利用原位多角度动态光散射（MADLS）技术监测搅拌结晶器中短乳杆菌（Lactobacillus brevis）酒精脱氢酶的成核过程 Julian Mentges, Daniel Bischoff, Dirk Weuster-Botz

《Crystals》：Nucleation Studies of Lactobacillus brevis Alcohol Dehydrogenases in a Stirred Crystallizer Monitored by In Situ Multi-Angle Dynamic Light Scattering (MADLS) Julian Mentges, Daniel Bischoff and Dirk Weuster-Botz

　　摘要：尽管成核过程对产品质量属性（包括总晶体数量、最终晶体尺寸分布以及下游加工过程）有着重要影响，但它仍然是蛋白质结晶过程中理解最少的步骤之一。在这项研究中，我们利用原位多角度动态光散射（MADLS）技术，研究了短乳杆菌（Lactobacillus brevis）酒精脱氢酶（LbADH）野生型（WT）及其五种突变体（Q207D、Q126H、K32A、D54F和T102E）在7毫升搅拌式结晶器中的成核行为。通过建立结晶、冻干和再溶解的实验流程，并结合尺寸排阻色谱（SEC）和尺寸排阻高效液相色谱（SE-HPLC），我们获得了纯度超过94%的四聚体LbADH，并去除了低分子量杂质。在加入聚乙二醇550单甲醚（PEG 550 MME）引发搅拌批次结晶过程中，SEC和SE-HPLC显示四聚体峰面积减小，但峰顶位置基本保持不变，表明没有长期存在的寡聚体中间体积累到可检测的水平。使用定制的流通式比色皿在搅拌结晶器旁路进行的时间分辨MADLS测量揭示了瞬态的簇群形成过程。所有蛋白质变体都表现出初始的四聚体峰，随后形成更大的聚集体，并在流体动力学直径超过1000纳米时信号迅速上升，这与宏观浑浊度的出现相吻合。我们提出了一个简单的介观尺度成核模型，计算出了成核结束时间、结晶分数、临界溶解浓度和表观成核速率常数。晶体接触位点的突变改变了成核爆发的时间和幅度（即核/簇群的快速积累）。与野生型相比，突变体Q207D的成核显著减弱，而其他突变体（K32A、D54F，尤其是T102E）在几乎不变的临界浓度下表现出加速的成核现象。这一综合工作展示了原位MADLS结合定制的动力学描述如何为搅拌批次结晶器中的蛋白质成核机制提供深入理解。

1. 引言
蛋白质结晶是结构生物学、生物制药制造和工业生物技术中的关键基础步骤，它能够实现高分辨率的结构测定以及大规模蛋白质的纯化和配方制备[1,2,3]。在搅拌式结晶器中进行的技术性蛋白质结晶已成为制备色谱法的有效替代方案，具有更低的运营成本、更少的消耗品使用以及更高的晶体状态产品稳定性[4,5]。特别是酒精脱氢酶和其他氧化还原酶已被研究用于探索蛋白质结晶在下游加工中的捕获和纯化潜力[6,7,8,9]。从机制上看，结晶过程可以分为两个相互关联的阶段：新晶体核的形成和这些核随后生长为宏观晶体。第一个阶段即成核，通常可以用经典成核理论（CNT）来解释，该理论认为晶体核的形成是由过饱和状态驱动的，并受到界面自由能的阻碍[10]。然而，许多实验和理论研究表明，蛋白质成核也可能遵循非经典或多步骤途径，涉及密集的类液体簇或异质界面[10,11,12]。在搅拌式结晶器中进行的技术性蛋白质结晶还受到流体动力学、均质化以及杂质存在的影响，这些因素可以通过改变局部过饱和度和界面性质来促进或抑制成核[13,14,15]。尽管成核在缩短蛋白质晶体首次出现的诱导时间、增加总晶体数量和缩小最终晶体尺寸分布方面起着核心作用，但对其机制的理解仍然不完整[10,11]。
短乳杆菌（Lactobacillus brevis）的酒精脱氢酶（LbADH）已被广泛用于技术性蛋白质结晶和晶体接触工程的研究[16,17,18,19,20]。在静态微升批次、搅拌毫升级和1升级结晶器中，单个和组合氨基酸替换已被证明可以通过增加成核事件的数量、缩短诱导时间以及加快达到热力学平衡的时间来提高结晶能力[16,17,18,21]。此外，这些工程策略已成功应用于同源甚至非同源酶，强调了晶体接触工程在改善技术性蛋白质结晶方面的普遍性[6,7,8,9]。然而，尽管之前的研究主要集中在宏观结晶指标（如产量、晶体尺寸分布和总晶体数量）上，但LbADH及其变体在搅拌结晶器中的早期成核阶段尚未得到详细解析[16,17,18,21]。
造成这一空白的一个重要原因是，技术性蛋白质结晶中最常用的过程分析技术（PATs），如带有自动图像分析的原位显微镜、聚焦光束反射率测量（FBRM）以及UV/Vis或IR光谱，主要优化用于量化生长动力学、晶体尺寸分布和整体过程性能，但对非常早期的纳米级成核阶段几乎不敏感[7,22,23,24]。在这方面，动态光散射（DLS）长期以来被认为是一种敏感的技术，可以监测蛋白质聚集和结晶过程，能够检测到结晶液滴和毛细管中的成核前簇群和早期聚集体[25,26,27]。然而，在搅拌结晶器中，高度多分散的簇群的早期出现和浑浊度的开始会降低传统单角度DLS的相关性对比度，使其解释变得复杂[28]，因为传统单角度DLS仅依赖于单一散射矢量。相比之下，多角度动态光散射（MADLS）通过结合多个检测角度的散射信息，提高了尺寸分辨率，并在广泛的流体动力学直径范围内提供了更准确的颗粒尺寸分布[29]。尽管MADLS已被用于表征蛋白质聚集和生物制药配方，但其用于搅拌蛋白质结晶过程中成核的时间分辨监测尚未得到系统探索[29,30,31]。
除了合适的分析工具外，还需要一个定义明确且均匀的蛋白质溶液来研究成核机制。LbADH是一种同源四聚体酶，分子量约为111 kDa，先前的研究表明，重组生产和标准色谱纯化可能会在溶液中留下残留的低分子量杂质和寡聚体副产物[9,18]。因此，通过结晶后进行再溶解可以作为一种有效的精制步骤，获得高度纯化、均匀的四聚体LbADH样品，非常适合成核研究[18,32]。一旦获得这种定义明确的同源四聚体LbADH溶液，就可以使用尺寸排阻色谱（SEC）和尺寸排阻高效液相色谱（SE-HPLC）来探测搅拌结晶过程中的潜在寡聚化或聚集过程，而原位技术如MADLS可以直接在结晶器中解析颗粒尺寸分布和成核爆发的时间演变（即可检测核/簇群的快速早期积累）。
在这项研究中，我们结合蛋白质分离、色谱表征和原位MADLS监测，研究了野生型LbADH及其选定的晶体接触突变体（T102E、Q126H、K32A、D54F和Q207D）在搅拌批次结晶中的成核行为。选择这些突变体是为了探究目标晶体接触相互作用的改变，包括引入盐桥（T102E）、在界面处引入额外氢键贡献的盐桥重新设计（Q126H）、基于表面熵减少（SER）的替换并伴随离子介导的静电稳定（K32A）、在对称接触处的芳香族替换（D54F），以及作为低成核对照的结晶能力减弱突变体（Q207D）。首先，我们通过重组生产、色谱纯化和基于结晶的精制步骤制备了高纯度的同源四聚体LbADH溶液。其次，我们使用SEC和SE-HPLC比较了加入PEG 550 MME后LbADH及其变体在溶液中的寡聚状态随时间的变化。最后，我们使用配备流通式比色皿的7毫升搅拌式结晶器进行间歇性MADLS测量，以原位监测成核，并开发了一个动力学模型，将MADLS得到的成核动态与之前建立的LbADH在搅拌结晶器中的晶体生长描述联系起来[21]。这种综合方法旨在（i）提供关于技术相关搅拌结晶条件下同源四聚体蛋白质成核机制的新见解，以及（ii）支持技术性蛋白质结晶过程的有理设计和控制。

