《Acta Physiologica》：Kisspeptin Restores Placental mTOR Signaling and Improves Glucose Homeostasis Mediators Disrupted by Maternal Hypothyroidism in Rats
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本文探讨了母体甲状腺功能减退（MH）如何扰乱大鼠的母体糖稳态与胎鼠生长，并揭示kisspeptin-10（Kp10）治疗可部分恢复胎盘中关键的mTOR信号通路（p-mTOR/mTOR）和葡萄糖代谢调节因子（如GLUT1、IGF1/IGF1R）的表达，为通过靶向kisspeptin信号改善妊娠并发症提供了新思路。
摘要
本研究旨在评估母体甲状腺功能减退（MH）及kisspeptin-10（Kp10）治疗对大鼠母体能量稳态以及胎盘中mTOR和葡萄糖代谢调节因子表达的影响。结果显示，MH导致母体糖耐量受损、胰岛素和高密度脂蛋白（HDL）水平降低、胎鼠和胎盘重量减轻，并使胎盘血合膜（interhaemal membrane）变薄。在胎盘分子层面，MH上调了胰岛素受体β（INSRβ）和蛋白激酶B（AKT）的表达，同时下调了磷酸化mTOR与总mTOR的比值（p-mTOR/mTOR）以及葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）。尽管Kp10治疗未能改善母体葡萄糖稳态或防止胎鼠-胎盘生长受限，但它减轻了MH诱导的胎盘GLUT1表达失调，上调了胰岛素样生长因子1及其受体（IGF1/IGF1R）轴，并恢复了胎盘AKT/mTOR的表达。这些发现表明，在甲状腺功能减退的孕鼠中，Kp10治疗可改善胎盘mTOR信号传导和葡萄糖代谢调节因子，揭示了kisspeptin调控胎盘生理的新途径。
1 引言
胎盘在妊娠期间通过调节母体代谢和支撑胎儿生长扮演着核心内分泌角色，其功能紊乱与妊娠期糖尿病（GDM）、子痫前期和宫内生长受限（IUGR）等妊娠疾病相关。在分子水平上，胎盘胰岛素信号和代谢的变化，特别是IRS/PI3K/AKT/mTOR通路的改变，与异常的胎儿生长和妊娠疾病密切相关。mTOR复合物1（mTORC1）是关键的胎盘营养传感器。母体甲状腺功能减退是一种重要的妊娠代谢疾病，与胎盘功能障碍和IUGR相关，但其对胎盘mTOR信号的潜在影响尚未被研究。同时，甲状腺功能减退也与母体葡萄糖稳态受损和胎盘激素（包括kisspeptin）减少有关。给予甲状腺功能减退孕鼠kisspeptin-10（Kp10）已被证明可以通过减少炎症和氧化应激来改善宫内环境并促进胎儿发育。尽管kisspeptin主要以其调节下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴的作用而闻名，但它现在也被认为是维持健康妊娠的关键肽。新兴证据还表明，kisspeptin通过调节胰岛素释放和刺激妊娠期间胰腺β细胞适应来参与葡萄糖稳态。然而，关于kisspeptin在妊娠期间发挥代谢效应的胎盘分子通路，我们仍知之甚少。本研究假设母体甲状腺功能减退会破坏胎盘mTOR信号和葡萄糖代谢，而kisspeptin-10治疗可以恢复这些通路，从而改善母体葡萄糖稳态。
2 结果
2.1 母体Kp10治疗不影响甲状腺功能减退孕鼠的血糖异常、降低的血浆胰岛素和HDL水平
