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本篇研究通过创新的超分子策略，显著提升了并四苯（RUB）纳米聚集体在水相中的电化学发光（ECL）性能。该工作利用空穴传输分子（如TPD）同时作为氧化还原介导剂和光物理调控剂，有效抑制了单线态裂变（SF），同时保留了三重态-三重态湮灭（TTA），从而大幅提高了光致发光量子效率（2.3倍）和ECL强度（50倍）。这种双介导策略不仅降低了发光电位，还成功将RUB纳米聚集体应用于高亮度ECL成像，为开发高性能水性ECL纳米发光体开辟了新途径。
1. 引言
电化学发光（Electrochemiluminescence, ECL）是一种通过电化学反应产生激发态发光的分析技术，兼具化学发光的高灵敏度与电化学的可控性。它在生物分析领域已得到广泛应用，并展现出如ECL显微成像等新前景。然而，当前ECL技术主要依赖于贵金属配合物（如Ru、Ir）探针，开发高效、低成本的新型发光体是ECL发展的重要方向。尽管各类材料，尤其是纳米结构粒子，已被提出作为先进发光体，但在水相条件下构建兼容性好、性能优异的ECL探针仍面临巨大挑战。这主要是因为水相狭窄的电化学窗口要求探针与共反应物具有足够低的氧化还原电位以产生自由基离子，同时，对发光体的激子管理也至关重要。
并四苯（Rubrene, RUB）因其独特的电子结构，在光电子学领域已被充分开发为高效的三重态-三重态湮灭（Triplet-Triplet Annihilation, TTA）材料。RUB也是最早报道的ECL发光分子之一，其ECL发射中TTA的贡献已得到证实。然而，RUB较差的水溶性限制了其在水相生物分析中的应用。我们之前的研究表明，纯有机分子的小型纳米聚集体（Nanoaggregates, NAs）在水相中展现出潜力。但遗憾的是，在RUB的聚集态中，单线态裂变（Singlet Fission, SF）而非TTA主导了激子过程，导致发光量子效率低下。本研究提出了一种超分子策略，同时调控RUB NAs中的激子过程和共反应物的电化学行为，实现了水相中前所未有的ECL性能，使其成为ECL显微成像的有力候选者。
2. 实验方法
2.1 纳米粒子合成
本研究利用微流控芯片，通过流体聚焦结构实现快速、稳定的纳米闪蒸过程，从而合成尺寸可控的纳米粒子。RUB、N,N'-二苯基-N,N'-二(对甲苯基)联苯胺（TPD）和DSPE-PEG2k溶解于四氢呋喃（THF）中并充分混合。THF混合物以5 μL/min的流速注入微流控芯片的有机相入口，同时超纯水以100 μL/min的流速泵入水相入口。在交叉单元处，水相和有机相汇合，形成层流，THF溶剂迅速蒸发到水相中，导致包括RUB和TPD在内的疏水分子沉淀，DSPE-PEG2k的疏水链快速吸附在形成的聚集体表面，其亲水端确保纳米粒子在水相中均匀分散和稳定。当RUB和TPD的进料浓度均为1 mM时，所得纳米粒子的平均粒径约为30 nm。
2.2 荧光寿命拟合模型
所有寿命拟合均在Origin 2025b中使用非线性最小二乘算法进行，并应用仪器响应函数（IRF）去卷积。荧光衰减曲线用单指数、双指数或三指数函数拟合，并根据约化卡方（χ2）和残差随机性选择最优模型。
2.3 荧光量子产率测量
采用相对法测量荧光量子产率（Fluorescence Quantum Yield, FLQY）。使用已知FLQY的标准样品（荧光素），在相同激发波长下，通过公式计算待测样品的量子产率。公式中，下标ref和s分别代表参考标准和样品，QY代表FLQY，F表示激发波长下的积分荧光强度，A表示激发波长下的吸光度，n为溶剂的折射率。
