《Journal of Diabetes Research》：Genetic Evidence Reveals Causal Effect of Circulating Proteome on Random Glucose: A Mendelian Randomization Study
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这篇研究利用孟德尔随机化（Mendelian randomization, MR）方法，系统性地探究了循环蛋白质对随机血糖（random glucose, RG）的因果影响。通过整合九项全基因组关联研究（genome-wide association studies, GWAS）数据，研究识别出多个与RG存在因果关联的蛋白质，并发现其中近半数为潜在药物靶点。该工作为理解血糖调节的分子机制及开发针对代谢性疾病（如2型糖尿病，Type 2 diabetes, T2D）的新型治疗策略提供了重要的遗传学证据和新见解。
遗传证据揭示循环蛋白质组对随机血糖的因果效应：一项孟德尔随机化研究
摘要
血糖稳态对维持代谢平衡至关重要。随机血糖（random glucose, RG）检测因其无需考虑近期饮食摄入、可实时评估血糖水平的灵活性与便利性，在揭示代谢紊乱病理生理学方面具有重要意义。循环蛋白质组反映了机体的生理与病理活动，是探索健康与疾病状态蛋白质组的宝贵资源。本研究旨在利用全基因组关联研究（genome-wide association studies, GWAS）数据，通过孟德尔随机化（Mendelian randomization, MR）方法，识别与RG存在因果关联的循环蛋白质，从而探索潜在的药物靶点。
1. 引言
葡萄糖稳态受损是肥胖和2型糖尿病（Type 2 diabetes, T2D）等主要代谢性疾病发生的关键因素。与需要空腹测量的空腹血糖（fasting blood glucose, FBG）和受饮食影响显著的餐后血糖（postprandial blood glucose, PPBG）相比，RG提供了更大的灵活性。循环蛋白质组由全身各组织细胞产生并持续交换的蛋白质动态集合，其变化可反映疾病的生物学活动。基于GWAS发现的蛋白质定量性状位点（protein quantitative trait loci, pQTLs）为通过MR推断蛋白质水平变化与疾病之间的因果联系提供了有力工具。尽管已有研究提示某些循环蛋白（如促炎蛋白IL-6、脂联素adiponectin）在葡萄糖调节中扮演角色，但循环蛋白对RG的因果影响尚不明确。因此，本研究旨在通过MR分析，明确与RG水平存在因果关系的循环蛋白。
2. 材料与方法
本研究采用两样本MR分析评估循环蛋白与RG之间的因果关系。研究遵循孟德尔随机化报告规范（STROBE-MR），并使用公开的GWAS汇总数据。
2.1. 数据来源与工具变量选择
循环蛋白数据来自九项蛋白质组学GWAS。随机血糖的GWAS汇总统计数据来自葡萄糖和胰岛素相关性状荟萃分析联盟（MAGIC），包含约458,862名无糖尿病诊断且未服用降糖药物的欧洲裔个体。从蛋白GWAS中筛选pQTLs作为候选工具变量（instrumental variables, IVs），步骤包括：根据各研究推荐的p值阈值选择与任何蛋白相关的单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms, SNPs）；排除位于主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC）区域的SNPs；进行连锁不平衡（linkage disequilibrium, LD）聚类以识别每个蛋白的独立pQTLs；排除与五个及以上蛋白相关的工具变量。pQTLs被进一步分类为顺式pQTLs（cis-pQTLs，位于编码基因500 kb窗口内）和反式pQTLs（trans-pQTLs，位于编码基因500 kb外）。
2.2. MR与敏感性分析
分别使用顺式pQTLs以及全部（顺式+反式）pQTLs作为工具变量进行MR分析。主要采用逆方差加权法（inverse variance weighting, IVW）和Wald比率分析评估因果关系。通过Bonferroni校正进行多重检验校正。为评估多效性影响，进行了敏感性分析，包括使用加权中位数法（对多达50%无效工具变量稳健）和MR-Egger法（用于调整水平多效性）。
2.3. 共定位、方向性及其他分析
为评估LD导致的混杂，对MR优先蛋白的pQTLs与血糖性状进行了贝叶斯共定位分析，强共定位证据定义为假设H4的后验概率大于0.8。使用Steiger过滤法检验MR关联的方向性，排除反向因果关系。评估了顺式pQTLs是否为蛋白质改变变异体（protein-altering variants, PAVs）或与PAVs存在高LD。通过查询基因型-组织表达（Genotype-Tissue Expression, GTEx）门户网站数据，检查了pQTLs与表达数量性状位点（expression quantitative trait loci, eQTLs）的重叠情况。
2.4. 功能与靶点分析
