SERL1介导的OsALDH2B1磷酸化与稳定：水稻碱性胁迫耐受性提升与籽粒大小协同调控的关键通路

《Journal of Integrative Plant Biology》：A leucine-rich-repeat receptor-like kinase SERL1 phosphorylates and stabilizes OsALDH2B1 to promote alkaline tolerance and grain size in rice

本研究揭示了一条可同时打破作物产量与逆境耐受性经典权衡的新信号通路。在碱性胁迫下，位于细胞质膜的富含亮氨酸重复序列受体样激酶SERL1感知信号，磷酸化并稳定了兼具转录因子功能的乙醛脱氢酶OsALDH2B1。该通路通过抑制负调控因子GS3和激活全部三个过氧化氢酶(CAT)基因的表达，有效清除过氧化氢(H2O2)，从而协同增强了水稻的耐碱性和籽粒大小/产量，为培育高产、耐碱水稻品种提供了精准的分子育种靶点。

　　

OsALDH2B1正向调控水稻耐碱性和籽粒大小

通过对碱性胁迫下的微阵列数据进行重分析，在21个已知的籽粒大小调控转录因子中，包括OsALDH2B1在内的7个基因呈现差异表达。在碱性胁迫下，OsALDH2B1的表达显著上调，并在胁迫6小时后达到峰值，且其转录本和蛋白质在根部积累显著高于地上部。对10个水稻品种的分析显示，OsALDH2B1转录水平较高的品种耐碱性更强。敲除OsALDH2B1的osaldh2b1突变体耐碱性显著降低，而过表达OsALDH2B1的2B1-OE植株耐碱性则得到增强，并产生更大更重的籽粒。研究表明，OsALDH2B1增强的耐碱性与降低的H₂O₂积累相关，2b1突变体幼苗积累了更多的H₂O₂，而过表达植株积累更少，同时过表达植株的过氧化氢酶活性也显著提高。

OsALDH2B1在碱性胁迫条件下提高籽粒产量

田间试验表明，在正常条件下，OsALDH2B1过表达植株的单株产量和小区产量与野生型相当，但生殖分蘖数减少了20.9%–22.0%。在碱性胁迫条件下，2B1-OE植株的生殖分蘖数减少了约10%，但其单株籽粒产量增加了28.8%–31.9%，小区产量增加了20.5%–22.7%。这些数据表明，过表达OsALDH2B1在非胁迫条件下不减产，并能显著增强碱性耐受性和籽粒产量。

SERL1与OsALDH2B1物理互作以增强水稻耐碱性和籽粒大小

碱性胁迫导致了OsALDH2B1转录水平和蛋白水平的增加。质谱分析鉴定出体细胞胚胎发生受体激酶样蛋白SERL1是OsALDH2B1的潜在互作蛋白。生物信息学预测SERL1具有N端信号肽、串联亮氨酸重复序列、单个跨膜螺旋和C端胞质激酶结构域。亚细胞定位证实其定位于质膜。酵母双杂交、体外Pull-down、免疫共沉淀和双分子荧光互补实验均证实SERL1与OsALDH2B1直接相互作用。利用CRISPR/Cas9技术敲除SERL1产生的serl1突变体产生了更小更轻的种子，耐碱性显著下降，积累了更多的H₂O₂，过氧化氢酶活性降低。通过引入SERL1-GFP互补构建体能完全恢复野生型的种子大小和耐碱性，证实SERL1是维持正常籽粒发育和碱性胁迫存活所必需的。

SERL1是一种碱性激活的功能性LRR-RLK，可磷酸化OsALDH2B1的Thr-481位点

SERL1被证实是一种定位于质膜的活性激酶。体外磷酸化实验表明，SERL1^JMK及其组成型活性变体SERL1^JMK/K310D能将磷酸基团转移至OsALDH2B1，而激酶死亡变体SERL1^JMK/K310R则无此活性。质谱分析将Thr-481鉴定为主要的磷酸化位点，将该位点突变为丙氨酸(OsALDH2B1^T481A)可消除磷酸化。体内实验证实，碱性胁迫强烈诱导了OsALDH2B1的磷酸化，而这种磷酸化在serl1突变体中几乎被消除，说明SERL1是碱性条件下体内OsALDH2B1磷酸化的关键激酶。此外，SERL1的表达和积累模式与OsALDH2B1相似，在根部的响应更强。