研究确认了甲状腺功能减退的成功诱导。在妊娠第16天（GD 16），MH显著增加了空腹血糖水平，并导致葡萄糖不耐受。在GD 18，MH显著降低了随机血浆胰岛素水平。尽管MH导致血糖异常，但母体胰腺质量和胰岛素阳性胰岛数量在各组间无显著差异。在脂质代谢方面，MH显著降低了血浆高密度脂蛋白（HDL）水平。Kp10治疗未能改善MH引起的任何母体血糖、胰岛素或HDL异常。
2.2 Kp10治疗未能缓解甲状腺功能减退引起的胎鼠生长受限
MH显著降低了GD 14和GD 18的母体体重增加。在胎儿发育方面，MH导致GD 14和GD 18的胎鼠质量显著降低，Kp10治疗未能防止这种降低。在GD 14，MH显著降低了胎盘质量，而Kp10治疗部分缓解了这一影响。然而，到GD 18，MH本身不再影响胎盘质量，但接受Kp10治疗的甲状腺功能减退动物胎盘质量却显著降低。MH还与新生后代体重的显著降低相关，Kp10治疗在雌性新生儿中显示出预防这种降低的趋势，但未达到统计学显著性。
2.3 Kp10治疗预防甲状腺功能减退引起的连接区糖原积累
在GD 18，MH显著降低了基底蜕膜和连接区的体积。PAS染色显示，在GD 14，MH显著增加了连接区的糖原积累，而Kp10治疗完全改善了这种效应。细胞角蛋白和波形蛋白双重免疫染色显示，各组间迷路区的胎儿毛细血管、母体血窦和滋养细胞的绝对体积或表面积无显著差异。然而，MH显著使血合膜变薄，Kp10治疗未能逆转此效应。
2.4 Kp10治疗减轻了甲状腺功能减退引起的胎盘Glut1失调
在GD 14，MH显著降低了迷路区的GLUT1免疫染色。在GD 18，MH显著增加了连接区和迷路区的GLUT1免疫染色。Kp10治疗防止了连接区的GLUT1增加（尽管水平仍适度高于对照组），并在迷路区部分阻止了GLUT1增加，使其与对照组无显著差异。在转录水平，MH对Glut1 mRNA水平无显著影响，但Kp10治疗显著增加了Glut1的表达。
2.5 母体甲状腺功能减退增加胎盘INSRβ表达，而Kp10上调IGF1/IGF1R表达
在GD 14，MH显著增加了两个胎盘区的INSRβ标记。虽然MH和对照组在IGF1R表达上无显著差异，但Kp10治疗显著增加了连接区和迷路区的IGF1R免疫染色。在转录水平（全胎盘分析），MH显著上调了Igf1表达，Kp10治疗减轻了此效应，将Igf1水平恢复至与对照组相似。在GD 18，各组间INSRβ和IGF1R免疫染色面积无显著差异，但定性观察发现两个甲状腺功能减退组（未治疗和治疗）的IGF1R染色较对照组减弱甚至缺失。在转录水平，Kp10治疗显著增加了Igf1和Igf1r的表达。
2.6 母体Kp10治疗逆转了GD 14甲状腺功能减退诱导的胎盘AKT/mTOR失调
在GD 14，MH显著增加了迷路区的AKT免疫染色，Kp10治疗改善了此效应，将染色面积恢复至对照水平。MH显著降低了两个胎盘区的p-mTOR表达，Kp10治疗完全防止了这种降低。与此一致，胎盘mTOR mRNA表达在MH组也降低，Kp10治疗将mTOR转录水平恢复至对照水平。在GD 18，各组间AKT免疫染色无显著差异。然而，MH显著降低了迷路区的p-mTOR免疫染色，Kp10治疗未能逆转此降低。
3 讨论
本研究表明，母体甲状腺功能减退在孕鼠中引起的血糖失调和胎鼠-胎盘受限与胎盘GLUT1和INSRβ表达改变以及AKT/mTOR信号传导紊乱有关。值得注意的是，母体Kp10治疗改善了GLUT1表达，使AKT/mTOR信号正常化，同时还上调了IGF1/IGF1R轴。这些发现揭示了kisspeptin改善甲状腺功能减退条件下胎儿发育和宫内环境的新机制。