2. 材料与方法
2.1. LbADH及其晶体接触突变体的重组生产和纯化
本研究调查了短乳杆菌（Lactobacillus brevis）的野生型酒精脱氢酶（LbADH，PDB ID：6H07）及其晶体接触突变体Q207D（PDB ID未公布）、Q126H（PDB ID：6Y10）、K32A（PDB ID：6HLF）、D54F（PDB ID：6Y1C）和T102E（PDB ID：6Y0S）[17]。表达载体pET28a_LbADH_GSG_His6（LbADH WT）来自Grob等人[17]，而编码LbADH突变体Q207D、Q126H、K32A、D54F和T102E的质粒是通过改良的QuickChange PCR协议进行定点突变生成的[18]。所有载体都带有相同的N端His6标签，该标签在结晶实验前未被去除。先前已经评估了N端His6标签对LbADH结晶的影响，发现其影响不显著[18]。目标晶体接触区域及其相应突变位点的结构图谱可在先前的结构分析中找到，用于参考[18,20]。
化学活性的大肠杆菌BL21(DE3)细胞通过热休克法转化了相应的质粒，并接种在添加了卡那霉素（35 μg·mL?1）的溶菌肉汤（LB）琼脂上。单个菌落被用来接种含有5 mL LB培养基和35 μg/mL卡那霉素的13 mL培养管中，在30 °C和180 rpm下培养24小时作为第一预培养。随后，第一预培养物被用来接种八个无挡板（每个培养瓶1 mL接种物）的2 L摇瓶中，每个摇瓶含有250 mL含有卡那霉素（35 μg·mL?1）的LB培养基，建立第二预培养阶段（16小时，37 °C，250 rpm）。为了实现高细胞密度生产，一个50 L的搅拌罐反应器（LP75；Bioengineering AG，Wald，瑞士）被接种了第二预培养物，初始OD600为0.5，在34 L（初始工作体积）的定义矿物培养基中[33]。培养策略包括一个初始批次阶段（5 g·L?1葡萄糖，4小时，37 °C），接着是一个指数进料批次阶段，使用含有500 g·L?1葡萄糖和12.5 g·L?1 MgSO4的进料（μset = 0.15 h?1，22小时，37 °C），以及随后的生产阶段。根据Schmideder等人的方法[34]，通过添加500 μM异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG）来诱导蛋白质表达，同时以2.7 g·L?1·h?1的速率连续供应葡萄糖，持续24小时，温度为30 °C。pH值通过自动添加25%（v/v）NH4OH维持在6.8。通过调节搅拌器速度、通气和压力，将溶解氧水平维持在30%的空气饱和度，起始条件为400 rpm，25 L·h?1的通气和0.2 bar的过压。在这些条件下，经过50小时的处理时间后，达到了大约120 g·L?1的最大细胞干重浓度。
收获的细胞悬浮液直接使用高压均质机（Variete NS3015H；GEA Niro Soavi，Parma，意大利）在900 bar的压力和100 L·h?1的流速下处理。所得细胞裂解液调整至pH 7.5，并补充了500 mM NaCl、20 mM咪唑、10 mM NaH2PO4和10 mM Na2HPO4。然后使用重力 tangential flow 过滤（SpectrumLabs KMPi TFF System，Waltham，MA，USA）进行微滤和渗滤，该过滤器配备了750 kDa MWCO中空纤维模块（UFP-750-E-4X2MA；Cytiva，Marlborough，MA，USA）。应用了2的浓缩因子（Cf）、1.5的渗滤因子（D）和恒定的跨膜压力0.3 bar。
对于亲和纯化，预处理的蛋白质溶液被加载到1 L的His标签亲和柱（PureCube 100 Ni-NTA Agarose；Cube Biotech，Monheim，Germany）上，该柱子预先用结合缓冲液（500 mM NaCl、20 mM咪唑、10 mM NaH2PO4、10 mM Na2HPO4，pH 7.5）平衡。用结合缓冲液洗涤以去除非特异性结合的蛋白质后，使用含有500 mM NaCl、500 mM咪唑、10 mM NaH2PO4和10 mM Na2HPO4的洗脱缓冲液洗脱LbADH及其突变体，洗脱液的pH值为7.5。由于洗脱液随后进行了浓缩步骤，因此没有进一步分离洗脱峰。大约获得了2升纯化的蛋白质溶液，并将其储存在-20°C下，加入5%（v/v）的甘油中，直至使用。在结晶实验之前，将解冻的蛋白质溶液在冰上使用切向流过滤装置（Sartoflow Beta plus；Sartorius Stedim，德国哥廷根）进行透析，透析液为蛋白质缓冲液（20 mM HEPES-NaOH，1 mM MgCl2，pH 7.0），并使用10 kDa分子量的膜盒（Sartocon Hydrosart；Sartorius Stedim，德国哥廷根），具体操作方法遵循Hebel等人的描述[35]。最后，将透析后的蛋白质溶液通过0.22 μm的聚醚砜膜（Steritop MILLIPORE Express；Merck Chemicals GmbH，德国达姆施塔特）进行无菌过滤。根据50升的高细胞密度培养过程以及所应用的浓度和透析步骤，LbADH及其变体的总回收率约为50%，如先前所述[21]。

2.2. 结晶、冻干和再溶解过程
在毫升级别的搅拌结晶实验中，使用了两种不同的7毫升装置。在第一种配置中，一个定制的圆底玻璃结晶器（工作体积为7毫升）安装在一个步进电机驱动的轴上，该轴上装有斜叶片叶轮，并放置在一个温度可控的水浴中（1157P，VWR，德国达姆施塔特），温度设定为20°C，这与之前为LbADH及相关醇脱氢酶描述的搅拌结晶器配置类似[6,17,18]。所有实验中叶轮的转速都设定为150转/分钟，这一转速被认为是在这种毫升级别结晶器配置中实现均匀悬浮液和适度局部能量耗散之间的合适折中[6,17,18,21,36]。