2.4 ECL动力学成像
ECL动力学成像在倒置光学显微镜上进行。发射光通过100倍物镜（NA 0.5）收集，并使用电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机检测。采用三电极电化学池，包括氧化铟锡（ITO）工作电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极。施加+1.0 V电位以启动ECL反应。电解液为含有50 mM三丙胺（TPrA）和不同组成纳米粒子的PBS（pH 7.4）。动力学测量使用1 ms曝光时间采集2000帧连续图像，并在5×5像素区域内记录模数（A/D）计数。
2.5 图案化ITO电极制备总结
图案化ITO电极通过标准紫外光刻技术制备。ITO玻璃基底依次用丙酮、异丙醇和去离子水清洗，并进行氧等离子体处理以提高表面清洁度和光刻胶附着力。然后将负性光刻胶旋涂到ITO表面，并进行软烘烤以形成均匀的绝缘层。光刻胶通过光掩膜曝光以定义所需的微结构，随后进行显影和后烘烤以去除未曝光区域并稳定图案结构。所得基底由暴露的导电ITO区域和包围的电绝缘光刻胶组成，可直接用作ECL成像实验的工作电极。
3. 结果与讨论
RUB是研究最深入的半导体分子之一，由于其独特的电子结构（S1 ～ 2 × T1），既能进行高效的TTA，也能发生高效的反向过程SF。TTA遵循Dexter型能量转移机制，是一个短程过程，因此需要较高的RUB含量才能发生。然而，研究表明，在RUB的固态（如聚集体或薄膜）中，超快SF主导了TTA，是导致这些系统中浓度猝灭的主要原因。用庞大的基团修饰RUB可以显著降低固态中的SF，但电子结构的改变也会抑制TTA。我们之前证明，通过使用分子基质，有机分子的光物理性质可以在NAs中得以保留。受OLED中主体-客体分子系统（以固态薄膜形式构建）的启发，我们在此证明，在高RUB含量的空穴传输分子基质中，SF可以被削弱，而TTA可以高效进行。我们选择了几种常用的小分子（TPD、NPB和CBP）作为基质分子，期望其扭曲的几何结构能减少相邻RUB分子间的相互作用。它们的空穴传输特性也在ECL研究中被考虑和讨论。
通过微流控芯片辅助制备了脂质-聚合物（DSPE-PEG）封装的水溶性NAs。通常，制备了由等摩尔比的RUB和TPD组成的杂化NAs（RUB-TPD），直径约为30 nm，用于研究。与RUB在有机溶液中显示单指数衰减（寿命约14 ns）不同，无论是否含有基质分子，RUB NAs均显示多指数衰减曲线，这些曲线可以用三指数衰减函数很好地拟合。RUB NAs的荧光衰减更快，一个显著缩短的荧光寿命（3.2 ns）主导了振幅。基于该领域的广泛研究，可以确认RUB NAs中发生了SF，这可以解释其较低的FLQY（13%）。
随着基质分子（TPD、NPB或CBP）的加入，杂化NAs的荧光大大增强。虽然这些空穴传输分子在紫外照射下能发出荧光，但通过使用更长的激发波长（480 nm），有效地排除了它们的发射。此外，基质分子（TPD）的存在不会改变RUB的吸收光谱，这排除了基态电子耦合。RUB在杂化NAs中的荧光增强归因于SF的抑制。这可以通过快组分荧光寿命（τ1）的增加和长寿命组分（τ2）振幅的增加来证实。更重要的是，延迟组分（超过140 ns）振幅贡献的显著增加证实了高效的TTA（τ3）。尽管详细的激子动力学需要进一步研究，但抑制SF同时保持TTA实现了一个长期寻求的“最佳平衡点”，这最大限度地提高了电致发光和ECL应用中的三重态激子利用率（其中75%的激子是三重态）。总之，寿命组分的变化支持了激子管理效应（抑制SF并保留TTA），这为接下来讨论的ECL增强提供了直接的光物理依据。