母体甲状腺功能减退导致空腹血糖升高、糖耐量受损以及血浆胰岛素和HDL水平降低。胰岛素循环水平降低不伴有胰腺质量或胰岛素阳性胰岛的减少，表明胰岛素分泌受损而非胰岛细胞丢失。母体糖代谢紊乱可能损害胎儿的营养供应，从而导致胎鼠-胎盘受限。Kp10治疗未能改善甲状腺功能减退孕鼠的血糖异常，其代谢作用可能是短暂的，且依赖于实验时机。
MH导致的胎鼠和胎盘质量减少、胎盘区体积减小以及连接区糖原细胞群增加，是大鼠母体甲状腺功能减退的已知特征。本研究中观察到的GD 14胎盘血合膜厚度减少是一个新颖的发现，可能代表胎盘试图增强物质转运以适应生长受限胎儿的代偿机制。尽管Kp10治疗未能恢复胎鼠-胎盘生长或使变薄的血合膜正常化，但它使连接区的糖原细胞群正常化，并显示出改善雌性新生后代体重的趋势。
研究还发现，母体甲状腺功能减退扰乱了胎盘GLUT1蛋白表达，在GD 14减少，在GD 18增加。这种失调可能代表一种代偿反应。同样，胰岛素受体INSRβ和Igf1的上调，以及它们共同的下游效应物AKT的上调，也可能是增强胎盘葡萄糖摄取的代偿机制。mTOR表达的降低可能反映了细胞对感知到的营养限制的反应。mTOR下调是与IUGR相关的妊娠疾病的标志。这是首次研究证明母体甲状腺功能减退中胎盘mTOR表达降低。甲状腺功能减退动物中AKT表达的增加可能也是mTOR水平降低的代偿机制。
有趣的是，母体Kp10治疗在GD 14恢复了甲状腺功能减退大鼠的胎盘mTOR表达。Kp10治疗还增加了GD 14的胎盘IGF1R表达，以及GD 18的Igf1和Igf1r转录本。这些变化可能反映了观察到的mTOR上调。Kp10诱导的mTOR和Igf1/IGF1r/Igf1r信号的上调不足以逆转胎鼠质量减少和胎盘形态改变，但这些分子适应可能有助于减轻母体甲状腺功能减退造成的损害。
4 材料与方法
4.1 动物
使用Wistar大鼠，饲养于受控环境中。
4.2 实验设计
将未交配雌性大鼠随机分为三组：对照组、甲状腺功能减退组和用Kp10治疗的甲状腺功能减退组。通过口服丙硫氧嘧啶（PTU）诱导甲状腺功能减退。Kp10治疗从妊娠第8天开始。动物在GD14和GD18被安乐死。在GD16进行腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）和腹腔胰岛素耐量试验（IPITT）。另一些动物被允许分娩，记录后代体重。
4.3 腹腔葡萄糖耐量试验和腹腔胰岛素耐量试验
按标准程序进行IPGTT和IPITT，计算曲线下面积。
4.4 尸检和样本收集
在早晨进行安乐死，收集血液、胎盘、胎儿和母体胰腺样本进行处理和分析。
4.5 循环中激素和代谢物的分析
通过ELISA测量游离T4和血浆胰岛素，通过生化分析仪量化甘油三酯、总胆固醇和HDL，通过公式计算LDL。
4.6 胎盘组织形态计量学分析
对胎盘切片进行H&E、PAS-Fast Green和细胞角蛋白-波形蛋白双重染色分析。测量胎盘各区体积、糖原积累、迷路区各腔室体积和表面积、胎儿毛细血管参数、血合膜厚度及理论扩散能力。
4.7 胎盘和母体胰腺代谢蛋白的免疫组织化学分析
使用针对INSRβ、IGF1R、p-mTOR、GLUT1、AKT和胰岛素的一抗进行免疫组化染色，并通过ImageJ软件定量分析染色面积。
4.8 胎盘代谢基因的qRT-PCR分析
从胎盘组织提取总RNA，进行反转录和实时定量PCR，分析Insr、Irs1、Igf1r、Igf1、mTor、Raptor、Glut1、rPrl、PlII和Leptin等基因的表达。
4.9 统计分析
使用混合线性模型、方差分析（ANOVA）等方法进行统计分析，显著性水平设定为p < 0.05。
