《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Collectin-11 regulates osteoclastogenesis and bone maintenance via a complement-dependent mechanism
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本综述揭示了免疫监视蛋白Collectin-11（CL-11）在调节破骨细胞（OCL）形成和维持成人骨骼稳态中的意外作用。研究表明，破骨细胞利用CL-11调控局部补体系统的活化，该过程的破坏会损害破骨细胞功能和骨重塑。这一机制在人类骨细胞中同样存在，解释了CL-11突变导致骨骼畸形（如3MC综合征）的原因，并提示CL-11依赖的补体信号通路是治疗破骨细胞功能障碍相关骨病的潜在靶点。
Collectin-11（CL-11）与补体系统在骨骼健康中的关键作用
引言：补体系统与骨骼发育的关联
骨骼的动态平衡依赖于骨形成细胞（成骨细胞）和骨吸收细胞（破骨细胞， OCL）的协调活动。近年来的研究不断揭示免疫系统与骨骼代谢之间的紧密联系。其中，补体系统作为先天免疫的重要组成部分，其多种成分在生长板、软骨细胞中均有表达，并参与骨折愈合等过程。人类发育障碍3MC综合征（Malpuech, Michels, Mingarelli, Carnevale综合征）的特征是骨骼畸形，并与模式识别分子Collectin-11（CL-11）的缺陷相关，然而其潜在的分子和细胞机制此前尚不明确。
CL-11：结构与功能
Collectin-11（CL-11）是一种可溶性的C型凝集素，与凝集素补体途径（LP）中的其他收集素（如Collectin-10和甘露糖结合凝集素MBL）类似，能够识别自身和非自身结构上的碳水化合物基序，从而激活凝集素补体途径。其基本结构单元是一个三链复合体，包含一个碳水化合物识别结构域（CRD）和一个胶原样结构域（CLD）。这些复合体可自组装成二聚体和三聚体（100-200 kDa），增强结合能力。CL-11与MBL相关丝氨酸蛋白酶（MASPs 1-3）物理结合，促进经典途径C3转化酶（C4bC2b）的形成，从而启动补体级联反应。MASP-2除了切割C4和C2，还能直接切割C3。而MASP-1基因编码的剪接受体变异体MASP-3等，可通过激活因子D间接影响替代途径（AP）。因此，CL-11/MASP复合物可以在其配体结合部位启动经典和替代途径的C3转化酶。补体活化最终产生过敏毒素（C3a, C5a）、调理素C3b和膜攻击复合物（MAC, C5b-9）。
双基因敲除小鼠模型揭示CL-11与补体的协同效应
为了深入研究CL-11触发的LP和AP之间的相互作用，研究人员构建了双敲除（DKO）小鼠模型，这些小鼠在Colec11基因缺失的同时，还缺失了Masp-2（LP）、Cfb（补体因子B；AP）或C3（两条途径共有）中的一个。研究发现，单独敲除CL-11、MASP-2、CFB或C3的单敲除（SKO）小鼠并未出现明显的骨骼表型。然而，在缺失CL-11的同时再缺失C3、CFB或MASP-2的DKO小鼠中，有23%至28%的个体在12周龄时出现了脊柱后凸和/或侧弯。而CL-11基因完好的C3-/-/Masp-2-/-DKO小鼠则没有此现象。这表明CL-11的缺失本身并不足以导致骨骼异常，但若同时伴有第二个补体活化关键成分的缺失，则会显著诱发脊柱畸形。
骨骼表型的详细表征
