《Genes & Diseases》：Inflammasome activation and signalling in the ischemic-reperfused myocardium
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这篇综述聚焦于心肌缺血/再灌注损伤(MI/RI)的核心病理机制——炎症小体的激活与信号传导。文章系统梳理了经典与非经典炎症小体的分类、结构与生物学功能，重点探讨了它们在MI/RI中细胞特异性、时空动态性的激活模式及其导致细胞焦亡和组织损伤的分子机理。此外，本文也深入分析了氧化应激、离子流、线粒体功能障碍与自噬等对炎症小体激活的调控作用，并对靶向炎症小体通路的治疗潜力及其在临床转化中的前景与挑战进行了全面展望。
心肌缺血/再灌注损伤是全球范围内导致住院和死亡的首要原因。当心肌血流中断后，再灌注治疗是挽救缺血心肌的关键，但恢复血流本身也可能引发再灌注损伤，导致进一步的心肌损伤和心肌细胞死亡。焦亡，作为一种由炎症级联反应，特别是炎症小体组装触发的调节性细胞死亡方式，在其中扮演了关键角色。
炎症小体的分类、结构与生物学功能
炎症小体是能够响应多种感染或损伤信号的大型蛋白复合物。经典的炎症小体结构由模式识别受体(PRR)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和caspase-1组成。多种PRR可作为炎症小体的启动蛋白，包括属于NLR家族的NLRP1、NLRP3、NLRC4等，以及AIM2和pyrin。它们在结构、激活关键分子、组织表达和生理功能上各有特点，并与多种疾病相关。例如，NLRP3是研究最深入、功能最广泛的炎症小体，参与免疫/损伤监视，并与慢性炎症性疾病、2型糖尿病和神经退行性疾病等相关。
经典炎症小体
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NLRP1/CARD8：首个被发现的炎症小体。在心肌缺血/再灌注损伤中，内质网应激可通过核因子κB(NF-κB)信号激活NLRP1炎症小体。
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NLRP3：其激活通过经典通路分两步进行。第一步是“启动”步骤，由配体与PRR或细胞因子受体结合，激活NF-κB等转录因子，上调炎症小体组分的蛋白水平。第二步是“激活”步骤，多种刺激物（如细胞外ATP、晶体物质等）引发钾离子(K+)外流、线粒体功能障碍、溶酶体损伤和氧化应激等细胞事件，促使NLRP3构象改变，暴露PYD结构域，进而募集ASC并形成丝状结构。ASC再通过CARD-CARD相互作用募集pro-caspase-1，使其自剪切活化。活化的caspase-1切割pro-IL-1β、pro-IL-18和gasdermin D(GSDMD)。GSDMD的N端片段在质膜上成孔，释放IL-1β和IL-18。神经损伤诱导蛋白1(NINJ1)则介导质膜破裂，释放乳酸脱氢酶(LDH)和高迁移率族蛋白B1(HMGB1)。
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NLRC4：其特征是响应病原体感染。在心肌缺血/再灌注损伤的大鼠模型中，NLRC4炎症小体蛋白表达在心肌梗死后急性增加。
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AIM2：作为胞质DNA的感受器。在病理情况下，AIM2可检测胞质中积累的自身DNA（如受损线粒体释放的mtDNA），从而诱导炎症反应。
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Pyrin：能够感知细胞骨架动力学的破坏。病原体释放的细菌毒素会破坏RhoA GTPase的功能，导致pyrin去磷酸化并激活炎症小体。
非经典与替代炎症小体通路