对于带有原位MADLS监测的成核研究，使用了相同类型的7毫升玻璃结晶器，并连接到一个封闭的管路系统中，该系统配置用于间歇性流式测量（图1）。结晶器浸入一个定制的铜制水浴中，其温度由Peltier元件（TEC1-12706，AZ-Delivery GmbH，德国德根多夫）控制，该元件连接到一个数字温度控制器（XH-W1308，Xinghe Electronic Materials Manufacturing Co., Ltd.，中国苏州）。图1显示了7毫升搅拌结晶器中用于间歇性旁路MADLS测量的实验装置。(a) 示意图展示了结晶器驱动电机M01和玻璃批次反应器R01、人机界面HMI01、蠕动泵P01/02、温度指示器TI03/04以及用于降温的冷却风扇FAN01。Zetasizer Ultra仪器位于左侧，内部装有分析比色皿A01。(b) 批次反应器R01的照片，上面安装了电机M01以及旁路电路的进气管和出气管。组件标识符与图2中的管道和仪器图相对应。两条进气管和出气管分别位于结晶器的相对两侧，并引导至反应器底部，最终靠近但低于叶轮的位置。晶体悬浮液通过一个石英比色皿（UV-Micro Cuvette 759220，BRAND GmbH + Co KG，德国韦特海姆）定期泵送，比色皿的体积为200 μL，然后通过两个由步进电机驱动的同步蠕动泵（8HS15-0604S-PG19，Stepperonline Inc.，美国纽约）重新泵回容器中。在比色皿内，进气管和出气管固定在液体表面的尽可能对面的位置，以促进200 μL液体的完全交换。整个旁路系统的体积（包括所有管道和比色皿）为1.41毫升。整个旁路系统中使用了内径为0.5毫米的柔性管道。搅拌器和泵电机由一个基于多轴步进电机驱动模块（TMCM-6110，Trinamic，德国汉堡）的自制控制单元控制，该控制单元配备了一个外部触摸屏作为人机界面，允许独立调节搅拌速度和流速。图1提供了实验性旁路MADLS设置的示意图，而图2展示了相应的管道和仪器图。

2.3. 蛋白质分析和尺寸排阻色谱
可溶性LbADH的浓度通过在离心后的上清液（40 μL，10分钟，15,000 g；5415R，Eppendorf AG，德国汉堡）中在280纳米波长下进行分光光度测量来确定（N120 NanoPhotometer，Implen GmbH，德国慕尼黑）。相应的蛋白质缓冲液作为空白对照，浓度计算基于之前报告的摩尔消光系数19,940 M?1·cm?1（ProtParam）[37]。
对于选定的纯化步骤，还通过校准的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行密度分析来估算总蛋白质产量和浓度，分析软件为ImageJ（版本1.54g，美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）。尺寸排阻色谱既用于精处理步骤，也用于分析LbADH及其变体的寡聚状态。色谱分离是在标准液相色谱系统上进行的，该系统以等渗模式运行（?KTA pure，Cytiva，美国伊利诺伊州芝加哥），配备了不同分离范围的球形蛋白质尺寸排阻柱（Superdex? 200 Increase 10/300 GL，10–200 kDa；Superdex? 75 Increase 10/300 GL，3–75 kDa；Cytiva，美国伊利诺伊州芝加哥）。所有情况下都使用蛋白质缓冲液（20 mM HEPES-NaOH，1 mM MgCl2，pH 7.0）作为流动缓冲液。每次色谱运行前，先用2柱体积（CV）的去离子水冲洗柱子，然后再用2 CV的流动缓冲液冲洗。体积流速设定为0.75 mL·min?1，对于24毫升的柱子体积，总运行时间约为32分钟。蛋白质样品在注入前通过0.22 μm的膜过滤器过滤，注入体积为300 μL，蛋白质浓度为10 g·L?1。
为了在更短的分析时间内进一步分离寡聚体和潜在的高分子量物种，使用了尺寸排阻高效液相色谱（SE-HPLC），该色谱使用了一个长度为50毫米、内径为4.6毫米的短分析柱，柱内填充了5 μm的二醇功能化颗粒，分辨率为10–650 kDa（Inertsil WP300，GE HealthCare Technologies，美国伊利诺伊州芝加哥）。流动相仍使用上述的蛋白质缓冲液。柱子的操作流速为0.20 mL·min?1，系统压力约为3巴，每次运行的总分析时间约为5分钟。所有溶液在注入前都通过0.22 μm的膜过滤器过滤。
对于所有7毫升级别的结晶实验，含有溶解的LbADH的蛋白质缓冲液（20 mM HEPES-NaOH，1 mM MgCl2，pH 7.0）和结晶缓冲液（0.1 M Tris–HCl，pH 7.0，50 mM MgCl2，200 g·L?1 PEG 550单甲基醚）都预先调整至20°C。然后将等体积的蛋白质溶液和结晶缓冲液混合在一个装有小型磁力搅拌棒的25毫升玻璃圆筒中（800转/分钟），以获得LbADH浓度为5 g·L?1的均匀结晶溶液。混合后的溶液通过0.22 μm的聚醚砜膜无菌过滤器（CHROMAFIL? RC-20/15 MS，MACHEREY-NAGEL GmbH & Co.KG，德国杜伦）过滤，然后立即转移到7毫升结晶器中。
在补充图S1中提供了在7毫升批次结晶器和7毫升流式装置中进行的搅拌结晶实验的定性比较。在相同的条件下，两种配置之间的结晶行为（如成核开始、宏观晶体形态或总体晶体产量）没有观察到系统性的差异。
为了制备用于冻干和再溶解实验的结晶LbADH，还使用了一个带有三叶片段式叶轮的1升双夹套玻璃搅拌罐反应器进行了批次结晶，具体操作方法如先前所述[21]。反应器在20°C下运行，初始的可溶性LbADH浓度为5 g·L?1，使用的蛋白质缓冲液与毫升级别实验中的相同。等体积的蛋白质溶液和结晶缓冲液一起通过0.22 μm的聚醚砜膜（Steritop MILLIPORE Express；Merck Chemicals GmbH，德国达姆施塔特）过滤，然后加入搅拌反应器中，总结晶体积为1升。结晶过程达到热力学平衡后（24小时内），通过离心（Rotixa 50RS Andreas Hettich GmbH & Co.KG，德国图特林根），以4000转/分钟和4°C的条件离心10分钟，收集晶体悬浮液。上清液被丢弃，晶体颗粒重新悬浮在去离子水中。这个洗涤步骤重复两次，每次使用100毫升去离子水，以去除残留的缓冲盐和PEG 550 MME，同时只引入在后续冷冻干燥过程中完全去除的挥发性成分。洗涤后的晶体转移到烧瓶中，并在实验室级别的冷冻干燥机（Lyophilizer ALPHA 1–2 LDplus，Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH，德国奥斯特罗德阿姆哈尔茨）中在-80°C和0.12 mbar下冷冻干燥24小时，直到质量稳定。得到的LbADH晶体饼在4°C下储存。对于再溶解，将冻干的晶体在冰上轻轻搅拌下溶解在蛋白质缓冲液（20 mM HEPES-NaOH，1 mM MgCl2，pH 7.0）中，直至完全溶解，然后通过0.22 μm的过滤器过滤以去除任何残留的颗粒。这些高纯度的同四聚体LbADH储备溶液用于后续章节中描述的成核实验。

2.4. 蛋白质分析和尺寸排阻色谱
可溶性LbADH的浓度通过在离心后的上清液（40 μL，10分钟，15,000 g；5415R，Eppendorf AG，德国汉堡）中在280纳米波长下进行分光光度测量来确定。相应的蛋白质缓冲液作为空白对照，浓度计算使用之前报告的摩尔消光系数19,940 M?1·cm?1（ProtParam）[37]。
