探索来自长叶马尾藻（Sargassum longifolium）的岩藻多糖（fucoidan）作为天然抗糖尿病物质的作用机制：通过计算机模拟（in silico）和体外实验（in vitro）方法研究其对两种酶的靶向作用及其对GLUT4转运蛋白的影响

《International Journal of Biological Macromolecules》：Exploring fucoidan from Sargassum longifolium as a natural antidiabetic agent: Dual enzyme targeting and GLUT4 translocation evaluated through in silico and in vitro approaches

褐藻岩藻黄糖胶的硫酸化结构特征及其抗糖尿病活性研究。采用热酸性法提取并纯化Sargassum longifolium中的岩藻黄糖胶，通过FTIR、Raman、NMR等证实其硫酸化α-L-岩藻糖主链含1→4和1→3连接，C-2和C-4位硫酸化，β-1→4连接半乳糖侧支。体外抑制α-淀粉酶（IC50=75μg/mL）和α-葡萄糖苷酶（IC50=12.5μg/mL）呈竞争性抑制，上调L6细胞GLUT4基因表达并增强转位，分子对接证实其双重酶抑制活性。

　　

Balaji Sadhasivam | Saraswathy Nachimuthu

生物技术系，Bannari Amman 技术学院，Sathyamangalam，Erode-638402，泰米尔纳德邦，印度

摘要

岩藻多糖是一种主要由岩藻糖和半乳糖组成的硫酸化多糖，因其多样的生物医学应用而受到关注。在本研究中，我们采用热酸法从 Sargassum longifolium 中提取岩藻多糖，并对其进行了纯化。我们对其结构特征进行了表征，并评估了其抗糖尿病潜力。结构分析采用了 FTIR、拉曼光谱、NMR、LCMS 和 MALDI-TOF MS 方法。纯化的岩藻多糖中含有岩藻糖（536 ± 0.13 μg/mg）、半乳糖（298 ± 0.22 μg/mg）和硫酸盐（3.9 ± 0.1%）。NMR 和 MALDI-TOF/MS 显示其主链由 α-L-岩藻糖单元通过 α(1→4) 和 α(1→3) 链接组成，C-2 和 C-4 位点发生硫酸化，而在 α(1→3)-连接的岩藻糖的 C-4 位置通过 β(1→4) 链接存在半乳糖分支。热稳定性通过 TGA/DSC 测试确认，XRD 和 EDAX 分析提供了晶体结构和元素组成信息。抗糖尿病活性通过 体外 α-淀粉酶和 α-D-葡萄糖苷酶抑制实验以及 L6 细胞中的 GLUT4 基因表达分析进行了评估。岩藻多糖通过竞争性抑制作用抑制了 α-淀粉酶（IC50 = 75 ± 0.2 μg/mL）和 α-D-葡萄糖苷酶（IC50 = 12.5 ± 0.1 μg/mL），同时还能上调 GLUT4 的表达并增强其在 L6 细胞中的转运。分子对接实验进一步证实了岩藻多糖与这两种酶催化残基之间的稳定相互作用，从而验证了其双重抑制机制。

引言

海藻是丰富的生物活性多糖来源，在食品和生物制药领域得到广泛应用 [1]。其中，海藻衍生的多糖在亚洲被广泛用作营养补充剂，因为它们具有很高的药理潜力 [2]。这些生物活性主要归因于带负电荷的硫酸基团，这些基团在不同海藻物种中的数量和分布各不相同 [3]。岩藻多糖的结构多样性直接影响其生物活性和治疗效果。岩藻多糖具有多种生物活性，包括抗氧化、抗菌、抗炎、抗凝血、抗肿瘤、抗血栓、抗糖尿病、促进伤口愈合、抗病毒、降脂、降血糖和免疫调节作用 [4]。从结构上看，岩藻多糖主要由 α(1→3)-连接的硫酸化 L-岩藻糖单元组成，这些单元通常以 α(1→3) 和 α(1→4) 链接方式排列，同时含有少量甘露糖、半乳糖、葡萄糖和木糖 [5]。已对来自不同 Sargassum 物种的岩藻多糖的结构-功能关系进行了研究，包括 S. crassifolium、S. polycystum、S. mcclurei [6]。