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非经典炎症小体：其PRR是caspase-4/5/11，可直接感知脂多糖(LPS)。活化的caspase-4/5/11切割GSDMD引发细胞焦亡，但自身不切割pro-IL-1β。GSDMD切割诱导的K+外流可激活NLRP3炎症小体，进而导致IL-1β分泌。在心肌缺血/再灌注损伤中，caspase-4/11的活性和GSDMD的表达上调。
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替代炎症小体通路：主要在人类单核细胞中发现。LPS单独即可通过TLR4–TRIF–RIPK1–FADD–CASP8通路诱导IL-1β分泌，此过程不依赖K+外流、焦亡小体形成和细胞焦亡，但需要NLRP3、caspase-1和ASC。
炎症小体的激活
炎症小体的激活需要“启动”步骤，由病原相关分子模式(PAMP)、损伤相关分子模式(DAMP)或细胞因子等启动刺激物诱导，通过Toll样受体或细胞因子受体激活NF-κB信号通路，上调炎症小体组分的转录。同时，启动信号还会导致炎症小体蛋白的翻译后修饰，为激活“颁发许可”。这些翻译后修饰（如磷酸化、泛素化、SUMO化、棕榈酰化）是调节炎症小体激活的关键机制。
炎症小体激活的触发因素
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活性氧(ROS)：被认为是NLRP3组装的潜在共同机制。高细胞ROS水平可能使硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)与硫氧还蛋白解离，从而激活NLRP3。在心肌缺血/再灌注损伤模型中，下调TXNIP可减少NLRP3激活和梗死面积。
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离子流：K+外流与NLRP3启动密切相关。NLRP3激活剂如尼日利亚菌素或细胞外ATP会通过P2X7和TWIK2通道诱导K+外流。高细胞外K+可阻断由炭疽致死毒素处理诱导的NLRP1炎症小体激活。细胞内K+下降对NLRC4的激活也很重要。钙离子(Ca2+)流也被认为与NLRP3炎症小体激活有关。
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线粒体功能障碍：与mtDNA泄漏和线粒体ROS生成密切相关。线粒体功能障碍导致mtDNA释放，氧化后的mtDNA可直接结合NLRP3，导致炎症小体激活。异常的线粒体伸长可能促进NLRP3激活，而线粒体融合则可能起相反作用。
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自噬：作为维持稳态的重要分解代谢途径，与炎症小体激活相互关联。自噬可以清除受损的线粒体，减少来自线粒体的NLRP3激活剂（线粒体ROS和mtDNA）的释放，自噬抑制可能促进NLRP3炎症小体激活。此外，自噬还通过靶向降解其分子成分来调节炎症小体信号。
GSDMD和NINJ1在焦亡中的作用
炎症小体激活导致GSDMD活化和细胞焦亡。活化的caspase-1或caspase-11切割GSDMD，释放出的GSDMD-NT与质膜脂质成分结合，形成寡聚孔道，破坏离子梯度，并释放成熟的IL-1β和IL-18。然而，GSDMD形成的孔道不能释放LDH或HMGB1等高分子量DAMP。NINJ1被证实可介导包括焦亡在内的裂解性细胞死亡中的质膜破裂。NINJ1缺陷不影响GSDMD孔的形成、IL-1β的释放、细胞肿胀或死亡，但会损害质膜破裂。
炎症小体在心肌缺血/再灌注损伤后心肌细胞焦亡中的作用
焦亡是导致心功能障碍的心肌细胞死亡类型之一。越来越多的证据表明，炎症小体介导了缺血/再灌注诱导的心肌细胞焦亡。心肌缺血/再灌注损伤提供了炎症小体激活所需的启动信号和触发刺激。