对于选定的纯化步骤，还通过ImageJ（版本1.54g，美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）对校准后的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）数据进行密度分析来估算总蛋白质产量和浓度。
尺寸排阻色谱既用于精处理步骤，也用于分析LbADH及其变体的寡聚状态。色谱分离是在标准液相色谱系统上进行的，该系统以等渗模式运行（?KTA pure，Cytiva，美国伊利诺伊州芝加哥），配备了不同分离范围的球形蛋白质尺寸排阻柱（Superdex? 200 Increase 10/300 GL，10–200 kDa；Superdex? 75 Increase 10/300 GL，3–75 kDa；Cytiva，美国伊利诺伊州芝加哥）。所有情况下都使用蛋白质缓冲液（20 mM HEPES-NaOH，1 mM MgCl2，pH 7.0）作为流动缓冲液。每次色谱运行前，先用2柱体积（CV）的去离子水冲洗柱子，然后再用2 CV的流动缓冲液冲洗。体积流速设定为0.75 mL·min?1，对于24毫升的柱子体积，总运行时间约为32分钟。蛋白质样品在注入前通过0.22 μm的膜过滤器过滤，注入体积为300 μL，蛋白质浓度为10 g·L?1。
为了在更短的分析时间内进一步分离寡聚体和潜在的高分子量物种，使用了尺寸排阻高效液相色谱（SE-HPLC），该色谱使用了一个长度为50毫米、内径为4.6毫米的短分析柱，柱内填充了5 μm的二醇功能化颗粒，分辨率为10–650 kDa（Inertsil WP300，GE HealthCare Technologies，美国伊利诺伊州芝加哥）。流动相仍使用上述的蛋白质缓冲液。柱子的操作流速为0.20 mL·min?1，系统压力约为3巴，每次运行的总分析时间约为5分钟。所有溶液在注入前都通过0.22 μm的膜过滤器过滤。
对于所有基于SEC的方法，都使用含有已知分子量蛋白质的低分子量凝胶过滤校准套件（Gel Filtration LMW Calibration Kit 28-4038-41，Cytiva，美国伊利诺伊州芝加哥）对柱子进行校准，SE-HPLC柱子使用定义好的蛋白质标准混合物（H2899 Protein Standard Mixture，Merck KGaA，德国达姆施塔特）进行校准。对于每个柱子，根据洗脱体积Ve、空隙体积V0和总柱体积Vt，计算分布系数Kav，公式为Kav = (Ve ? V0) ? (Vt ? V0)?1。然后通过对数Mr与Kav的图表进行线性回归，得到校准曲线，其中Mr是表观相对分子质量。所得到的校准曲线显示在补充图S2中。在第3节中，所有报告的SEC和SE-HPLC峰的表观分子质量均基于这些校准函数，根据峰最大处的洗脱体积来确定。

2.4. 非溶性蛋白质浓度的计算和经验建模
为了量化结晶动力学，从搅拌批次结晶过程的质量平衡中得到了时间依赖的非溶性蛋白质浓度cX(t)：cX(t) = c0 ? c(t)（2），其中c0表示初始的可溶性蛋白质浓度，c(t)表示时间t时的可溶性浓度，通过离心去除固体相后通过离线A280测量确定。所得到的cX(t)轨迹使用以下形式的逻辑函数进行经验描述：cX(t) = cX,max · {1 + exp[?kX · (t ? t1/2,X)]}?1（3），其中cX,max是最大非溶性蛋白质浓度，kX是表观结晶速率常数，t1/2,X是拐点时间。逻辑公式的设定使得cX(0) = 0，并且cX(t)趋近于cX,max，从而确保对结晶过程的物理描述是一致的。参数通过一个自定义的Python脚本（版本3.12，Python Software Foundation，美国威尔明顿）进行非线性回归估计。这些拟合曲线随后被用来推导出特征性的结晶时间和速率，以便在LbADH的不同变体之间进行比较。7毫升搅拌批次和7毫升搅拌旁路结晶实验得到的参数，如起始浓度c0、平衡浓度ceq以及相应的逻辑回归拟合变量，总结在表S1.2中。2.5 动态粘度测定和原位MADLS测量结晶介质（50 mM Tris-HCl、25 mM MgCl2、10 mM HEPES-NaOH、pH 7.0）的动态粘度在20°C下使用旋转流变仪（RheolabQC，Anton Paar GmbH，奥地利格拉茨）进行测定。测量是在控制剪切模式下进行的，适用于低粘度牛顿流体，剪切速率范围为0–2000 s?1。时间分辨的多角度动态光散射（MADLS）测量使用Zetasizer Ultra仪器（Malvern Panalytical Ltd.，英国马尔文）进行，该仪器配备了633纳米的He-Ne激光器和三个检测角度：173°（后向散射）、90°（侧向散射）和13°（前向散射）。对于所有测量，样品材料被定义为折射率为1.450、吸收系数为0.001的蛋白质，而分散剂被定义为折射率为1.429、介电常数ε?（相对介电常数）为80的PEG 550 MME [38]。分散剂在20°C下的动态粘度根据上述独立的流变测量结果设定为0.0018 Pa·s。在MADLS测量中，结晶悬浮液从搅拌的7毫升结晶器中间歇性地抽出，通过位于仪器光路中的外部流通比色皿，然后返回反应器。比色皿内的测量位置通过仪器的位置优化程序设定为光路的中心，并且所有实验中的测量设备温度保持在20°C。每次MADLS采集周期总时长为3分钟，包括大约90秒的有效相关时间以及额外的处理步骤，以确保流体动力学条件的可重复性。在每次后续测量之前，通过旁路泵送1.5倍于旁路总体积（管道加上比色皿，1.41毫升；相当于1.82毫升/分钟）的液体，以便每次采集都能探测到从反应器中新鲜更换的结晶悬浮液。比色皿（200微升）充满后，悬浮液在静止状态下平衡20秒，以最小化流动对强度自相关函数的干扰。数据采集和评估使用制造商的软件（ZS Xplorer，版本1.02.042，Malvern Panalytical Ltd.，英国马尔文）进行。对于每次MADLS采集，仪器依次记录173°、90°和13°的强度自相关函数。然后软件结合角度分辨数据，得到高分辨率的流体动力学粒径分布和相应的流体动力学直径（以纳米为单位）。得到的时间序列强度加权粒径分布用于识别成核爆发的开始，量化簇群，并为第2.6节中描述的动力学成核模型提供实验基础。为了将MADLS得到的峰值位置与可溶性LbADH四聚体的预期大小相关联，根据四聚体LbADH的X射线结构（PDB ID：6H07）估算了理论流体动力学直径dH,theo。单个四聚体的分子体积计算为VTetramer = MTetramer/ρCrystal（4），其中MTetramer表示四聚体的摩尔质量（111.2 kDa），ρCrystal表示晶体密度（0.69 g·cm?3）。假设其形状紧凑且近似球形，该体积转换为等效球形直径dH,theo = (6 ? VTetramer/π)1/3 ≈ 8纳米（5）。这个理论值预计会略微低估可溶性四聚体的流体动力学直径，因为晶体学密度指的是晶体晶格内的蛋白质体积，并没有明确考虑水溶液中的水合壳层。