《Blood Cancer Discovery》：Composition and Functional State of T and NK Cells in the Extramedullary Myeloma Tumor Microenvironment
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本期，我们推荐一篇对髓外多发性骨髓瘤（EMM）——这一高侵袭性、预后极差的临床分型——肿瘤微环境（TME）的深度解析。该研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）、流式细胞术（FCM）及空间转录组学（ST）等多种前沿技术，首次系统对比了EMM与骨髓内多发性骨髓瘤（BM）的免疫微环境差异。研究发现，相较于BM，EMM病灶具有显著降低的效应细胞/肿瘤细胞（E:T）比值，并富含功能耗竭的肿瘤反应性CD8+T细胞和细胞毒性较弱的调节性CD16?NK细胞。研究揭示了潜在的免疫检查点（如PD-1、KLRC1）表达上调，为开发针对EMM的联合免疫治疗策略（如免疫检查点阻断剂）提供了重要的科学依据，指明了新的干预方向。
文章内容总结
Introduction
髓外疾病（EMD）是多发性骨髓瘤（MM）患者一个高危的临床特征，由侵袭性骨髓瘤克隆从骨髓（BM）中逸出并在身体其他部位形成新的病灶所导致。髓外多发性骨髓瘤（EMM）细胞对包括单克隆抗体（mAb）、双特异性抗体（bsAb）和嵌合抗原受体（CAR）T细胞在内的现代免疫疗法表现出更高的耐药性，并与更短的生存期相关。尽管之前的研究提示EMM的侵袭性可能与肿瘤内在因素（如增殖增强、突变负荷更高）和特定的基因背景有关，但关于EMM肿瘤微环境（TME）中免疫细胞的组成和功能状态，目前仍知之甚少。当前，多发性骨髓瘤的治疗策略越来越依赖免疫疗法来激活患者的免疫系统，特别是T细胞和NK效应细胞。因此，深入了解EMM TME的免疫学特征，对于开发更有效的治疗策略至关重要。
Patients’ Characteristics
本研究纳入了EMM和复发/难治性多发性骨髓瘤（RRMM）两组患者队列。EMM患者的样本年龄显著更年轻。在EMM患者中，复发时骨髓浆细胞（BMPC）水平显著降低，而乳酸脱氢酶（LDH）水平则显著升高。临床特征在用于单细胞RNA测序和流式细胞术分析的亚组中是均衡的。此外，研究还纳入了一个独立的EMM患者队列的空间转录组学数据用于验证。
Overall Composition of EMM Tumors and Multiple Myeloma BM Microenvironment
通过单细胞RNA测序分析，研究发现EMM肿瘤主要由恶性浆细胞（PC）、T细胞和NK细胞构成，三者占细胞总数的中位比例分别为91.9%、4.3%和1.5%，而髓系细胞浸润极少。相比之下，来自EMM患者的骨髓样本中恶性浆细胞浸润极少，主要由中性粒细胞、T细胞、单核/巨噬细胞、红系前体细胞和NK细胞组成。来自无EMM证据的RRMM患者的骨髓样本，其细胞组成与EMM_BM类似，但含有更高比例的恶性浆细胞。流式细胞术分析的结果与单细胞RNA测序高度一致，证实了EMM肿瘤主要由恶性浆细胞、T细胞和NK细胞组成。研究计算了效应细胞（NK和T细胞）与恶性浆细胞的比值（E:T比值），发现EMM的E:T比值显著低于骨髓样本。此外，单细胞RNA测序数据还显示，与RRMM_BM样本相比，EMM中的恶性浆细胞处于S–G2–M期的比例更高，与增殖相关的信号通路也更加富集。
scRNA-seq Identifies a Diverse Range of T-cell and NK-cell Subsets
研究进一步对T细胞和NK细胞进行了深入分析，鉴定出14个不同的亚群，包括12个T细胞亚群和2个NK细胞亚群。其中，NK细胞被分为细胞毒性较强的CD16+亚群和调节性/细胞毒性较弱的CD16?亚群。在EMM样本中，CD4+T细胞的浸润非常有限，主要由调节性T细胞、CD4效应细胞和CD4初始T细胞构成。
CD8+T Cells from EMM Tumors Are Often More Exhausted Compared with Their BM Counterparts