目前，尽管已发现多种不同的炎症小体，但大多数研究集中在NLRP3炎症小体如何导致心肌缺血/再灌注损伤引起的心肌组织焦亡，仅有少数研究报告了caspase-11和AIM2在缺血/再灌注条件下的作用。
研究表明，缺血/再灌注触发NLRP3炎症小体的启动事件，并促进NLRP3、ASC、pro-caspase-1和pro-IL-1β的表达。NLRP3缺陷小鼠的心脏在经历体外缺血/再灌注损伤后，显示梗死面积减小，冠状动脉流量和收缩功能改善。NLRP3的敲低可减少活化的caspase-1、IL-1β和IL-18，从而减轻心肌损伤。
关于炎症小体激活的时间动态，研究发现，在小鼠缺血/再灌注模型中，NLRP3的表达在再灌注后6小时和24小时比3小时后增加。另一项使用大鼠模型的研究仅在再灌注1小时后检测到NLRP3表达增加、caspase-1激活和IL-1β产生，表明NLRP3的激活在再灌注后并未延迟。
心肌缺血/再灌注损伤是一个涉及多种不同细胞的过程。大量研究表明，缺氧/复氧可在体外激活大鼠心肌细胞中的NLRP3，刺激IL-1β成熟并导致焦亡。然而，也有一些研究提出了不同的观点。在心肌缺血/再灌注损伤的小鼠模型中，再灌注后3天，梗死边缘区的非心肌细胞中ASC的表达高于心肌细胞。一项研究表明，在心肌细胞中，缺氧/复氧诱导的GSDMD依赖性焦亡是由caspase-11而非caspase-1介导的，释放的是IL-18而非IL-1β。再灌注后，在啮齿类动物左心室心肌中观察到caspase-11激活和GSDMD切割。因此，caspase-11炎症小体途径可能是介导心肌缺血/再灌注损伤后心肌细胞焦亡的关键途径。在心肌细胞中检测到NLRP3激活，可能源于使用了新生心肌细胞，其中未完全去除的其他细胞类型（如成纤维细胞）可能影响了结果。
在另一项对新生小鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞进行脂多糖加缺氧/复氧处理的研究中，证明是成纤维细胞而非心肌细胞产生IL-1β和IL-18。抑制ROS和K+外流可抑制炎症小体激活并减少IL-1β产生。在小鼠心肌梗死模型中，观察到梗死心肌中NLRP3、IL-1β和IL-18的表达增加，主要发生在非心肌细胞中。另一项应用小鼠缺血/再灌注模型的研究也表明，NLRP3主要位于心脏成纤维细胞中。除了成纤维细胞，在缺氧/复氧后，在小鼠内皮细胞中也观察到NLRP3表达增加和IL-1β产生。最近的一项研究观察到，在内皮细胞中特异性敲除NLRP3可以减少缺血/再灌注后的梗死面积，并降低IL-1β和IL-18的产生。心肌缺血/再灌注损伤后NLRP3的激活可能主要与氧化应激有关。
除了心脏常驻细胞，免疫细胞也是心肌缺血/再灌注损伤过程的重要参与者。再灌注后6小时可观察到巨噬细胞和中性粒细胞浸润。在小鼠急性心肌梗死后，可在白细胞中检测到ASC表达增加。研究表明，抑制巨噬细胞中的NLRP3炎症小体途径可以减轻心肌缺血/再灌注损伤。所有这些都表明，NLRP3可能主要在非心肌细胞中激活。
AIM2感知双链DNA片段并启动炎症小体。在缺血/再灌注条件下，DNA氧化损伤和DNA复制应激会诱导核DNA和线粒体DNA片段化。最近的几个研究小组报告，缺氧/复氧会上调AIM2蛋白的表达，并伴随着活化的caspase-1、ASC、IL-18和IL-1β水平的增加，这与在缺血/再灌注损伤大鼠中观察到的结果一致。最近，在小鼠心脏缺血/再灌注后24小时的内皮细胞中观察到AIM2炎症小体被激活。该小组还报告了缺血/再灌注引起的心肌细胞中AIM2激活。但也有报道称，AIM2缺陷小鼠的缺血/再灌注诱导的心肌细胞损伤未受到显著影响。相反，仅在缺血/再灌注后3天的成纤维细胞中检测到AIM2炎症小体激活。这表明，在AIM2炎症小体的背景下，其在内皮细胞和心肌细胞中的激活发生在损伤后早期，而在成纤维细胞中的激活则明显延迟。