2.6 基于MADLS的成核动力学的数学描述在动力学分析中，结晶进程用归一化的不可溶性蛋白质分数X(t) = cX(t)/c0（6）表示，其中cX(t)表示从第2.4节的质量平衡得到的时间依赖的不可溶性蛋白质浓度，c0是初始的可溶性蛋白质浓度。对cX(t)的逻辑回归拟合（方程（3）被用作所有LbADH变体的X(t)的平滑表示。成核爆发的结束时间tnuc,end是根据最大检测到的流体动力学直径dH,max(t)的MADLS时间序列确定的。对于每个实验，评估连续测量之间dH,max的离散时间导数ΔdH,max/Δt，并将dH,max最大正增长的采样时间视为成核爆发的结束时间tnuc,end。然后从拟合的X(t)进展中得到相应的结晶（不可溶性）分数X(tnuc,end)。成核爆发结束时的剩余可溶性分数θ和相应的临界可溶性蛋白质浓度ccrit由θ = 1 ? X(tnuc,end) = 1 ? (cX(tnuc,end)/c0（7）和ccrit = c0 ? θ = c0 ? cX(tnuc,end）（8）给出。在介观尺度动力学模型中，初级成核对X(t)演变的贡献由一个有效速率项表示，该速率项以汇总的方式捕捉了可用晶体-液体界面面积和剩余过饱和度的依赖性。成核项表示为(dX/dt)nuc = knuc ? (1 ? X) ? H((1 ? X) ? θ）（9），其中knuc是一个有效初级成核速率常数，(1 ? X)表示随着可溶性分数的减少驱动力的减小，H(z)表示Heaviside阶跃函数[39]，定义为H(z) = 1对于z > 0，H(z) = 0对于z < 0（按照惯例H(0) = 0），一旦可溶性分数降至临界值θ以下，即通过设置z = (1 ? X) ? θ来关闭成核。此外，参数knuc应被解释为一个综合量，它结合了微观成核速率常数、将不可溶性体积分数与可用界面面积相关联的几何因素，以及任何对局部过饱和度或混合条件的额外依赖性。因此，只有这个综合的表观速率常数可以从当前的批次数据中确定。对于每个变体，通过使用平滑后的X(t)表示作为参考，将成核项拟合到X(t)的早期演变直到tnuc,end来获得knuc。3. 结果与讨论 3.1 用于成核研究的同源四聚体LbADH的分离对于以成核为重点的结晶实验，最好使用定义明确、高纯度的蛋白质溶液，因为低分子量杂质和其他寡聚体物种可能会偏置观察到的动力学[9,18,31]。因此，通过尺寸排阻色谱分析了IMAC纯化的LbADH制备物的寡聚体组成，包括野生型和所有晶体接触变体。图3展示了LbADH T102E变体作为一个代表性例子。图3. IMAC纯化的LbADH T102E在进一步纯化前的示例尺寸排阻色谱图。显示了280纳米处的UV吸光度作为柱体积的函数。(a) 在分离范围为10–200 kDa的球形蛋白质尺寸排阻柱（Superdex? 200 Increase 10/300 GL）上记录的色谱图，显示了一个对应于同源四聚体LbADH（约117 kDa）的主峰，以及来自低分子量杂质的额外峰在25 kDa和10 kDa处。(b) 在分离范围为3–75 kDa的柱（Superdex? 75 Increase 10/300 GL）上获得的同一样品的更高分辨率尺寸排阻色谱图，更清晰地分辨出低分子量物种，并揭示了9.5 kDa和2.2 kDa处的明显杂质峰。(c0 = 10 g·L?1, 20 mM HEPES-NaOH, 1 mM MgCl2, pH 7.0, T = 20 °C)。在这种情况下，在分离范围为10–200 kDa的球形蛋白质柱上的SEC显示了一个对应于同源四聚体LbADH T102E的主峰在约117 kDa，而25 kDa和10 kDa处的额外峰表明存在低分子量杂质（图3a）。当在同一样品在分离范围为3–75 kDa的柱上分析时，这些物种被更清晰地分辨出来，并可以归因于9.5 kDa和2.2 kDa处的不同杂质峰（图3b）。因此，标准的IMAC纯化本身不能提供足够均匀的同源四聚体LbADH用于成核研究。为了去除这些残留物种，LbADH WT和晶体接触变体在1升规模上结晶，洗涤，冻干，然后在使用前重新溶解在蛋白质缓冲液中。对于所有研究的LbADH变体，在10–200 kDa柱上记录的SEC色谱图主要由一个在117–121 kDa范围内的单一主峰主导，与同源四聚体LbADH一致。WT和Q207D的代表性色谱图（图4）显示，除了这个主要四聚体峰外，仅剩下一个在大约181–189 kDa处的次要高分子量寡聚体峰，占总SEC峰面积的不到5%。由于SEC得到的表观分子质量可能受到流体动力学效应和非理想柱相互作用的影响，我们不将这个物种归因于特定的寡聚体化学计量[18]。此外，基线上没有检测到低分子量杂质。图4. LbADH在结晶、洗涤、冻干和重新溶解在蛋白质缓冲液后的尺寸排阻色谱图。显示了280纳米处的UV吸光度（实线）和电导率（灰色轨迹）作为柱体积的函数，对于(a)野生型（蓝色）和(b) Q207D变体（绿色）。在这两种情况下，色谱图都由一个对应于同源四聚体LbADH（WT为约117 kDa，Q207D为约121 kDa）的主峰主导，而只有在181 kDa和189 kDa处的次要高分子量寡聚体峰。数据是在分离范围约为10–200 kDa的球形蛋白质尺寸排阻色谱柱（Superdex? 200 Increase 10/300 GL；c0 = 10 g·L?1, 50 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 10 mM HEPES-NaOH, pH 7.0, T = 20 °C）上记录的。从280纳米处的分光光度测量确定的重新溶解后的纯度在97.6%到98.4%之间，所有研究变体的同源四聚体峰占总SEC峰面积的95.2–97.9%（表1）。结合这两种测量方法，得到的整体同源四聚体纯度在93.7%到96.3%之间（表1）。这些结果表明，通过结晶、冻干和重新溶解可以得到高纯度、主要为同源四聚体的LbADH制备物，适合作为下面描述的成核研究的起始溶液。表1. Lactobacillus brevis酒精脱氢酶（LbADH）野生型和变体在结晶、冻干和重新溶解后的纯度指标。“重新溶解后的纯度”表示根据A280基浓度测量确定的溶解蛋白质的比例。“同源四聚体分数（SEC峰面积）”对应于第2.3节中描述的尺寸排阻色谱图中约111 kDa四聚体峰的相对面积。“同源四聚体纯度”代表通过结合这两种测量方法得到的均匀四聚体LbADH的百分比；所有报告的值都以%表示。3.2 通过SEC和SE-HPLC评估寡聚化和成核行为为了检查LbADH的搅拌结晶是否涉及可检测的寡聚体中间体，从初始可溶性LbADH浓度为5 g·L?1的7毫升批次结晶中取出样品，并通过SEC和SE-HPLC进行分析。图5示例性地展示了在7毫升搅拌结晶过程中LbADH WT的寡聚体状态演变，对于两个采样时间进行了说明。图5. 通过SEC和质量平衡评估，在7毫升搅拌结晶器中LbADH WT的寡聚化和结晶批次进展的分析。