虽然SF和TTA都依赖于分子间耦合，但研究表明，通过增加分子间距离或使用分子间隔物来分离RUB分子，可以达到最佳的分子间耦合。考虑到三种基质分子（TPD、NPB和CBP）的分子尺寸相当，它们电子结构的差异应能解释其抑制SF的性能。由于LUMO是电子转移的跳跃位点，间隔分子的高LUMO能级为分子间电子转移提供了能量势垒。根据这一规则，具有非常高LUMO能级的TPD能有效抑制RUB的SF，并表现出最佳性能。具有相对较低LUMO能级的NPB和CBP，其SF抑制能力不如TPD。作为对比，还研究了一种电子传输分子Alq3（其LUMO能级更低）的SF抑制能力。结果，它抑制了RUB的荧光发射。这些比较表明，高LUMO能级在改善RUB光物理性质方面具有重要作用。由于其出色的性能（在等摩尔比下约2.3倍，FLQY = 30%），TPD在后续的ECL研究中被主要讨论。
RUB可以通过湮灭型（RUB++ RUB-→ RUB*）和共反应物途径在有机溶液中产生ECL。由于RUB的还原电位超出水的电化学窗口，在水溶液中更倾向于共反应物途径。使用TPrA作为氧化还原共反应物，其氧化分解产生强还原性中间体，随后与RUB阳离子发生离子湮灭以产生激发态（机制I）。结果显示，RUB NAs在阳极电位扫描下仅显示微弱的ECL信号。将TPD掺入RUB NAs后，实现了极大增强的ECL信号和更负的峰电位（0.97 V）。负移的峰电位使我们能够在水电化学窗口内以更低的电位实现最大ECL信号，获得了约50倍的信号增强。RUB-TPD NAs的ECL光谱与RUB的荧光光谱匹配良好，这表明RUB是ECL发光体，且发射来自激发单线态，这些单线态要么直接产生，要么来自TTA。上述介导的光物理性质无疑是改善ECL性能的基础。下文我们将证明TPD的电化学性质在改善RUB NAs的ECL行为中也起着重要作用。
TPD的氧化还原介导能力可以通过在有机溶液中的ECL研究来证实，其中RUB没有浓度猝灭或激子操控问题。在更宽的电位范围内，RUB经历两个连续的单电子氧化过程，第二个氧化还原过程可逆性较差。相比之下，在更窄的电位范围内，RUB的循环伏安曲线可逆性更好。从RUB的ECL-电位曲线来看，在1.24 V处产生了最大的ECL信号。RUB溶液中TPD的存在可以明显增强ECL强度，且随着TPD浓度的增加，峰电位逐渐负移。在RUB/TPD等摩尔比时达到最大ECL强度。由于TPD诱导的ECL峰电位负移，在较低电位下可以实现明显增强的ECL信号（2.8倍）。值得注意的是，RUB/TPD混合物的CV没有显示新的氧化还原特征，很大程度上类似于各组分信号的叠加，这表明在测试条件下氧化的TPD与RUB之间没有明显的副反应。
TPD的低氧化电位和TPD自由基阳离子的高氧化能力可以解释发光电位的移动和ECL强度的增强。如机制I所示，共反应物TPrA的氧化是产生强还原性中间体的关键步骤。由于TPrA在电极上的非均相氧化具有不可逆性和缓慢的动力学，通常需要使用更正氧化电位和更高TPrA浓度来实现更高的ECL效率。TPrA的氧化也可以通过发光体的氧化产物均相实现，这是共反应物途径复杂机制的起源，但也实现了均相氧化还原介导。TPrA存在下RUB还原波的消失表明了均相反应的存在（机制II中的方程式11）。TPD在阳极电位扫描过程中表现出两个准可逆的氧化还原过程，并且其氧化电位比RUB更负。TPD自由基阳离子与TPrA的均相反应也可以通过TPD还原波的减少或消失来证实。密度泛函理论（DFT）计算的结果也支持RUB和TPD自由基阳离子对中性TPrA的氧化能力。低位的单占据分子轨道（SOMO）形成了准闭壳层电子构型，这可以解释TPD自由基阳离子众所周知的稳定性。其未占据的自旋对应物（SUMO）足够深，可以接受来自中性TPrA的HOMO的电子，证实了其对TPrA的均相氧化或空穴传输能力（机制II中的方程式12）。
