明胶甲基丙烯酰水凝胶中甲酰基团的紫外光谱直接定量：一种可替代NMR的常规表征新方法

《Biomacromolecules》：Routine Direct Quantification of Methacrylic Groups per Gelatin Unit in Gelatin Methacryloyl Using Ultraviolet Spectroscopy

本研究报道了一种基于紫外光谱直接、准确、常规化测定明胶甲基丙烯酰水凝胶中甲酰基团数（QU）的新方法。该方法通过建立紫外指数（UVi），实现了测量与样品浓度的解耦，其精度与核磁共振（NMR）相当，并能适用于不同来源的明胶。此外，研究还开发了检测明胶甲基丙烯酰水凝胶中甲基丙烯酸污染的方法。该方案操作简便，有望降低明胶甲基丙烯酰水凝胶表征门槛，并推动不同批次、不同实验室间报告数据的标准化。

　　

引言

明胶甲基丙烯酰水凝胶是一种至关重要的生物材料，广泛应用于三维生物打印领域，这得益于其优异的生物相容性和易于调控的物理性质。明胶甲基丙烯酰水凝胶的质量很大程度上取决于合成过程中引入的甲酰基团数量。目前，量化明胶甲基丙烯酰水凝胶的常用方法包括比色法（如TNBS法）和核磁共振光谱法。NMR虽是金标准，但其设备昂贵且不普及，而比色法则步骤繁琐，为间接测量，易受杂质干扰。明胶甲基丙烯酰水凝胶中的甲酰基团因其具有共轭羰基和C=C双键而具有固有发色特性，为直接紫外光谱定量提供了可能。本研究的目标正是填补文献空白，建立一种用于常规量化明胶甲基丙烯酰水凝胶中甲酰基团的直接紫外光谱测定法。

材料与方法

研究使用了来自猪皮的A型明胶（胶凝强度300），并通过改进文献方法合成了系列明胶甲基丙烯酰水凝胶。作为模型化合物，合成了丁基甲基丙烯酰胺。所有紫外光谱均在pH 6.5的磷酸盐缓冲液中测量，使用1.0 cm石英比色皿，波长范围190-400 nm。NMR量化使用TMSP作为外标，在600 MHz仪器上进行。通过系统改变明胶/明胶甲基丙烯酰水凝胶溶液的浓度、pH和缓冲液摩尔浓度，评估了其对溶液稳定性和光谱的影响。

结果与讨论

1. 明胶与明胶甲基丙烯酰水凝胶紫外光谱的差异

明胶的紫外吸收峰位于210 nm附近，主要源于肽键的n → π跃迁。与明胶相比，明胶甲基丙烯酰水凝胶在220-270 nm区域的吸光度随取代度增加而显著增强。这种增强归因于甲酰基团C=C双键的π → π跃迁。通过合成丁基甲基丙烯酰胺并逐步加入明胶溶液，观察到了与明胶甲基丙烯酰水凝胶相似的光谱增强趋势，证实了光谱差异源于甲酰基团的引入。

2. 明胶与明胶甲基丙烯酰水凝胶溶液的一致性

为确保测量准确性，考察了浓度、pH和缓冲液浓度对蛋白质溶液结构稳定性的影响。使用A₂₃₀/A₂₇₀的比值作为结构稳定性指标。研究发现，浓度低于0.4 mg/mL时，该比值急剧变化；pH高于7时，明胶结构变化显著；而缓冲液摩尔浓度在0.01-0.5 M范围内影响较小。因此，确定了后续实验的最佳条件为：浓度 > 0.4 mg/mL，pH 6.5的磷酸盐缓冲液（0.05 或 0.1 M）。

3. 单波长方法的设计

在稳定条件下，明胶甲基丙烯酰水凝胶在248 nm处的吸光度与其NMR测得的取代度（DS）呈现良好的线性相关性。基于朗伯-比尔定律，明胶甲基丙烯酰水凝胶的吸光度等于明胶骨架吸光度与甲酰基团吸光度之和。通过从明胶甲基丙烯酰水凝胶吸光度中减去对应明胶的吸光度，可得到归属于甲酰基团的净吸光度，该值与DS也呈线性关系。将DS转换为假设的BuMA浓度后，明胶甲基丙烯酰水凝胶中甲酰基团在248 nm的吸光度与BuMA溶液的吸光度高度吻合，进一步证实了方法的物理基础。

4. 浓度无关方法的设计

研究发现，在269 nm处，不同明胶甲基丙烯酰水凝胶样品的吸光度几乎相同，形成了一个等吸收点。因此，定义紫外指数（UV_i）为A₂₄₈/A₂₆₉的比值。该指数与溶液浓度无关，且与DS呈强线性相关。通过数学推导，建立了适用于不同来源明胶的普适性公式，其中引入了甲酰基团在100% DS下的特征紫外指数值（UV_i^M100= 3.300）。

5. 明胶单元中甲酰基团的数量

传统的取代度（DS）依赖于明胶中赖氨酸的数量，不便于比较不同来源的明胶甲基丙烯酰水凝胶。研究提出使用“每明胶单元甲酰基团数”（QU）这一新指标，即每100 kDa明胶α-链（视为一个单元）上所携带的甲酰基团平均数。QU直接反映了明胶甲基丙烯酰水凝胶形成C-C交联键的潜力，与明胶类型无关，更具可比性。研究提供了基于NMR、单波长吸光度差和紫外指数的QU计算公式。

6. 方法验证

使用两个已知QU的明胶甲基丙烯酰水凝胶样品对方法进行验证。紫外指数法在0.5-2.4 mg/mL浓度范围内，QU计算结果与NMR结果的平均偏差小于2%，精度与NMR相当。单波长法在最佳浓度下结果一致，但其对浓度和杂质更敏感。

7. 明胶甲基丙烯酰水凝胶中甲基丙烯酸的检测

甲基丙烯酸是明胶甲基丙烯酰水凝胶常见的污染物，会干扰甲酰基团的准确定量。研究利用甲基丙烯酸的光谱在pH 2.5和pH 6.5下差异显著，而明胶甲基丙烯酰水凝胶光谱对pH变化不敏感的特性，建立了检测方法。通过测量污染样品在两个pH下238 nm的吸光度差值，可定量其中的甲基丙烯酸含量，检测限约为0.009 mg/mL（对于0.8 mg/mL明胶甲基丙烯酰水凝胶溶液，约1.1%）。

8. 甲基丙烯酸对甲酰基团定量的影响

评估了甲基丙烯酸污染对QU计算结果的影响。污染会导致基于单波长法和紫外指数法计算的QU值虚高。当甲基丙烯酸含量在1.23%时，QU值偏差约5%。两种方法计算结果的显著差异（>2个甲酰基团/100 kDa）可作为样品可能存在污染的一个警示信号。因此，建议在QU测量前先进行甲基丙烯酸检测。

结论

本研究成功开发了一种基于紫外光谱直接、常规化定量明胶甲基丙烯酰水凝胶中甲酰基团的新方法。该方法利用紫外指数实现了浓度无关的测量，其准确度和精密度可与NMR技术相媲美。所提出的“每明胶单元甲酰基团数”（QU）指标，避免了传统取代度（DS）对明胶来源的依赖，更利于不同明胶甲基丙烯酰水凝胶样品间的比较。同时，建立的甲基丙烯酸污染检测方案，进一步保障了定量结果的可靠性。这套完整、易行的紫外光谱解决方案，显著降低了明胶甲基丙烯酰水凝胶可靠表征的技术与设备门槛，有望成为生物打印和组织工程实验室的常规分析工具，并促进该领域数据报告的标准化。