通过分析成对的EMM和EMM_BM样本，研究发现近一半的成对EMM样本显示出比其对应骨髓样本更高的T细胞耗竭评分。耗竭评分与细胞毒性评分呈强负相关。在细胞亚群水平，最具耗竭特征的CD8_exhausted-like TOX亚群几乎只出现在EMM样本中。而具有最高细胞毒性评分的CD8+T细胞亚群（如CD8_effector_CX3CR1和CD8_EM_GZMK）在EMM中的比例则显著更低。流式细胞术分析也证实，EMM样本中T细胞表达PD-1（由PDCD1基因编码）的比例显著更高。此外，随着从RRMM_BM、EMM_BM到EMM样本的推移，初始CD8+T细胞和初始CD4+T细胞的比例呈现渐进性下降。
T-cell Exhaustion in EMM Tumors Seems to Be Driven by Direct Cell–Cell Interactions
为了探索EMM样本中T细胞耗竭评分存在高变异性的潜在驱动因素，研究者进行了差异细胞-细胞相互作用分析。结果显示，在高耗竭组中，EMM细胞与T/NK细胞之间的HLA-B:CD8A相互作用更强，这主要是由于高耗竭组EMM细胞中HLA-B、HLA-A和HLA-C的表达显著上调。值得注意的是，CD8_exhausted-like TOX亚群表现出比其他T细胞亚群更强的肿瘤新抗原反应性T细胞基因表达特征。这些发现共同表明，EMM中T细胞的耗竭可能是由T细胞与肿瘤浆细胞之间的直接相互作用所驱动的。
Increased Presence of Regulatory CD16 Negative NK Cells in the EMM Tumor Microenvironment
研究显示，EMM样本中CD16?NK细胞的比例显著高于骨髓样本。流式细胞术也观察到了一致的趋势。有趣的是，几乎只存在于EMM的CD16?NK细胞中，处于S–G2–M细胞周期阶段的比例显著更高，表明其存在局部增殖。此外，EMM中的CD16?NK细胞显著高表达抑制性受体KLRC1（NKG2A），这可能进一步削弱其抗肿瘤活性。该受体在T细胞中也有表达，尤其在CD8_exhausted-like TOX亚群中水平最高。重要的是，研究在一个独立的验证队列中，通过空间转录组学证实了EMM样本中CD16?NK细胞的丰度更高。空间分析显示，CD16?NK细胞散布于整个病灶中，没有特定的聚集模式。
Dissecting BM Microenvironment Differences between Patients with Multiple Myeloma with and without EMM
研究者比较了EMM患者的骨髓与无EMM证据的RRMM患者的骨髓。单细胞RNA测序和流式细胞术均证实，EMM_BM中恶性浆细胞的比例极低。在免疫细胞方面，EMM_BM中高度细胞毒性的CD8_effector_CX3CR1 T细胞比例有更高趋势，而CD8_EM_GZMK效应记忆T细胞比例显著更低。同时，EMM_BM中B细胞、初始CD8+T细胞和初始CD4+T细胞的比例也更低。不过，这些差异需要谨慎解读，因为它们可能仅仅反映了EMM患者骨髓中肿瘤浆细胞浸润水平极低这一事实。
Discussion
本研究首次对EMM肿瘤的肿瘤微环境进行了全面的单细胞分析。核心发现表明，与骨髓微环境相比，EMM TME具有更低的效应细胞/肿瘤细胞比率，并富含功能耗竭、细胞毒性受限的CD8+T细胞以及细胞毒性较弱的调节性CD16?NK细胞。EMM对治疗的抵抗性可归因于其细胞的高增殖性、基因组不稳定性、治疗靶点（如CD38）和HLA基因的下调，以及肿瘤浸润CD8+T细胞的耗竭状态。较低的E:T比值可能与患者对单克隆抗体和双特异性抗体的较差反应有关。CD16?NK细胞比例升高与多发性骨髓瘤患者较差生存期相关，并可解释达雷妥尤单抗在EMM中的有限疗效。CD16?NK细胞和耗竭CD8+T细胞上免疫检查点（如PD-1、KLRC1）的表达上调，提示联合阻断这些通路（例如使用PD-1和NKG2A抑制剂）可能是激活EMM肿瘤中效应细胞的潜在策略。尽管存在样本量限制且缺乏功能性实验验证，但本研究增进了对EMM肿瘤微环境的理解，为未来开发更有效的治疗策略指明了方向。
Methods
样本于2018年至2024年间收集，包括继发性EMM肿瘤、EMM复发时的骨髓样本（EMM_BM）以及无EMM证据的RRMM骨髓样本。所有样本均在手术后（EMM）或骨髓穿刺后新鲜处理，进行单细胞RNA测序文库制备和/或流式细胞术分析。EMM肿瘤样本在采集后进行机械解离和过滤。骨髓和肿瘤细胞悬液均进行红细胞裂解。对于单细胞RNA测序，活细胞通过流式细胞分选仪分选。其中一个样本（EMM_09）额外用CD138-APC染色，以1:9的比例分选浆细胞和免疫细胞，实现免疫细胞的人工富集。所有分选后的细胞在液氮中速冻，后续使用10x Genomics平台进行单细胞RNA测序文库构建和测序。
