《Biomaterials》：Engineered bacteriophage nanoassemblies in vivo stabilize DC–T cell immune synapse for high-performance influenza vaccination
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纳米疫苗递送系统通过靶向增强树突状细胞-T细胞免疫突触稳定性显著提升流感疫苗效力，并诱导长期免疫记忆。
辛禾夏|周旭|宋瑞龙|王伟杰|李玉丽|徐玲|环长超|曹鹏|陈刚
中国山东省创新整合医学神经肿瘤学重点医疗与健康实验室，青岛市中心医院，健康与康复科学大学，青岛，266042
摘要
树突状细胞（DCs）对T细胞的激活需要形成一个稳定的免疫突触（IS）。本研究的目的是通过靶向调节体内DC-T细胞之间的突触相互作用来开发一种疫苗接种方法。我们构建了噬菌体纳米组装体，将编码抗原的序列递送到DC细胞质中，从而增强体内DC-T细胞突触的稳定性，进而提高疫苗效力。具体来说，将流感血凝素干细胞基因插入噬菌体基因组，并将靶向DC的肽融合到噬菌体侧壁。然后，噬菌体作为表面活性剂覆盖疏水颗粒，在这些颗粒中封装了钠/质子泵抑制剂，以调节细胞间粘附分子1（ICAM-1）在膜上的定位，从而稳定突触。这种尺寸可控的纳米组装体通过激活NF-κB、PI3K-AKT和RhoA-ROCK信号通路来抑制ICAM-1的内化。用这种纳米组装体进行免疫接种后，能够触发强烈的T细胞和抗体反应，对抗流感病毒，使受感染的小鼠获得完全保护并形成长期免疫记忆。总之，我们的结果强调了通过靶向增强体内DC和T细胞之间的突触稳定性来提高疫苗保护效力的可行性。鉴于噬菌体纳米组装体的灵活性和通用性，它们可以很容易地被用于开发针对其他病原体的各种疫苗配方。
引言
核酸疫苗作为尖端的生物技术创新，在治疗和预防应用中展现出巨大潜力[1]，[2]。然而，有效的递送对于实现其免疫效力至关重要，而这在很大程度上依赖于递送平台的设计[3]，[4]。尽管最近人们对非病毒载体（如用于mRNA疫苗递送的脂质纳米颗粒）产生了浓厚兴趣，但仍存在一些不可避免的挑战，限制了它们的广泛应用，例如在肝外靶向和细胞质递送方面的困难，甚至在接种后会引起疼痛和炎症[5]。用于核酸疫苗递送的真核病毒载体，尤其是腺病毒平台，也面临许多挑战，包括致癌风险和遗传毒性等安全问题。此外，核酸疫苗的生产、运输和储存条件非常严格，这突显了迫切需要高效、安全和方便的载体来促进其发展[6]，[7]。
M13噬菌体是一种原核病毒纳米纤维，其基因组可修改且表面结构可扩展，逐渐显示出在核酸递送和肽展示方面的巨大潜力[8]。它的基因组具有高度的可塑性和可操作性，不仅使M13噬菌体能够作为核酸递送载体，还能在病毒表面展示特定的靶向基团或抗原[9]。此外，M13噬菌体基因组中富含胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤基序，赋予其佐剂效应。这种多功能性使得M13噬菌体在作为递送系统时，既能作为载体递送疫苗，又能作为佐剂增强免疫反应，从而在疫苗开发中具有独特优势[10]。与真核病毒不同，噬菌体（通常称为原核病毒）具有宿主特异性，只能感染特定的细菌菌株[9]，[11]。因此，它们无法感染哺乳动物细胞，这保证了其作为治疗手段时的安全性。此外，噬菌体成本低廉，且可以通过细菌在几小时内大规模生产，有利于广泛的应用[12]。
