《Physiological Reports》：E-cigarette exposure impairs skeletal muscle mitochondrial function in male mice
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电子烟（E-cig）的使用日益普及，但其生理影响尚未明确。本研究发现，无论是体外细胞暴露还是小鼠在体暴露，电子烟（以及传统烟草烟雾）都会损害骨骼肌线粒体功能，但两者激活AHR（aryl hydrocarbon receptor）信号通路的模式存在差异。这项研究为深入理解电子烟对骨骼肌代谢的危害，及开发针对性干预措施提供了重要科学依据。
引言：电子烟使用激增与健康隐忧
近年来，随着传统卷烟使用率的下降，电子烟（E-cigarette, E-cig）的使用率却在全球范围内快速上升。特别是在美国，18-24岁的年轻人中使用电子烟的比例高达11%。值得注意的是，市面上电子烟产品的尼古丁浓度通常较高（3%至5%），这进一步加剧了对其潜在健康风险的担忧。尽管电子烟日益流行，但其对人体生理的长期生物学效应仍不清楚，这主要受限于长期流行病学研究的缺乏以及对电子烟气溶胶成分的监管不明确。已有研究表明，电子烟使用与多种不良健康结局相关，包括支气管扩张、哮喘恶化、心肌血流减少、动脉硬化加重以及内皮细胞功能障碍等。此外，在细胞和动物模型中的研究提示，电子烟暴露可能改变线粒体呼吸和骨骼肌功能。
传统烟草烟雾已知可通过持续激活芳烃受体（aryl hydrocarbon receptor, AHR）信号通路来损害骨骼肌线粒体功能。AHR是一种配体激活的转录因子，可响应多种环境和内源性配体，调控包括炎症和新陈代谢在内的众多细胞过程。其中，二噁英（TCDD）是烟草烟雾中一种被深入研究的主要AHR激活剂。然而，电子烟产品中是否含有可激活该通路的外源性AHR配体尚不清楚。因此，本研究旨在探究电子烟是否也能激活骨骼肌中的AHR通路，并导致线粒体功能障碍和肌肉收缩力受损。
材料与方法：体外细胞模型与体内动物实验
研究采用C2C12小鼠成肌细胞系进行体外实验。细胞在标准条件下培养和分化成肌管，之后分别暴露于对照溶剂、烟草烟雾冷凝物（TSC）或不同浓度的电子烟气溶胶冷凝物（VC）中16小时，以评估对AHR通路激活的影响。通过检测细胞活力、AHR通路相关基因（Ahr、Ahrr、Cyp1a1）的表达以及线粒体呼吸功能来评估暴露的影响。
在动物实验中，使用雄性C57BL/6J小鼠（12-16周龄），随机分为三组：吸入室内空气对照组、吸入烟草烟雾组和吸入电子烟组。采用定制的暴露系统，对急性暴露组进行单次2小时暴露，对慢性暴露组进行为期4周、每天2小时、每周5天的暴露。暴露结束后，收集小鼠血清检测可替宁水平，并取腓肠肌进行AHR通路基因表达、肌肉收缩力以及线粒体功能评估。线粒体功能通过高分辨率呼吸测量仪（OROBOROS O2k）进行测定，肌肉收缩功能则通过刺激坐骨神经原位评估足底屈肌复合体功能。
结果1：体外细胞实验证实AHR通路激活与呼吸功能受损
首先，在C2C12肌管细胞的体外实验中，研究人员发现烟草烟雾冷凝物和较高浓度的电子烟气溶胶冷凝物（0.3% VC）均能显著上调AHR信号通路下游基因Ahrr和Cyp1a1的表达，而Ahr基因的表达未受影响。这些处理并未改变细胞活力。这意味着电子烟产品确实含有AHR通路配体，但其激活该通路所需的浓度远高于烟草烟雾冷凝物。
进一步的线粒体呼吸功能评估显示，在state 2（基础呼吸）条件下，烟草烟雾和电子烟气溶胶冷凝物均降低了细胞耗氧率。更重要的是，在state 3（ADP刺激的最大呼吸）条件下，暴露于0.3%电子烟气溶胶冷凝物的肌管，其呼吸能力显著低于对照组。这表明即使在高浓度下，电子烟冷凝物也会损害肌肉细胞的线粒体呼吸功能。
结果2：体内急性暴露揭示AHR激活的差异
在活体动物实验中，研究人员观察了单次2小时暴露后的影响。血清可替宁检测证实，烟草烟雾和电子烟暴露都成功地使小鼠吸收了尼古丁，其水平与人类中重度吸烟者相当。然而，在暴露6小时后，对小鼠腓肠肌的分析显示，与体外结果不同，只有烟草烟雾暴露显著激活了骨骼肌中的AHR通路（表现为Ahrr、Cyp1a1和Cyp1b1基因表达上调），而电子烟暴露并未产生此效应。这一发现表明，电子烟产品中虽然可能含有AHR配体，但在所采用的体内暴露条件下，其含量或效力不足以激活骨骼肌中的AHR通路。这可能是由于电子烟产品所含的化合物种类（少于200种）远少于传统卷烟（含数千种化合物，包括TCDD等强效AHR配体）。