(a) 在分离范围为10–200 kDa的球形蛋白质柱（Superdex? 200 Increase 10/300 GL）上记录的尺寸排阻色谱图（A280与柱体积），分别对应于实验开始时（t = 0.0 h，深蓝色）和1.5小时后（浅蓝色）取出的样品。样品在注入前在蛋白质缓冲液中稀释1:10。(b) 从结晶质量平衡得到的不可溶性蛋白质浓度cx(t)（蓝色圆圈）的时间进程，以及相应的逻辑回归拟合（蓝色虚线），以及从SEC色谱图得出的峰顶洗脱位置的变化（CV，黑色方块和线性连接线）。垂直和水平的浅蓝色线条标记了图(a)中显示的t = 1.5小时时的采样时间。(c0 = 5 g·L?1, 100 g·L?1 PEG 550 MME, ns = 150 rpm, 50 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 10 mM HEPES-NaOH, pH 7.0, T = 20 °C)。样品仅在过程的早期阶段抽取，直到通过显微镜检测到第一个LbADH晶体，以便专注于成核和早期晶体生长。尺寸排阻分析是在一个分离范围约为10–200 kDa的柱子上进行的，用于球形蛋白质（Superdex? 200 Increase 10/300 GL），从而能够将潜在的高分子量或低分子量寡聚体与同四聚体物种区分开来。图5显示了野生型酶在结晶开始时（0.0小时）和1.5小时后的SEC色谱图，以及非溶性蛋白质浓度和峰顶洗脱位置的变化情况。尽管在加载到柱子上之前进行了十倍稀释，但在所有时间点都观察到了一个明显的同四聚体峰，大约位于94 kDa处，需要注意的是，校准的质量可能会受到样品基质（残留的PEG/结晶肉汤成分）的影响，因此应将其解释为表观SEC值。此外，没有出现其他对应于更高寡聚体物种的峰（图5a）。从0.0小时到1.5小时，非溶性蛋白质浓度从0.00 g·L?1增加到0.56 g·L?1（图5b），表明形成了大量的晶体。在同一时期，峰顶洗脱位置在实验分辨率范围内保持不变，而同四聚体峰面积逐渐减小，反映了蛋白质从可溶相转移到结晶相的过程。因此，在SEC方法的尺寸和灵敏度限制内，没有检测到LbADH WT在成核和早期生长过程中的稳定寡聚体前体或聚集体。

为了提高尺寸分辨率并缩短分析时间，还使用了一个分离范围约为10–650 kDa的尺寸排阻柱（Inertsil WP300 Diol）通过SE-HPLC监测了LbADH WT、Q207D和T102E变体的7 mL批次结晶实验。对于每个变体，在结晶开始时以及通过显微镜已经检测到晶体后的一个早期时间点（WT和Q207D为4.0小时，T102E为1.5小时；图6a,c,e）记录了色谱图。在所有情况下，SE-HPLC色谱图都由一个主要峰主导，其校准的峰顶对应于表观分子质量在118 kDa到132 kDa之间，与同四聚体LbADH一致，并且在柱子的可检测尺寸范围内没有出现其他分离良好的高聚体或低分子量片段的峰。色谱图显示出由于色谱装置的柱外死体积相对较高而产生的特征性峰尾，但这种尾随现象随时间没有系统性地变化，因此不表明形成了离散的额外物种。图6显示了使用SE-HPLC对LbADH WT、Q207D和T102E变体的7 mL批次结晶实验进行的尺寸排阻高效液相色谱（SE-HPLC）分析。在图(a,c,e)中，显示了使用分辨率为10–650 kDa的SEC-HPLC柱（Inertsil WP300 Diol）在开始时（0.0小时）和定义的结晶时间后（WT和Q207D为4.0小时，T102E为1.5小时）采集的样品在280 nm处的吸光度与柱体积的关系。图(b,d,f)显示了相应的非溶性蛋白质浓度（圆圈）以及逻辑拟合（虚线），以及以柱体积表示的峰顶洗脱位置（黑色方块和连接线）。垂直和水平的浅色线条标记了图(a,c,e)中显示的4小时（WT, Q207D）和1.5小时（T102E）的采样时间。误差条是由于实验重复两次而产生的。(c0 = 5 g·L?1, 100 g·L?1 PEG 550 MME, ns = 150 rpm, 50 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 10 mM HEPES-NaOH, pH 7.0, T = 20 °C)。对同一结晶实验的离线质量平衡分析显示，在进行SE-HPLC采样的时间点，已经结晶了大量的蛋白质，非溶性蛋白质浓度分别为2.38 g·L?1（WT）、0.49 g·L?1（Q207D）和4.82 g·L?1（T102E），见图6b,d,f。在相应的时间间隔内，四聚体峰面积随着非溶性分数的增加而减小，而所有三个变体的峰顶洗脱位置在实验分辨率范围内基本保持不变。结合SEC的结果，这些SE-HPLC数据表明，在这里研究的搅拌结晶条件下，LbADH的成核和早期生长过程中没有积累可以通过基于尺寸的色谱方法分辨出的持久性寡聚体中间体。

3.3. 成核动力学的时域MADLS分析
为了对结晶介质进行流变学和光散射表征，首先在没有蛋白质的情况下分析了含有100 g·L?1 PEG 550 MME的蛋白质缓冲液溶液。MADLS显示出一个狭窄的强度加权尺寸分布，具有一个单一峰，其流体动力学直径dH = 1.7 ± 0.4 nm，如图7a所示，表明溶解的PEG对后续测量只贡献了一个小的、明确的背景信号。这个流体动力学尺寸与文献中关于摩尔质量为400–600 g·mol?1的短聚乙二醇链的数据一致，这些数据报告在水溶液（81.5 mM NaCl, 25 °C）中的流体动力学直径大约为1.2–1.4 nm [40]。使用旋转流变仪对同一溶液进行的独立流变学测量显示，在剪切率范围0–1500 s?1内，动态剪切粘度η ≈ 1.8 × 10?3 Pa·s，证实了结晶介质在MADLS实验条件下表现出牛顿行为 [41]。图7显示了含有100 g·L?1 PEG 550单甲基醚（MME）的结晶介质的多角度动态光散射和流变学表征。(a) 从MADLS获得的流体动力学直径dH的归一化散射强度（I/Imax），其中强度被缩放到每个分布的最大值（I/Imax = 1），峰顶位置为dH = 1.32 nm。(b) 应用的剪切率（s?1，灰色方块）和动态剪切粘度（Pa s，橙色圆圈）随时间的变化。误差条是由于实验重复两次而产生的。(100 g·L?1 PEG 550 MME, 50 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 10 mM HEPES-NaOH, pH 7.0, T = 20 °C)。然后在LbADH的7 mL批次结晶过程中进行了时域MADLS测量，初始可溶性蛋白质浓度为c0 = 5 g·L?1。对于WT和Q207D突变体，强度加权的流体动力学直径分布的变化以气泡图的形式总结，其中气泡位置代表峰直径和采样时间，气泡面积代表归一化的峰面积（图8）。在实验开始时，两种变体都显示了在dH = 8.8 ± 6.4 nm（WT）和dH = 7.3 ± 1.3 nm（Q207D）处的主导峰，这与从晶体结构和基于密度的体积计算估计的同四聚体LbADH的流体动力学尺寸相符，同时在WT处还有较弱的峰在102.1 ± 22.1 nm，而在Q207D处为87.2 ± 14.2 nm。