SERL1通过磷酸化在碱性胁迫下稳定OsALDH2B1

磷酸化通常调控蛋白质的稳定性。在添加了ATP的体外降解实验中，野生型MBP-OsALDH2B1快速降解，而磷酸模拟型MBP-OsALDH2B1^T481D几乎保持完整，非磷酸化型MBP-OsALDH2B1^T481A则降解得更快。MG132可阻断所有三种形式的降解，证实了其降解依赖于26S蛋白酶体。在野生型原生质体中的瞬时表达实验再现了同样的稳定性层级。在serl1突变体提取物中进行的降解实验显示，MBP-OsALDH2B1降解更快，表明SERL1是OsALDH2B1稳定性所必需的。在碱性胁迫下，OsALDH2B1在野生型幼苗中被强烈诱导，而在serl1突变体中诱导很弱。此外，serl1-1/2B1-OE7双突变体的表型、存活率、ROS水平和过氧化氢酶活性介于cata-2和2B1-OE之间，免疫印迹也显示OsALDH2B1-cYFP在双突变体中的丰度仅适度升高，进一步证实SERL1在植物体内稳定OsALDH2B1。这些数据共同确立了SERL1是OsALDH2B1在调控水稻耐碱性和籽粒大小方面发挥功能所必需的、在遗传和生化上均不可或缺的正向调控因子。

OsALDH2B1作用于GS3的上游

GS3是籽粒大小和耐碱性的负调控因子。电泳迁移率变动分析和染色质免疫共沉淀-qPCR实验证实OsALDH2B1可直接结合GS3启动子。瞬时转录实验表明，OsALDH2B1可抑制GS3表达，而SERL1的共表达进一步增强了这种抑制作用。染色质免疫共沉淀-qPCR也显示，在serl1-1/2B1-OE7植株中，OsALDH2B1在GS3启动子上的占有率显著低于2B1-OE对照植株。在碱性胁迫下，与野生型相比，2B1-OE植株中质膜水通道蛋白PIP2;1的磷酸化和非磷酸化水平均显著升高，尽管磷酸化与非磷酸化的比例未变，这支持了OsALDH2B1通过抑制GS3来增加PIP2;1磷酸化从而促进H₂O₂外排的模型。通过杂交获得的2B1-OE7/GS3-1-flag双转基因植株产生的种子显著小于野生型和2B1-OE7，与GS3-1-flag种子类似，表明在籽粒大小调控方面，GS3位于OsALDH2B1的下游。在碱性胁迫下，双转基因幼苗表现出比2B1-OE更高的敏感性，H₂O₂积累介于两者之间。这些数据表明，OsALDH2B1介导的籽粒大小调控依赖于GS3，而其耐碱性调控则部分独立于GS3。

OsALDH2B1直接激活过氧化氢酶基因以增强耐碱性

OsALDH2B1可增强过氧化氢酶活性，而这种活性在GS3-1-flag与野生型之间，或在2B1-OE7与2B1-OE7/GS3-1-flag之间无显著差异，说明OsALDH2B1以不依赖GS3的方式提高过氧化氢酶活性。生物信息学分析在所有三个水稻过氧化氢酶基因(CatA, CatB, CatC)的启动子中发现了多个OsALDH2B1结合元件。在碱性胁迫下，这些基因的转录本在2b1突变体中显著降低，在2B1-OE植株中则显著升高。电泳迁移率变动分析和染色质免疫共沉淀-qPCR证实OsALDH2B1可在体外和体内结合这些区域。水稻原生质体瞬时表达实验表明，OsALDH2B1可激活CatA启动子，而SERL1的共表达可进一步增强这种激活。在serl1-1/2B1-OE7植株中，OsALDH2B1在CatA启动子上的占有率也显著降低。利用CRISPR/Cas9获得的cata、catb、catc敲除株系均表现出存活率降低，其中cata突变体在碱性胁迫下H₂O₂升高。2B1-OE7/cata-2双突变植株在碱性处理后的存活率高于cata-2，但低于野生型或2B1-OE7，H₂O₂积累和过氧化氢酶活性介于两者之间，表明部分拯救可归因于OsALDH2B1对CatB和CatC的代偿性上调。这些数据共同表明，OsALDH2B1作用于CatA的上游，并直接激活所有三个过氧化氢酶基因，以增强过氧化氢酶活性、清除H₂O₂，从而提高水稻耐碱性。