结果3：慢性暴露导致线粒体功能障碍，但肌肉收缩力未受影响
接下来，研究人员探讨了为期4周的慢性暴露对小鼠的长期影响。结果发现，与室内空气对照组相比，无论是烟草烟雾组还是电子烟组，小鼠的总体重和绝对后肢肌肉质量均无显著变化。然而，当将肌肉质量用体重进行标准化后，电子烟暴露组小鼠的相对肌肉质量显著降低，烟草烟雾组也呈下降趋势，提示吸烟可能破坏肌肉蛋白质合成与降解的平衡。
从分离的腓肠肌和跖肌线粒体呼吸功能检测来看，无论是烟草烟雾还是电子烟的慢性暴露，都显著降低了state 3（ADP刺激）呼吸速率，而state 2（基础）呼吸速率在各组间没有差异。这表明长期暴露会损害骨骼肌线粒体的最大氧化磷酸化能力。有趣的是，尽管观察到线粒体功能受损，但通过刺激坐骨神经进行的原位肌肉收缩力测试显示，烟草烟雾或电子烟暴露并未改变足底屈肌复合体的绝对力量、比力（单位肌肉质量的力量）或疲劳性。这可能与测试的肌肉类型有关，因为小鼠的趾长伸肌和大部分足底屈肌（跖肌和腓肠肌）富含快肌纤维，而既往研究表明，对烟草烟雾更敏感、易出现无力的是富含慢肌纤维的比目鱼肌。
讨论：AHR依赖与AHR非依赖的致病机制
本研究探讨了急慢性电子烟和烟草烟雾暴露对小鼠骨骼肌AHR通路激活、线粒体呼吸和收缩功能的影响。体外实验表明，烟草烟雾和电子烟气溶胶冷凝物均可激活培养肌细胞中的AHR信号通路。然而，体内实验表明，只有烟草烟雾暴露能在骨骼肌中激活AHR通路。这提示电子烟产品含有AHR配体，但其数量或效力在本研究采用的暴露条件下不足以在体内激活该通路。
先前研究已证实，AHR在肌肉中的激活会导致线粒体呼吸功能下降。本研究结果支持了这一观点，因为烟草烟雾暴露上调了AHR信号通路并降低了骨骼肌线粒体的state 3呼吸速率。然而，一个关键发现是，慢性电子烟暴露同样降低了state 3呼吸速率，却未影响AHR相关基因的表达。这表明电子烟引起的线粒体功能障碍可能涉及AHR非依赖的机制。这些潜在机制包括：氧化应激增加、溶剂化合物（如丙二醇或甘油降解产物）对线粒体的直接毒性，或尼古丁介导的线粒体病变。因此，即使缺乏燃烧相关的副产物，电子烟暴露仍能在没有明显AHR激活的情况下损害线粒体功能，这凸显了深入探究电子烟产品中具体哪些成分导致了骨骼肌呼吸功能受损的必要性。
虽然在本模型中骨骼肌收缩力量得以保留，但线粒体功能障碍往往是肌肉萎缩和明显功能损伤的前兆。这种生物能量学损伤可能会损害耐力或肌肉疲劳后的恢复能力，尤其是在老年人群或患有糖尿病、外周动脉疾病等合并症的个体中。此外，研究发现电子烟暴露导致的小鼠血清可替宁水平（反映尼古丁暴露量）几乎是烟草烟雾暴露的两倍，这引起了另一重担忧：高剂量尼古丁可能带来心血管或神经肌肉方面的额外影响。尼古丁本身已被证明会损害内皮功能、增加交感神经张力并改变线粒体生物能量学。
从公共卫生角度看，这些结果尤其令人担忧，因为电子烟在青少年和年轻人中的使用正在迅速增加。人们普遍认为电子烟是“更安全”的替代品，这可能促使其被更早地使用。然而，本研究中观察到的线粒体效应表明，长期暴露可能带来尚未被完全了解的风险，即使没有明显的AHR激活。
研究的局限性与未来方向
本研究也存在一些局限性。首先，样本量较小，可能导致在检测线粒体或骨骼肌功能变化方面统计效力不足。其次，研究仅使用了雄性小鼠，这可能限制了研究结果在雌性动物中的适用性和普遍性，因为先前研究报道AHR信号通路的生理后果存在性别差异。未来研究需要纳入两性动物以全面评估电子烟的潜在性别依赖性效应。第三，烟草烟雾和电子烟暴露组之间血清可替宁水平并不相同，电子烟组更高。这意味着即使暴露舱内的可见烟雾浓度是标准化的，但电子烟液本身较高的尼古丁含量可能是一个混杂因素。未来需要使用匹配的尼古丁剂量和标准化的暴露范式来阐明这些尼古丁摄取差异及其对骨骼肌健康影响的机制。第四，肌肉收缩功能主要在高频刺激下评估，这可能忽略了低频刺激下力量生成和融合速率的变化。最后，本研究未采用如RNA测序等无偏分子谱分析技术，这些技术可能揭示额外的机制通路。
结论与展望
总之，本研究发现在雄性小鼠中，电子烟暴露损害骨骼肌线粒体呼吸功能的程度与传统烟草烟雾相似。在培养的肌肉细胞中，电子烟气溶胶和烟草烟雾冷凝物都能激活AHR通路，但在体内，只有烟草烟雾暴露能激活雄性小鼠骨骼肌中的AHR通路。未来的工作需要量化电子烟产品中AHR配体的浓度并进行详细的化学分析，以阐明电子烟暴露损害线粒体功能的具体机制。这些发现对于理解电子烟的长期健康风险，特别是在肌肉代谢和功能方面，具有重要的科学和公共卫生意义。