2 型糖尿病（T2DM）是最常见的糖尿病类型，其主要特征是血糖水平升高。饮食中的淀粉通过 α-淀粉酶和 α-葡萄糖苷酶水解，导致餐后高血糖 [7]。GLUT4 基因表达减少会进一步加剧高血糖，而慢性糖尿病可能导致视网膜病变和肌肉疾病等并发症 [8]。通过增强 GLUT4 的表达和转运以及抑制 α-淀粉酶和 α-葡萄糖苷酶，可以有效地管理高血糖 [9]。尽管有如阿卡波糖这样的合成抑制剂，但它们存在不良副作用，因此人们正在探索海藻衍生的生物活性化合物作为更安全的替代品 [10]。 岩藻多糖作为一种硫酸化多糖，因其多样的生物活性而受到广泛关注 [11]。先前的研究表明，岩藻多糖单独使用或与其他化合物联合使用可以增强 GLUT4 的表达和转运 [12]，并对 α-淀粉酶和 α-葡萄糖苷酶具有双重抑制作用 [9] [11]。在本研究中，我们表征了从印度海岸采集的 Sargassum longifolium 中提取的岩藻多糖的结构特性。通过 体外 和 计算机模拟 方法，我们评估了其对 α-淀粉酶和 α-D-葡萄糖苷酶的双重抑制作用，研究了其与这些酶的分子相互作用，并检测了其在 L6 细胞中调节 GLUT4 基因表达的能力。

材料

三氯乙酸（TCA）、硫酸、明胶、氯化钡、苯酚和硫酸钠购自印度孟买的 HiMedia Laboratories Pvt. Ltd。岩藻糖、半乳糖和 DEAE Sepharose Fast Flow 从 Sigma Aldrich Pvt. Ltd. 购得，所有使用的化学品均为高纯度分析级。

样品采集与制备

棕色海藻 S. longifolium

来自泰米尔纳德邦 Ramanathapuram 区的 Mandapam（纬度 9.17004° N，经度 79.07217° E）地区。去除了多余的盐分。

岩藻多糖的提取、纯化及组成

从 S. longifolium 中提取的粗多糖产量为 4.45%（干重）。粗岩藻多糖组分中含有 252 ± 0.11 μg/mg 的 L-岩藻糖、642 ± 0.14 μg/mg 的 D-半乳糖和 4.2 ± 0.2% 的硫酸盐。通过 DEAE–Sepharose 阴离子交换色谱柱进行纯化，得到纯化后的组分，其中岩藻糖含量为 536 ± 0.13 μg/mg，半乳糖含量为 298 ± 0.22 μg/mg，硫酸盐含量为 3.9 ± 0.1%。岩藻多糖的产量和组成可能因提取方法而异。

结论

本研究从印度海岸采集的 中分离出了岩藻多糖。该岩藻多糖含有高比例的硫酸基团（干重 3.9%），主要由岩藻糖和半乳糖组成。结构分析显示，其主链由 α-L-岩藻糖单元通过 α(1→3) 链接构成，C-2 和 C-4 位点发生硫酸化。支化的岩藻多糖具有 α(1→4) 糖苷键，岩藻糖残基上还有 2-O 位点的取代基。体外 分析结果进一步证实了这些结构特征。

作者贡献声明

Balaji Sadhasivam： 负责撰写初稿、方法设计及数据整理。Saraswathy Nachimuthu： 负责审稿、编辑及研究指导。

参与同意书

不适用。

出版同意书

不适用。

伦理批准

本研究不适用伦理批准要求。

资助

本研究得到了印度科学与工业研究委员会（Council of Scientific and Industrial Research, Ministry of Science and Technology, Government of India）的支持（资助编号：08/677(0001)/EMR-I）。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

作者感谢印度泰米尔纳德邦 Coimbatore 的 Kumaraguru 技术学院（DST-FIST Center）和泰米尔纳德邦 Chennai 的中央皮革研究所（Council of Scientific and Industrial Research Institute – Central Leather Research Institute）在结构分析方面提供的支持。