《Genes & Diseases》：TRAF6 inhibition suppresses vasculogenic mimicry in oral squamous cell carcinoma via targeting IL-33/ST2L-induced EMT
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本刊推荐：抗血管生成疗法在口腔鳞癌（OSCC）中疗效受限，血管生成拟态（VM）可能是关键抵抗机制。本研究聚焦IL-33/ST2L信号轴，通过多组学分析与功能实验，首次揭示其通过激活TRAF6/NF-κB通路驱动上皮-间质转化（EMT）与VM形成。研究发现TRAF6抑制剂C25-140可有效抑制VM，且与贝伐珠单抗联用展现出显著优于单药的抗肿瘤效果，为克服OSCC抗血管治疗耐药提供了新的潜在联合策略。
口腔癌是全球第18位最常见的癌症，其中超过90%为口腔鳞状细胞癌（Oral Squamous Cell Carcinoma, OSCC）。尽管治疗手段不断进步，OSCC患者的5年生存率在过去几十年中一直停滞在50%左右，寻找更有效的治疗策略迫在眉睫。靶向肿瘤血管生成是癌症治疗的一个重要方向，但单纯的抗血管生成疗法往往无法带来长期的生存获益。这背后，一种名为“血管生成拟态”（Vasculogenic Mimicry, VM）的“狡猾”机制逐渐浮出水面。VM是指侵袭性肿瘤细胞自身“变身”，模拟内皮细胞形成全新的、不依赖于血管内皮细胞的管腔样结构，为肿瘤输送养分。它的存在与肿瘤分化差、分期晚、转移和复发率高密切相关，也被认为是导致抗血管治疗耐药的重要原因之一。然而，在OSCC中，驱动VM形成的具体分子机制尚不完全清楚，靶向VM的疗法也缺乏深入探索。
为了解开OSCC中VM的调控之谜，并为克服临床治疗耐药提供新思路，由Wendong Wan、Liwei Ma、Xing Gao等人组成的研究团队开展了一项系统研究，相关论文发表在《Genes 》上。他们发现，炎症因子IL-33及其受体ST2L（由IL1RL1基因编码）构成的信号轴是驱动OSCC发生VM的关键“引擎”。该信号轴通过激活下游的TRAF6/NF-κB信号通路，强力推动肿瘤细胞发生上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT），进而获得形成VM管道的能力。更有趣的是，肿瘤微环境中常见的缺氧条件，会通过激活缺氧诱导因子-1α（Hypoxia-Inducible Factor-1α, HIF-1α）来上调ST2L的表达，从而将缺氧、炎症信号与VM形成紧密串联起来。最重要的发现在于治疗策略：研究人员使用一种名为C25-140的TRAF6小分子抑制剂，在动物模型中成功抑制了VM的形成；当C25-140与临床常用的抗血管生成药物贝伐珠单抗联用时，产生了“1+1>2”的协同抗肿瘤效果，显著优于贝伐珠单抗单药治疗。这项研究不仅深入揭示了OSCC中VM形成的新机制，更指出了一个极具潜力的临床治疗新方向——即通过靶向TRAF6来抑制VM，从而增强现有抗血管疗法的疗效。
为开展此项研究，作者运用了多项关键技术与方法。研究队列包含从2017年至2019年间收集的OSCC患者肿瘤样本及配对癌旁正常黏膜样本，所有患者未接受过放化疗或靶向治疗。关键技术包括：1）转录组测序（Bulk mRNA sequencing）与生物信息学分析（如差异表达分析、基因集富集分析GSEA、基因集变异分析GSVA），用于鉴定VM相关基因和信号通路；2）免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）与CD31/过碘酸希夫（Periodic Acid-Schiff, PAS）双重染色，用于在组织水平检测蛋白表达与鉴定VM管道（CD31阴性、PAS阳性）；3）体外功能实验，如细胞增殖（CCK8法）、细胞划痕愈合（Wound healing）、平板克隆形成（Colony formation）以及三维基质胶Tube formation assay（用于评估VM形成能力）；4）分子生物学技术，包括蛋白质印迹（Western blotting）、实时定量PCR（Quantitative real-time PCR, qPCR）、免疫荧光（Immunofluorescence）以及双荧光素酶报告基因实验（Dual-luciferase assay），用于验证信号通路和基因调控关系；5）基因操作技术，如利用小干扰RNA（siRNA）和慢病毒载体介导的基因敲低（shRNA）与过表达；6）动物模型，通过建立OSCC细胞系的BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型，进行体内药效评价。
研究结果
转录组分析揭示OSCC中VM形成的关键线索