其他类型炎症小体在缺血/再灌注诱导的心脏损伤中的作用研究较少。据报道，内质网应激可导致小鼠缺血/再灌注心脏中NLRP1炎症小体激活，尽管NLRP1激活的具体时间和细胞类型尚不清楚。在一项研究caspase-1/4抑制剂对小鼠心肌缺血/再灌注损伤治疗效果的研究中，NLRC4的敲除并未消除缺血/再灌注后的心脏损伤，表明NLRC4炎症小体激活可能不是心肌缺血/再灌注损伤的原因。对于NLRP6/7/9/10/12和NLRC5，很少有证据阐明它们与心肌缺血/再灌注损伤的关系。
总体而言，在心肌缺血/再灌注损伤模型中，炎症小体激活主要发生在再灌注后，而缺血期间梗死核心的形成主要由坏死驱动。再灌注开始时，心肌细胞中的caspase-11激活，加上内皮细胞和成纤维细胞中的NLRP3激活，可能促进炎症细胞因子的释放。这加速了炎症细胞浸润和持续的心肌细胞焦亡，导致梗死区域扩大。梗死面积在再灌注后约24小时达到最大。尽管在缺血/再灌注后24小时可检测到AIM2炎症小体激活，但未来研究需要阐明这一过程究竟何时开始。心肌细胞中NLRP3的激活也需要进一步评估。一段时间后，急性炎症消退。持续的炎症小体激活和炎症细胞因子的释放导致心肌组织慢性炎症，从而促进心肌纤维化和心室重构。抑制NLRP3可减少心肌纤维化和心室重构。
目前，关于各种炎症小体在心肌缺血/再灌注损伤条件下不同细胞类型中激活的时间模式仍然严重缺乏数据。
年龄、性别和合并症调节炎症小体对心肌缺血/再灌注损伤的反应
衰老导致ROS积累和线粒体功能障碍增加，这两者都促进NLRP3激活和心肌缺血/再灌注损伤。此外，NLRP3激活反过来可促进心肌细胞衰老，其抑制已被证明可改善老年小鼠的心功能。据报道，老年大鼠在心肌梗死后表现出明显高于年轻大鼠的NLRP3水平。需要更多的研究来全面描述NLRP3如何在衰老背景下介导心肌缺血/再灌注损伤。
性别对心肌缺血/再灌注损伤后NLRP3激活的影响尚不清楚。但据报道，雌激素可调节NLRP3炎症小体。一种植物雌激素染料木素A可通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3途径减轻大鼠的心肌缺血/再灌注损伤。一种名为芒柄花素的甲氧基异黄酮具有与雌激素相似的生物活性。施用芒柄花素可抑制NLRP3炎症小体激活并减轻大鼠的心肌缺血/再灌注损伤。这表明雌激素可能通过抑制NLRP3发挥心脏保护作用。
心肌缺血/再灌注损伤常发生在伴有高血压和糖尿病等心血管疾病并发症的情况下，这些并发症也影响NLRP3的激活。1型糖尿病大鼠比非糖尿病大鼠表现出更严重的心肌缺血/再灌注损伤，这与增强的NLRP3炎症小体激活和焦亡有关。此外，炎症小体抑制显著减轻了损伤。同样，在2型糖尿病大鼠模型中，糖尿病大鼠表现出增强的炎症小体激活和加重的心肌缺血/再灌注损伤。caspase-1的抑制减轻了这种损伤，证实了病理相关性。糖尿病心脏对心肌缺血/再灌注损伤表现出更大的易感性。因此，靶向NLRP3通路代表了针对这一脆弱人群的有前景的治疗策略。高血压也是一种常见的心血管疾病。然而，关于它如何影响NLRP3介导的心肌缺血/再灌注损伤的研究仍然有限。但有证据表明，抑制NLRP3活性可以减轻高血压引起的器官损伤。
缺血/再灌注影响心肌炎症小体形成的分子机制
大量研究证明，心肌缺血/再灌注损伤通过调节炎症小体的启动和激活来诱导炎症小体形成，从而导致心肌细胞焦亡。炎症小体的启动和激活通过各种信号的协调受到严格调控。许多分子参与了这一过程。
关键调控蛋白
Sirtuin-1、Sirtuin-3和Sirtuin-6属于依赖NAD的Sirtuin组蛋白/蛋白脱乙酰酶家族。它们被认为是NLRP3炎症小体的关键调节因子。心肌缺血/再灌注损伤减弱Sirtuin-1激活，同时NLRP3和活化的caspase-1水平升高。Sirtuin-1激动剂降低NLRP3蛋白和活化的caspase-1表达，而诱导型心肌细胞特异性Sirtuin-1敲除小鼠显示NLRP3和活化的caspase-1水平升高。Sirtuin-3因缺氧/复氧而下调，但其过表达可抑制NLRP3激活。来自脂肪干细胞富含Sirtuin-6的外泌体在大鼠心肌缺血/再灌注损伤时下调AIM2的mRNA和蛋白水平，并抑制caspase-1激活。然而，用siRNA抑制Sirtuin-6会增加AIM2表达并刺激caspase-1激活。去泛素化酶USP25的缺乏会加重心肌缺血/再灌注损伤时的NLRP3激活，并促进小鼠心脏重构。Tubastatin A是靶向组蛋白去乙酰化酶6的选择性抑制剂；它可以抑制NLRP3诱导的焦亡并保护复苏后心肌功能。甲基转移酶样蛋白3(METTL3)介导N6-甲基腺苷的形成；它也参与调节NLRP3表达和焦亡。沉默METTL3可降低大鼠心肌缺血/再灌注损伤时的NLRP3表达和心肌细胞损伤。