后者的强度波动较大，有时会完全消失，因此很可能是由微量非反应性杂质或灰尘颗粒引起的 [29,31]。由于DLS中的散射强度大约与流体动力学直径的六次方成正比（I ∝ dH6），即使这些罕见的较大污染物在强度加权表示中也显得非常明显，尽管它们在溶液中的实际质量分数可以忽略不计 [31]。随着结晶的进行，出现了大约4–300 nm范围内的额外峰，并且这些峰是瞬态的，表明在主导的四聚体旁边形成了动态簇群体和小分子量寡聚体物种，但仅凭MADLS无法明确分配具体的聚集数。如2.6节所定义的，成核爆发在所有情况下都与dH ? 1000 nm处的强度迅速增加和结晶器中可见浑浊度的开始同时发生，标志着从纳米级簇向粗颗粒悬浮液的转变。与WT（tnuc,end = 0.325 ± 0.035 h）相比，Q207D（tnuc,end = 1.025 ± 0.035 h）显示出大直径峰的出现延迟和生长较弱。这与Q207D在晶体接触区域引入了酸性侧链从而改变了局部静电环境一致，据报道这会降低207位点的结晶性。与此一致，与WT相比，Q207D相关的成核聚集延迟且不那么明显。图8显示了使用流动式MADLS装置在7 mL批次结晶过程中测量的LbADH的时域流体动力学直径分布。(a) LbADH WT（浅蓝色和深蓝色）的气泡图，每个气泡代表其流体动力学直径dH处的强度加权尺寸分布的一个峰和采样时间。(b) LbADH Q207D变体的相应数据（浅绿色和深绿色）。气泡面积是根据归一化强度峰面积定义的，提供了给定时间每个尺寸群体的相对贡献的定性测量。浅色和深色表示两次独立的实验重复，黑色虚线垂直线表示tnuc,end。(c0 = 5 g·L?1, 100 g·L?1 PEG 550 MME, ns = 150 rpm, 50 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 10 mM HEPES-NaOH, pH 7.0, T = 20 °C)。比较每个系统的两次独立重复（图8中的浅色和深色气泡）揭示了运行之间详细簇尺寸分布的明显变异性，强调了簇形成的固有随机性，并表明MADLS衍生的簇群体应主要以定性方式解释。

对于晶体接触变体Q126H和T102E（图9a,c）也进行了类似的MADLS分析，这些变体被选为具有增强结晶性的晶体接触变体，结构分析表明它们通过盐桥形成（T102E）或主要是极性/氢键贡献（Q126H）增强了结晶性。这两种蛋白质都从以四聚体物种为主的双峰尺寸分布开始，初始强度最大值分别为dH = 9.8 ± 1.3 nm和125.9 ± 36.6 nm（Q126H），以及dH = 7.3 ± 1.3 nm和87.2 ± 14.2 nm（T102E）。t = 0 h时的归一化强度分布（图9b）证实了所有四种变体的这种行为，显示了在dH = 13.3 nm（WT）、6.4 nm（Q207D）、10.7 nm（Q126H）和6.7 nm（T102E）处的主导四聚体峰，以及在较大流体动力学直径117.7、97.2、98.6和107.7 nm处的较弱峰。在结晶过程中，Q126H发展出了明显的瞬态簇群体，范围从几十纳米到几百纳米，与其相对快速的成核一致，tnuc,end = 0.275 ± 0.035 h。对于成核更快的T102E变体（tnuc,end = 0.050 h），大直径峰在最早的采样时间就已经出现，并迅速移动到MADLS可检测尺寸窗口的上端，因此只能有限地捕获中间簇尺寸。t = tnuc,end时的归一化强度分布（图9d）主要由高流体动力学直径的宽峰组成，说明了在成核爆发结束时大簇和晶体群体的积累。图9显示了LbADH Q126H和T102E变体的MADLS成核行为的表征。(a) Q126H突变体的时域强度加权流体动力学直径分布的气泡图，每个气泡代表其流体动力学直径dH处的峰和采样时间。气泡面积与归一化强度峰面积成正比，因此反映了每个尺寸群体的相对贡献。(c) T102E突变体的相应气泡图。(b) 结晶开始时（t = 0）WT（蓝色）、Q207D（绿色）、Q126H（紫色）和T102E（红色）突变体的示例归一化散射强度分布I/Imax作为dH的函数。(d) 同种蛋白质变体在成核爆发结束时的归一化强度分布（t = tnuc,end），突出了成核期间较大簇群体的积累。明暗气泡的颜色表示两次独立的实验重复，黑色虚线垂直线表示tnuc,end。（c0 = 5 g·L?1，100 g·L?1 PEG 550 MME，ns = 150 rpm，50 mM Tris-HCl，25 mM MgCl2，10 mM HEPES-NaOH，pH 7.0，T = 20 °C）。为了说明浊度的出现如何影响主要的相关性信号，图10比较了在t = 0 h和t = tnuc,end时记录的代表性后向散射自相关函数g2(τ) ? 1。在t = tnuc,end时，截距的减小和更平缓的衰减与由于浊度增加导致的相关性对比度丧失以及多次散射的开始一致，即使对于浊度较低的样品，多次散射也会扭曲自相关函数[28]。图10. 在间歇性MADLS监测下搅拌的7 mL LbADH结晶过程中的后向散射强度自相关函数g2(τ) ? 1。(a) t = t0时的自相关函数。(b) t = tnuc,end时的自相关函数，对应于结晶器中可见浊度的开始。曲线分别代表LbADH WT（蓝色）、Q207D（绿色）、Q126H（紫色）和T102E（红色）。(c0 = 5 g·L?1，100 g·L?1 PEG 550 MME，ns = 150 rpm，50 mM Tris-HCl，25 mM MgCl2，10 mM HEPES-NaOH，pH 7.0，T = 20 °C)。为了将这些定性观察结果与动力学描述符联系起来，使用第2.6节中描述的成核模型评估了MADLS时间序列，所得模型参数总结在表2中。表2. 通过基于MADLS的动力学分析获得的Lactobacillus brevis酒精脱氢酶WT及其变体的成核模型参数结果，列出了成核爆发结束时间tnuc,end（以小时为单位）、结晶分数X(tnuc,end）（占总蛋白的百分比）、临界可溶性蛋白浓度ccrit（以g·L?1为单位）和表观初级成核速率常数knuc（以h?1为单位）。WT、Q126H、K32A和D54F的结晶分数X(tnuc,end)在1.68 ± 0.20%到3.77 ± 0.88%的范围内，表明这些变体在成核爆发期间将相似比例的蛋白质转移到非可溶相中。相比之下，T102E的结晶分数显著较高，为12.28%；然而，这个值应该结合实验时间来解释，因为T102E的第一个MADLS采样点已经对应于大部分蛋白质已经离开可溶相的状态。另一方面，突变体Q207D的结晶分数仅为0.04%，尽管MADLS数据也显示其形成了与WT相当的簇群，这与它通常较差的结晶倾向一致，并表明在成核过程中有大量蛋白质积累在缓慢转化的前晶态中。