研究人员首先对3例VM阳性（VM+）、4例VM阴性（VM-）的OSCC肿瘤组织及3例正常组织进行了mRNA测序。主成分分析显示，VM状态是区分OSCC样本的关键因素。动态表达模式分析和富集分析均一致表明，VM+的OSCC中炎症相关信号通路显著激活，特别是肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-alpha, TNF-α）通过核因子κB（Nuclear Factor-kappa B, NF-κB）的信号传导、细胞因子-细胞因子受体相互作用等通路高度富集，提示炎症在VM形成中扮演重要角色。
ST2表达与OSCC的VM及不良预后相关
通过交叉分析测序数据与公共数据库（TCGA），研究筛选出7个在VM+肿瘤中共同上调的基因。其中，编码ST2的基因IL1RL1引起了研究人员的注意。生存分析显示，IL1RL1高表达与头颈鳞癌患者更差的总生存期相关，且其表达水平随临床T分期进展而升高。在OSCC细胞中进行基因功能验证时，发现仅敲低IL1RL1能显著抑制肿瘤细胞形成VM管状结构的能力。对34例OSCC患者组织的免疫组化分析进一步证实，ST2蛋白在肿瘤组织中高表达，且其高表达与VM阳性状态、晚期T分期以及经典VM标记物VE-钙粘蛋白（VE-cadherin）、基质金属蛋白酶2（Matrix Metalloproteinase 2, MMP2）的高表达显著正相关。
VM受OSCC细胞中IL-33/ST2L轴调控
在细胞实验中，给予IL-33刺激能显著增强OSCC细胞的增殖、迁移、克隆形成以及VM管状结构形成能力，并上调VM相关标记物（VE-cadherin, MMP2）以及内皮/淋巴标记物（CD31, LYVE-1）的表达。相反，敲低IL1RL1基因后，IL-33对上述恶性表型的促进作用被显著削弱。这表明IL-33/ST2L信号轴直接调控了OSCC细胞的VM形成能力。
TRAF6抑制在体外 suppresses IL-33/ST2L触发的VM和EMT
EMT是VM过程的关键。本研究发现IL-33刺激可诱导OSCC细胞发生EMT（E-钙粘蛋白下调，N-钙粘蛋白、波形蛋白上调），而这一效应依赖于ST2L。机制上，IL-33/ST2L激活了其下游关键的接头蛋白TRAF6，进而启动了NF-κB信号通路。使用特异性的TRAF6抑制剂C25-140处理，可以剂量依赖性地阻断IL-33诱导的NF-κB活化，并逆转IL-33对细胞迁移、VM形成以及VM/EMT相关标记物表达的促进作用。过表达TRAF6则能挽救C25-140的抑制效果，证实了TRAF6在该通路中的核心地位。
HIF-1α诱导OSCC细胞中IL-33/ST2L的表达
缺氧是肿瘤微环境的特征，也是VM的重要驱动因素。研究发现，在TCGA数据和OSCC患者样本中，HIF-1α与IL-33、ST2的表达均呈正相关。在细胞模型中，用缺氧模拟剂氯化钴（CoCl2）处理可上调IL-33和ST2的表达；敲低HIF1A则能减弱缺氧诱导的ST2L上调。进一步的荧光素酶报告基因实验证实，HIF-1α可以直接结合到IL1RL1基因的启动子区域并激活其转录。这表明肿瘤缺氧通过HIF-1α上调了ST2L的表达，从而将缺氧信号与IL-33/ST2L驱动的VM通路连接起来。
靶向TRAF6的策略减轻VM并增强OSCC中抗血管生成治疗的疗效
最后，研究在动物模型中验证了靶向治疗的潜力。在OSCC移植瘤裸鼠模型中，与对照组或单药治疗组相比，TRAF6抑制剂C25-140与贝伐珠单抗的联合治疗显著抑制了肿瘤的生长。组织学分析显示，贝伐珠单抗单药虽减少了CD31阳性的内皮血管，却意外地增加了VM管道的数量（一种可能的补偿性耐药机制）；而C25-140单药或联合治疗则能有效抑制VM的形成。联合治疗组表现出最少的CD31阳性血管和VM结构，同时VM标记物下调，EMT标记物E-钙粘蛋白上调，NF-κB活性（核p65）也被抑制。这证明抑制TRAF6可以通过阻断VM来增强抗血管生成药物的疗效。
研究结论与讨论
本研究系统阐明了缺氧-HIF-1α-IL-33/ST2L-TRAF6/NF-κB信号轴在促进OSCC血管生成拟态（VM）形成中的核心作用。该轴心信号将肿瘤微环境中的缺氧和炎症刺激，与肿瘤细胞的EMT及血管拟态塑性紧密联系起来，为OSCC的侵袭进展提供了新的机制解释。其最重要的临床意义在于提出了一个克服抗血管生成治疗耐药的新策略：靶向TRAF6。研究结果表明，特异性抑制TRAF6的E3泛素连接酶活性，能够有效阻断IL-33/ST2L介导的NF-κB信号传导，从而抑制VM的形成。在临床前模型中，TRAF6抑制剂C25-140与贝伐珠单抗的联合疗法展现出了协同抗肿瘤效应，其效果显著优于贝伐珠单抗单药。这提示，在传统抗血管治疗基础上，联合抑制VM形成通路（如靶向TRAF6），有望打破肿瘤的血管代偿机制，为改善OSCC患者预后、特别是克服抗血管治疗耐药提供一种有前景的治疗组合。当然，研究也存在一定局限性，例如VM阳性样本量有限，联合疗法的安全性与有效性仍需在更接近临床的模型（如患者来源类器官）中进一步验证。此外，TRAF6在肿瘤免疫微环境中的作用及抑制可能带来的免疫相关影响，也是未来需要关注的方向。尽管如此，这项研究无疑为深入理解OSCC的血管化机制和开发新型联合疗法奠定了重要的理论基础。