炎症小体的组装被认为需要去泛素化。三方基序蛋白6(TRIM16)和膜相关RING指蛋白2(MARCH2)是E3泛素连接酶。Shi等人已表明，TRIM16的过表达下调了缺氧/复氧应激的小鼠心肌细胞中NLRP3的表达。进一步的研究表明，TRIM16可以与NLRP3相互作用以促进其降解。TRIM16还具有转录活性，能够调节IL-1β的转录。TRIM16的过表达降低了缺氧/复氧处理的小鼠心肌细胞中成熟的IL-1β蛋白水平。比较基因集变异分析表明，在MARCH2敲除的缺血/再灌注小鼠的心肌细胞中，NLRP3炎症小体复合物组装上调。此外，据报道MARCH2直接结合磷酸甘油酸变位酶5(PGAM5)以介导PGAM5的泛素化和降解。然后，PGAM5与线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)的相互作用（MAVS是NLRP3炎症小体的接头蛋白）介导NLRP3炎症小体的激活。
非编码RNA
非编码RNA不编码蛋白质；它们被发现通过多种机制介导其他基因的表达，参与正常细胞功能和疾病。
微小RNA，长度约为22个核苷酸，能够调节靶基因表达。根据已报道的研究，在经历心肌缺血/再灌注损伤的心肌细胞中，微小RNA可以通过两种机制介导NLRP3炎症小体形成：i) 通过与NLRP3 mRNA直接结合来直接调节NLRP3表达。例如，miR-703已被确认为靶向NLRP3，其过表达对NLRP3水平产生负调控作用。ii) 通过靶向其他分子间接调节NLRP3和ASC表达。PTEN可以直接使NLRP3去磷酸化，导致NLRP3炎症小体激活。RNA结合蛋白HuR (ELAVL1)和SRY相关高迁移率族框基因9(SOX9)介导经典炎症小体激活。miR-133a、miR-761或miR-30c分别负调控ELAVL1、PTEN和SOX9的表达，从而降低NLRP3和ASC的水平。SHP2负调控NLRP3炎症小体激活。miR-29a和miR-132靶向Sirtuin-1。Sirtuin-3和SHP2分别被miR-15和miR-155靶向。敲低miR-15、miR-29a、miR-15或miR-155可通过靶向Sirtuin-1、Sirtuin-3或SHP2来抑制NLRP3和ASC的表达。
长链非编码RNA，根据其长度定义（>200个核苷酸），是一类数量众多且种类多样的非编码RNA。长链非编码RNA的多样性反映在其功能上，因为它们可以与DNA、多种RNA（包括mRNA、微小RNA、环状RNA）和蛋白质相互作用。长链非编码RNA参与多种信号通路。长链非编码RNA RIAN和SNHG1分别充当miR-17或miR-137的海绵，负调控细胞周期蛋白D1(CCND1)或Krüppel样因子4(KLF4)，从而在心肌缺血/再灌注损伤时激活小鼠心肌细胞中的NLRP3。长链非编码RNA重编程调节因子(ROR)通过抑制miR-185表达来促进CDK6的表达，从而刺激暴露于缺氧/复氧的人心肌细胞系中NLRP3的激活。长链非编码RNA浆细胞瘤变异易位1(PVT1)或牛磺酸上调1(TUG1)分别通过TLR4/MyD88/NF-κB通路和直接结合融合肉瘤(FUS)来促进心肌缺血/再灌注损伤小鼠模型中NLRP3的激活。
此外，环状RNA也参与调节心肌缺血/再灌注损伤时的炎症小体激活。环状RNA是共价闭合的RNA分子，表现出特定于组织和细胞的表达模式。在小鼠心肌缺血/再灌注损伤模型中，circHMGA2上调。circHMGA2通过增加氧化应激促进N