考虑到TPrA在电极上非均相氧化动力学的缓慢，RUB和TPD对TPrA的空穴传输速率应存在差异。这可以直接从它们对应的、可接受TPrA HOMO电子的空分子轨道的差异中得到证实。RUB有两个轨道可以接受电子，而TPD只有一个轨道可以从TPrA接受电子。尽管这些反应遵循外层电子转移机制，但采用马库斯电子转移理论来研究分子间的空穴传输速率。根据该理论，电子耦合（V）和重组能（λ）是决定空穴跳跃速率的关键参数。重组能包括内部重组能和外部重组能。内部重组能反映了分子几何结构的变化，在固态应用中被主要考虑。而在凝聚相中，外部重组能远小于内部重组能，通常被忽略。然而，考虑到溶液中自由基的带电状态和周围介质的电子极化，溶剂重组能不能被忽视。根据计算结果，外部重组能对总重组能λtot的贡献更大，实际上决定了空穴传输速率。与RUB自由基相比，TPD自由基对TPrA具有更小的λtot和更大的空穴跳跃速率。TPD包含引起的有机溶液中ECL增强可以通过RUB和TPD之间空穴传输能力的差异来解释。此外，TPD的氧化电位更负，且TPD自由基比RUB自由基更稳定，生成的RUB自由基仅参与离子湮灭并产生更多的ECL（机制II）。TPD对TPrA的氧化还原介导能力可以在RUB-TPD NAs中很好地保留，并且在使用相对较低TPrA浓度的水溶液中可以实现更高的ECL效率。
开发高效ECL发光体作为水相成像探针显示出巨大前景，特别是与具有时空高分辨率能力的先进检测系统相结合时。基于EMCCD的成像设备已经从[Ru(bpy)3]2+的ECL信号中分辨出其单分子电化学事件。在本工作中，使用类似设备获取的离散光子信号来展示RUB-TPD NAs的成像能力。与[Ru(bpy)3]2+的单光子离散信号相比，在相同的曝光条件下，RUB-TPD NAs获得了多光子信号。值得注意的是，在相同的采集条件下，脉冲振幅和发生频率随着TPD比例的增加而增加，这支持了杂化NAs中介导剂增强的ECL性能。
将RUB-TPD NAs作为ECL成像探针，通过图案化微电极阵列的成像来研究其性能。在这些实验中，[Ru(bpy)3]2+和RUB-TPD NAs均被用作均相成像探针，图案化电极用于空间定义ECL发射。在低工作电位（1.0 V）下，获得的成像图案与制造的微结构匹配良好。基于介导的ECL性能，RUB-TPD NAs在再现图案细节方面优于广泛应用的[Ru(bpy)3]2+。RUB-TPD NAs在生理兼容的操作条件下（尤其是在较低电位下）具有竞争力的ECL成像性能，可能在生物成像和生物分析中找到广泛应用。
4. 结论
半导体电荷传输和氧化还原活性是基于三苯胺的有机自由基的两个显著特征，并已分别在OLED和有机电合成等领域得到广泛应用。本工作将这两个特征及其它特性整合在一起，展示了前所未有的ECL应用和激动人心的成果。利用空穴传输分子作为不同类型发光体的ECL介导剂，可以建立一种通用策略。然而，RUB独特的分子结构及其自身优异的性能（如突出的空穴迁移率）对于这些成果的实现不容忽视。为了实现通用应用，需要建立ECL介导剂与发光体的匹配标准。TPD介导的RUB NAs值得成为评估阳极ECL行为的基准体系。其在水相条件下革命性的ECL行为，在生物传感、新型发光器件等领域展现出广阔的应用潜力。