除了T102E外，所有蛋白质变体的临界可溶性蛋白浓度ccrit都集中在4.81 ± 0.04到4.99 g·L?1的狭窄范围内，而T102E的临界可溶性蛋白浓度略低，为4.39 g·L?1。表观初级成核速率常数knuc从0.13 h?1（Q207D）系统地增加到1.34 ± 0.09 h?1（WT），再到1.70 ± 0.15 h?1（Q126H），3.42 ± 0.44 h?1（K32A），5.45 h?1（D54F），以及21.57 h?1（T102E），这与之前报道的这些晶体接触变体的结晶行为趋势一致[16,17,18,20,21]。此外，这种排序与Hermann等人[20]计算的ΔΔG值一致，ΔΔG表示突变体和野生型结晶之间的自由能差异，为观察到的接触依赖性趋势提供了定量热力学解释。此外，knuc的排序也可以通过晶体接触处分子间相互作用的增强或减弱来解释。设计用于引入或增强吸引性静电作用（T102E）、极性和氢键作用（Q126H）、离子介导的静电作用（K32A）或芳香族接触作用（D54F）的变体预计会促进持续的早期蛋白质-蛋白质相互作用，从而促进稳定晶核的形成，加速初级成核。相反，在接触区域引入酸性侧链（Q207D）会改变局部电静力环境，使得有效的结合变得不那么有利，这与显著降低的knuc一致。由于许多DLS成核研究是在静止的微升滴液或毛细管中进行的[42]，这里报告的绝对动力学应理解为特定于搅拌结晶器的。然而，突变依赖的趋势仍然可以直接比较。

4. 结论
在这项工作中，我们结合了制备结晶、SEC/SE-HPLC分析和原位MADLS技术，以解析Lactobacillus brevis酒精脱氢酶的搅拌结晶早期阶段。第一个关键结果是，经过冻干和再溶解后的结晶产生了高纯度的、主要为同四聚体的LbADH制剂，这些制剂非常适合用于机制性成核研究，而仅使用标准IMAC纯化方法会留下低分子量杂质和少量寡聚副产物。SEC和SE-HPLC数据显示，在所研究的条件下，成核过程不会积累可以通过色谱方法分离的长期存在的寡聚中间体。时间分辨的MADLS结合专用的介观成核模型，通过提供对簇群形成和衰减的访问，并得出定量描述符（如成核爆发的结束时间、结晶分数、临界可溶性蛋白浓度和每个变体的表观初级成核速率常数）来填补这一空白。所有LbADH变体都被发现从狭窄的、以四聚体为主的尺寸分布开始结晶，而晶体接触突变调节了成核爆发的时间和强度，但没有显著影响临界可溶性浓度。此外，初级成核速率常数的排序可以通过晶体接触相互作用的改变来合理解释。特别是，通过盐桥形成的静电增强（T102E）产生了最快的成核速度，而极性和氢键作用的增强（Q126H）、离子介导的静电稳定（K32A）以及芳香族接触修饰（D54F）则导致中等程度的加速。相反，在接触区域引入酸性侧链（Q207D）改变了局部电静力环境，使得有效的结合变得不那么有利，这与显著降低的knuc一致。由于许多DLS成核研究是在静止的微升滴液或毛细管中进行的[42]，这里报告的绝对动力学应理解为特定于搅拌结晶器的。然而，突变依赖的趋势仍然可以直接比较。

4. 结论
在这项工作中，我们结合了制备结晶、SEC/SE-HPLC分析和原位MADLS技术，以解析Lactobacillus brevis酒精脱氢酶的搅拌结晶早期阶段。第一个关键结果是，经过冻干和再溶解后的结晶产生了高纯度的、主要为同四聚体的LbADH制剂，这些制剂非常适合用于机制性成核研究，而仅使用标准IMAC纯化方法会留下低分子量杂质和少量寡聚副产物。SEC和SE-HPLC数据显示，在所研究的条件下，成核过程不会积累可以通过色谱方法分离的长期存在的寡聚中间体。时间分辨的MADLS结合专用的介观成核模型，通过提供对簇群形成和衰减的访问，并得出定量描述符（如成核爆发的结束时间、结晶分数、临界可溶性蛋白浓度和每个变体的表观初级成核速率常数），从而填补了这一空白。所有LbADH变体都被发现从狭窄的、以四聚体为主的尺寸分布开始结晶，而晶体接触突变调节了成核爆发的时间和强度，但没有显著影响临界可溶性浓度。此外，初级成核速率常数的排序可以通过晶体接触相互作用的改变来合理解释。特别是，通过盐桥形成的静电增强（T102E）产生了最快的成核速度，而极性和氢键作用的增强（Q126H）、离子介导的静电稳定（K32A）以及芳香族接触修饰（D54F）则导致中等程度的加速。相反，在接触区域引入酸性侧链（Q207D）会减弱成核并延迟大直径簇群的出现。这表明，将原位多角度DLS与简单的动力学框架结合起来是一种强大的策略，可以比较工程化蛋白质变体的成核特性，并将晶体接触设计与技术相关的搅拌结晶器中的成核行为联系起来。

补充材料
以下支持信息可以在以下链接下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/cryst16020148/s1，图S1. 搅拌7 mL批次结晶器和7 mL流式结晶器中LbADH WT及其晶体接触变体的比较。在结晶过程中不可溶性蛋白浓度的时间演变：(a) WT，(b) Q207D，(c) K32A，(d) Q126H，(e) D54F和(f) T102E。绿色符号表示在标准搅拌7 mL批次结晶器中进行的实验，红色符号表示在集成到外部MADLS流式设置中的搅拌7 mL结晶器中进行的实验。实线代表根据方程(3)进行的逻辑拟合。(c0 = 5 g·L?1，100 g·L?1 PEG 550 MME，ns = 150 rpm，50 mM Tris-HCl，25 mM MgCl2，10 mM HEPES-NaOH，pH 7.0，T = 20 °C)。图S2. 用于LbADH的SEC和SE-HPLC分析的色谱柱的校准。(a) 分离范围约为10–200 kDa的球状蛋白的尺寸排阻柱（Superdex? 200 Increase 10/300 GL）的校准曲线，通过注射低分子量凝胶过滤标准品获得。(b) 分离范围约为3–75 kDa的柱子的相应校准（Superdex? 75 Increase 10/300 GL）。(c) 使用蛋白质标准混合物对有效分离范围达到约650 kDa的SE-HPLC柱（Inertsil WP300 Diol）进行校准。符号表示实验数据点，实线表示线性回归拟合。每个面板中都标出了相应的拟合方程和决定系数，并用于将洗脱位置转换为正文中的表观分子质量。表S1. 比较了从7 mL搅拌批次反应器和7 mL搅拌旁路反应器结晶中获得的LbADH WT及其晶体接触变体的结晶变量和结果，包括起始浓度c0、24小时后的平衡浓度ceq以及产率Y。这些值是根据方程(2)使用质量平衡计算得出的。还显示了方程(3)的逻辑拟合函数的参数（最大浓度cmax,X、晶体生长因子kX和拐点t1/2,X）。此外，还给出了决定系数R2和拟合函数之间的计算均方根偏差（RMSD），以说明偏差。(c0 = 5 g·L?1，100 g·L?1 PEG 550 MME，ns = 150 rpm，50 mM Tris-HCl，25 mM MgCl2，10 mM HEPES-NaOH，pH 7.0，T = 20 °C)。