树突状细胞（DCs）被认为是最强大的抗原呈递细胞，在激活T细胞免疫反应中起着关键的桥梁作用，被认为是疫苗递送的目标细胞[13]。除了调节DC成熟和抗原呈递外，关注DC-T细胞相互作用是提高疫苗效力的有效方法[14]，[15]。先前的研究表明，经过糖聚合物修饰的DCs可以增强DC和T细胞之间的粘附，从而提高DC疫苗的效果[16]，[17]。DC和T细胞之间的结合强度直接决定了抗原呈递效率以及随后的T细胞激活[18]。DC上的细胞间粘附分子1（ICAM-1）与T细胞上的淋巴细胞功能相关抗原1（LFA-1）结合，在DC-T细胞界面形成免疫突触（IS），在DC-T细胞聚集过程中起着关键作用[19]。在IS中，ICAM-1/LFA-1与TCR-肽负载的MHC簇的结合稳定了DC-T细胞界面，促进了T细胞的启动[20]。此外，ICAM-1不断被内化并重新循环到IS界面。改善ICAM-1在膜上的定位有助于稳定IS的稳定性，从而促进DC-T细胞之间的相互作用[21]。在疫苗相关研究中，用氧化石墨烯纳米片改性的DC疫苗通过调节ICAM-1在膜上的定位来增强IS的形成，从而提高疫苗效力[22]。然而，尽管体外制备的DC疫苗取得了进展，但在体内如何实现靶向增强IS稳定性以增强疫苗效力方面仍鲜有研究。
在这项研究中，我们利用M13噬菌体同时实现了递送核酸疫苗和稳定DC-T细胞IS的目标（图1A至B）。首先，对M13噬菌体进行基因工程改造，使其携带流感病毒的血凝素（HA）干细胞基因，并在侧壁展示靶向DC的肽。随后，这种工程化的噬菌体与聚（4-乙烯基吡啶）（P4VP）自组装形成核壳纳米组装体，并封装钠/质子泵抑制剂，以增加ICAM-1在膜上的定位，从而稳定IS。系统评估显示，噬菌体纳米组装体显著提高了DC抗原呈递效率和T细胞激活。通过多项体内实验，我们验证了噬菌体纳米组装体对流感病毒感染模型的有效保护作用。本研究提供了一种基于工程化噬菌体配方、通过体内靶向增强IS稳定性来提高疫苗效力的新途径。
节选
噬菌体纳米组装体的制备和表征
为了使用M13噬菌体在真核细胞中表达编码抗原的基因，将腺相关病毒的初始转录区域（ITR）插入噬菌体基因组中，以转导流感病毒的HA干细胞基因。然后，将靶向DC的肽（DCpep，针对CD11c）的序列引入噬菌体基因组，使其展示在主要包膜蛋白pVIII的N端（图S1）。所有构建物均经过验证
结论
尽管在DNA疫苗载体用于体内递送方面取得了显著进展，但在临床转化中仍存在挑战，包括免疫激活不足和保护效力短暂。作为一种新型的病毒衍生生物材料，M13噬菌体兼具免疫佐剂和递送载体的双重功能，使其成为一种高效的疫苗递送系统。此外，它的基因可编辑性、较大的表面积和结构特性
伦理声明
所有在小鼠身上进行的动物实验（202310008）均获得了扬州大学实验动物资源中心机构动物护理和使用委员会的批准。雌性BALB/c小鼠购自兽医学院比较医学研究所。所有小鼠均饲养在无特定病原体的环境中，每笼最多饲养六只小鼠，并保持在恒定湿度和温度的环境中，光照/黑暗周期为12小时。所有实验
作者贡献声明
宋瑞龙：方法学、研究、数据分析。王伟杰：研究。李玉丽：研究。徐玲：方法学。辛禾夏：撰写——初稿、验证、方法学、研究、数据分析。周旭：方法学、数据分析。环长超：撰写——审稿与编辑、监督。曹鹏：撰写——审稿与编辑、监督。陈刚：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、资金支持
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了中国国家重点研发计划（资助编号：2023YFC2308200）、国家自然科学基金（资助编号：31900993）、山东省青年泰山学者计划（资助编号：tsqn202507257）、山东省自然科学基金（资助编号：ZR2023MH352、ZR2025MS1498）以及山东省高校青年科技创新计划（资助编号：2024KJJ039）的支持。
