因组大小1.61 Gb，BUSCO完整度97.7%（S:11,015; D:19; F:148; M:112），优于多数现有蛇类基因组。
**3.2 染色体鉴定与性别决定**
按长度命名染色体为MFP_1至MFP_18，其中MFP_4基于CTNNB1基因存在被鉴定为Z性染色体，该基因杂合性表明样本为雄性。
**3.3 基因组注释**
LiftOn预测19,832个位点，18,025个为蛋白质编码基因，未在未定位支架中发现蛋白质编码基因。Earl Grey鉴定出转座元件（具体类型见表3）。与*E. schrenckii*的D-Genies比对显示高染色体共线性。
**3.4 线粒体基因组**
MitoHiFi组装线粒体基因组17.12 kb，包含13个蛋白质编码基因、22个tRNA和2个rRNA，与*Coluber constrictor*相似度89.15%，与*E. bimaculata*相似度82.98%。
**讨论与结论**
本研究表明，借助便携式测序仪、笔记本电脑和新软件工具，可在野外模拟条件下独立完成染色体水平基因组组装。核基因组的高BUSCO评分和线粒体基因的完整鉴定验证了方法的可靠性。当前主要限制在于ONT Dorado碱基调用速度和将数据传输到数据中心或互联网资源的速率，但新GPU设备、卫星通信提速以及在线分析平台（如Galaxy）的改进有望克服这些瓶颈。
**研究结论**：该研究证明，仅使用纳米孔测序在便携式测序仪和笔记本电脑上，于野外模拟条件下成功生成了核基因组和线粒体基因组。后续分析可通过Galaxy工具或机构数据中心完成。主要生物信息学进展包括Hifiasm-ONT对纳米孔读段进行错误校正和组装，以及RagTag整合剩余支架。基因组与其它蛇类的高质量比对、核基因组的BUSCO高分以及预期数量线粒体基因的鉴定表明，无需大型实验室即可实现低成本的基因组组装。长期读段来自现场新鲜提取的样本，而非冷冻组织后的制备，这与已有研究一致。当前主要限制是ONT Dorado碱基调用速度和数据传输速率，但新技术有望加速。野外基因组学，尤其是在偏远地区的广泛应用，将推动基因组学的民主化（[15]），这一愿景已接近实现。