利用STRING数据库进行蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络分析。使用R软件“ClusterProfiler”包进行基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析，以阐明蛋白质的生物学功能。将MR优先蛋白与Finan等人定义的4479个可成药或已成药基因组进行比对，评估其作为药物靶点的潜力，并利用治疗靶点数据库（Therapeutic Target Database）进行验证。
3. 结果
3.1. 遗传工具选择概览
经过筛选，从九项GWAS中总共识别出8258个pQTLs（对应4421个蛋白质），其中包括3811个顺式pQTLs（1558个独特蛋白）和4474个反式pQTLs（1763个独特蛋白）。
3.2. 血浆蛋白对RG的因果效应
在使用顺式pQTLs的MR分析中，经过Bonferroni校正后，14个独特蛋白显示出与RG的显著因果关联。其中，酪氨酸3-单加氧酶（YWHAB）、肝素结合生长因子（HDGF）、CAMP反应元件结合蛋白3样4（CREB3L4）和3′(2′),5′-双磷酸核苷酸酶1（BPNT1）与RG水平呈正相关。而磷酸葡萄糖变位酶1（PGM1）和丝氨酸肽酶抑制剂Kazal型4（SPINK4）与RG呈负相关。
在使用全部pQTLs的MR分析中，有31个独特蛋白在矫正后与RG相关。敏感性分析支持了这些发现的可靠性。
3.3. pQTLs与RG的共定位
对顺式MR分析识别的pQTLs进行共定位分析，发现8个蛋白关联具有强共定位证据（PPH4 ≥ 0.8），包括A6NHS7 (MANSC4)、CALCOCO2、CREB3L4、QPCTL、BPNT1、YWHAB、PGM1和HDGF。对所有pQTLs的MR分析识别的关联进行共定位分析，也有8个关联显示出强共定位证据。
3.4. Steiger过滤分析结果
Steiger过滤分析证实，在顺式MR分析中优先考虑的所有独特蛋白，其因果方向均一致地从蛋白指向RG。同样，在使用全部pQTLs识别的31个蛋白中，所有关联的方向一致性也得到了确认。没有关联被标记为不确定或反向。
3.5. PAV评估
在MR优先蛋白的顺式pQTLs中，评估了24个变体的潜在蛋白质改变效应。发现5个蛋白（PCSK1、HDGF、CALCOCO2、QPCTL和PGM1）本身是PAVs或与PAVs存在高LD。
3.6. pQTLs与eQTLs的重叠调查
在局限于顺式pQTLs的MR分析中，有11个变体在至少一种组织中也作为显著的eQTLs，且效应方向一致。在所有pQTLs的MR分析中未发现重叠。
3.7. MR优先蛋白的富集分析
蛋白质-蛋白质相互作用网络分析显示，在顺式pQTLs分析中，PCSK1和MANSC4存在直接相互作用。在所有pQTLs分析中，血管性血友病因子（VWF）作为一个中心节点，与F3、PRKG1等多个蛋白相互作用。GO通路富集分析显示，顺式MR优先蛋白主要富集于碳水化合物分解代谢过程、含胶原的细胞外基质和肽酶调节剂活性等通路。KEGG分析显示这些蛋白主要富集于嘌呤代谢、乙型肝炎和病毒致癌等通路。对所有MR优先蛋白的富集分析揭示了其在位置维持、分泌颗粒腔、硫酸酯水解酶活性和脂肪细胞脂解调节等过程中的主导作用。
3.8. MR优先蛋白的可成药性评估
根据Finan等人的分类方案，四个蛋白（VWF、凝血因子III（F3）、黄体生成素/绒毛膜促性腺激素受体（LHCGR）和羧酸酯酶1（CES1））被归类为Tier 1（已批准或处于临床开发阶段的药物靶点）。一个蛋白（蛋白激酶CGMP依赖性1（PRKG1））被归类为Tier 2。此外，在Tier 3A和Tier 3B级别分别识别出6个和4个蛋白。利用治疗靶点数据库，确定了14个MR优先蛋白为现有或潜在的药物靶点。其中，6个是文献报道的靶点（PCSK1、HDGF、CD209、PHGDH、ARL2、PRKG1），5个是具有已批准或临床使用药物的成功靶点（VWF、CES1、LHCGR、NEU1、F3），2个处于临床试验阶段（SULF2和PPY），1个是有专利记录的目标（PSIP1）。
4. 讨论
本研究采用综合方法，在九个蛋白质组学GWAS数据集中识别了血浆蛋白与RG之间的因果关联。两样本MR分析显示，使用顺式pQTLs时，14个独特蛋白与RG存在因果关联；使用全部pQTLs时，识别出31个独特蛋白。研究还阐明了与这些蛋白相关的潜在调节通路和治疗靶点。
研究发现，YWHAB、HDGF、CREB3L4和BPNT1的上调与RG水平升高存在因果关系，这与14-3-3蛋白家族的代谢影响以及其他蛋白在葡萄糖稳态中的作用相符。PGM1、QPCTL等蛋白的下调则可能通过影响糖原代谢和炎症反应间接影响代谢健康。在全部pQTLs分析中，神经氨酸酶1（NEU1）因其可调节胰岛素受体活性而被认为在胰岛素敏感性和葡萄糖稳态中可能发挥关键作用。
在药物靶点方面，胰腺多肽（PPY）作为神经肽Y家族成员，通过作用于Y4受体调节食欲和胃排空，凸显了其作为肥胖治疗新靶点的潜力。近半数被识别的蛋白被确认为可成药或现有药物靶点，为开发代谢性疾病新疗法提供了直接线索。
本研究的优势在于利用MR最小化了混杂偏倚，增强了因果推断的可靠性，并识别了新的因果关联。局限性包括所用GWAS数据仅涵盖欧洲裔人群，可能限制其普遍性；此外，血液中的蛋白浓度可能无法反映其在特定细胞和组织中的水平。
5. 结论
综上所述，本研究结果提供了特定循环蛋白与RG存在因果关联的证据。这些发现有助于理解血糖调节的分子机制，并为开发针对代谢性疾病（特别是涉及葡萄糖调节的疾病）的新型生物标志物和个性化治疗策略奠定了基础。未来研究需要阐明这些蛋白的病理生理学作用及其影响RG的分子机制。