对患病DKO小鼠的解剖和骨骼染色（阿尔新蓝和阿利新红染色）证实了脊柱畸形，并显示骨骼与软骨之间的界限变得模糊。全身微型计算机断层扫描（μCT）进一步突出了骨骼异常，其中椎体受影响最为严重，出现从孤立缺陷到广泛结构破坏的多处小病灶，腰椎和胸椎区域受损最重。相反，肩胛骨和骨盆骨仅表现出轻微缺陷，而股骨和颅骨则未受影响。组织学分析显示，患病的Colec11-/-DKO小鼠脊柱椎体出现显著的小梁骨丢失，并伴有骨髓脂肪组织增多的区域，同时椎间盘的髓核（NP）发生退行性变。
胚胎发育期CL-11与补体的作用
为了探究这些缺陷是否起源于胚胎发育期，研究人员检查了Colec11-/-/C3-/-小鼠的胚胎组织。尽管在野生型胚胎椎体中CL-11和C3广泛表达，但在E13.5至E18.5期间，光镜检查并未发现明显的形态学异常。CL-11和C3的染色在软骨细胞聚集区域显著，随后局限于初级骨化中心。对膜攻击复合物（MAC）形成的检测（通过C9特异性抗体）显示，在野生型组织中，从E13.5到E18.5可动态检测到C9聚集体，而Colec11-/-/C3-/-胚胎在所有检测阶段均显示C9染色显著减少。然而，单独的Colec11-/-SKO胚胎并未显示C9染色的显著下降。这表明，只有CL-11和C3同时缺失才会损害MAC的形成，但在E18.5时并未造成明显的形态学后果。
破骨细胞分化依赖于CL-11及C3或CFB
骨骼表型在出生后（≥12周）出现，提示缺陷可能在于骨骼维持而非发育，因此研究聚焦于破骨细胞（OCL）——一种专门负责骨重塑并对补体效应物敏感的细胞。利用来自不同基因型小鼠的骨髓源性干细胞（BMSCs）进行体外破骨细胞分化实验。野生型BMSCs能高效分化出成熟的、多核的破骨巨细胞，这些细胞表达破骨细胞相关受体OSCAR，且抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色阳性，同时CL-11的检测也增加。相比之下，Colec11-/-/C3-/-BMSCs的多核破骨细胞形成显著减少。同样，Colec11-/-/Cfb-/-的前体细胞也基本无法分化为成熟的破骨细胞。而来自Colec11-/-SKO小鼠的破骨细胞仅显示出数量和规模的适度减少。对MAC形成的专门检查发现，在Colec11-/-/C3-/-的髓系子代细胞中，MAC沉积（通过C9染色评估）显著受损。这些数据表明，高效的破骨细胞分化需要依赖于CL-11的补体活化，并由C3或CFB支持，最终汇聚于MAC的形成。
外源性CL-11恢复破骨细胞分化
为确定CL-11是否直接支持破骨细胞分化，研究在Colec11-/-/C3-/-和Colec11-/-/Cfb-/-的BMSC培养物分化培养基中补充了重组CL-11（rCL-11）。这一处理部分恢复了CL-11结合，并显著增加了多核破骨巨细胞的存在。经rCL-11处理的Colec11-/-/C3-/-BMSCs中，每个破骨细胞平均细胞核数量增加。细胞表面的MAC形成也得到部分挽救。值得注意的是，即使在缺乏外源性C3的情况下，rCL-11也能恢复MAC形成，这提示了CL-11下游存在一种不依赖于C3的旁路活化机制，可以直接激活补体终末途径。
CL-11与补体在生命全程中与破骨细胞相互作用
基于上述体外数据，研究人员推测在生理条件下，CL-11与破骨细胞的相互作用可促进补体活化和破骨细胞分化。对未经处理的野生型小鼠骨切片进行分析发现，大型多核TRAP+破骨细胞对CL-11和聚合C9（经TCC标记物确认）呈强阳性。同样，在正常胚胎骨骼处于不同破骨细胞前体发育阶段时，CL-11和C9定位于椎体雏形内的细胞聚集区域。这些发现强有力地支持了CL-11、MAC组装和破骨细胞分化之间的功能联系。数据表明，从胚胎骨骼发育到成体骨骼维持，CL-11和补体调节着破骨细胞生成。慢性破坏这一通路会导致椎体病理变化，正如在小鼠模型中观察到的，在12-13周龄时出现病变。
人类诱导多能干细胞（iPSC）来源的破骨细胞分化受CL-11和补体调控
为确认临床相关性，研究利用人诱导多能干细胞（iPSCs）分化的破骨细胞进行了补充实验。通过CRISPR-Cas9基因组编辑，研究人员创建了配对的人类CL-11缺失克隆。分化实验显示，CL-11缺失显著损害了破骨细胞分化，而向分化培养基中补充重组CL-11可部分挽救此缺陷。此外，使用Mirococept（一种基于补体受体-1的C3和C5转化酶抑制剂）处理显著减少了破骨细胞的形成，这证明了正常的人类破骨细胞分化是补体依赖性的。这些数据表明，CL-11和补体活化共同调控着人髓系细胞的破骨细胞分化。值得注意的是，与小鼠系统相比，人类系统对CL-11和C3的个体效应更为敏感。
讨论与意义
本研究结果表明，缺失CL-11的小鼠会发展出与年龄相关的椎体骨丢失，但前提是必须同时至少缺失一个凝集素或替代补体途径的关键成分。这种双重缺陷与骨髓培养物中破骨细胞分化受损相关，而通过补充生理浓度的重组CL-11可基本恢复分化能力。在正常骨骼的破骨细胞和前体细胞上存在CL-11和膜攻击复合物，进一步支持了CL-11作为破骨细胞分化的生理调节因子，在生命全程的骨重塑中发挥作用。并非所有具有易感DKO基因型的小鼠都会发展出明显疾病，这可能反映了遗传与环境因素之间的相互作用。病变最突出的部位是腰-胸椎脊柱，提示日常活动（如进食、理毛）中的重复性机械负荷可能促使疾病表现。
本研究所观察到的骨骼异常需要同时缺失CL-11和另一个补体活化成分。冗余性是补体系统的标志，确保了通过多条途径有效转化C3和C5。这种复杂性可能解释了为何需要一个额外的活化途径缺陷（如CFB、MASP-2、C3）才会导致骨修复机制失效。本小鼠模型的表型比大多数报告的3MC综合征患者更为特异，后者通常表现为多种发育缺陷。本模型聚焦于破骨细胞，揭示了一种不同的CL-11调控的细胞机制。观察到的骨小梁丢失、骨髓脂肪增多和椎间盘髓核退化，与间充质（如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞）和造血（如破骨细胞）谱系的失调相符。
在野生型胚胎中，从E13.5到E18.5可见补体活化，并且在E13.5的软骨细胞上检测到MAC形成——这与E18.5初级骨化之前的软骨原基形成时期相吻合。DKO胚胎从E13.5到E18.5的MAC形成减少，可能损害了软骨内成骨过程，使其在成年后易受机械应力诱导的骨退化影响。骨髓基质细胞和单核-巨噬细胞谱系产生补体成分（如CL-11、C3、CFB），调节局部微环境。分化实验中没有添加外源性补体（挽救研究中的rCL-11除外）。考虑到CL-11基因表达和检测到的补体活化产物（C3d, MAC），研究人员提出，局部产生的补体蛋白调控着髓系前体细胞向破骨细胞的分化。因此，破骨细胞及其前体很可能通过分泌CL-11和其他补体因子进行自我调控，参与破骨细胞的更新和骨骼维持。
利用iPSC来源的人破骨细胞进行的原理验证性研究加强了这些发现的临床相关性。此外，实验表明人破骨细胞对CL-11单独的效应表现出更高的敏感性，这与3MC综合征的临床表型一致，在该综合征中，有缺陷的骨形成通常源于单独的CL-11或MASP-1缺陷。
总之，本研究确定了CL-11在调控髓系前体细胞向破骨细胞分化中的功能。该功能依赖于与其他凝集素或替代途径成分的协同作用；若缺失此协同，骨骼完整性会随年龄增长而恶化。本模型为理解CL-11突变和补体信号缺失如何导致人类骨骼异常提供了见解，并提示3MC综合征的机制超出了胚胎神经嵴细胞迁移的范畴。反过来，过度的破骨细胞活性是肾病性骨营养不良、骨质疏松症和侵蚀性骨关节炎等疾病的标志，目前针对破骨细胞分化因子RANKL的单克隆抗体药物已进入临床使用或正在评估中。本研究提示，CL-11也可能成为此背景下的一个潜在治疗靶点。
