《Molecules》：Recent Advances in Titanium-Based Metal–Organic Frameworks: Structure, Property, and Application in Photocatalysis
Pengcheng Xing,
Boxuan Yang,
Lingshi Meng,
Tianqi Jia and
Shengjie Wang
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本文研究了茶（Camellia sinensis）籽黄酮（CSF）在体内外的光保护活性。研究证实，CSF可有效缓解UVB诱导的角质形成细胞氧化应激与炎症反应，其机制涉及清除活性氧（ROS）、抑制p38/JNK-MAPK与NF-κB信号通路，并下调下游炎症因子（PGE-2、TNF-α、IL-6、IL-8）及酶（iNOS、COX-2）的表达。同时，CSF可上调皮肤屏障相关蛋白（FLG、Claudin-1）的表达。在成纤维细胞中，CSF通过抑制AP-1/MMP-9轴保护真皮-表皮连接（DEJ）完整性，并通过抑制AP-1/MMP-1/3轴、恢复TGF-β/Smad3信号通路及上调透明质酸合酶2（HAS2）来促进胶原（I、III、IV、XVII）与透明质酸（HA）的合成，从而对抗UVA诱导的光老化。本研究为CSF作为多靶点天然光保护剂在皮肤健康领域的应用提供了科学依据。
1. 研究背景与目的
太阳能紫外线（UV）辐射是导致皮肤急慢性损伤的主要环境因素，其中UVB（280–315 nm）和UVA（315–400 nm）可诱导活性氧（ROS）生成，引发炎症、皮肤屏障功能受损和慢性光老化。传统防晒剂中的合成紫外线过滤剂存在潜在内分泌干扰和海洋毒性等担忧，推动了人们对化妆品和皮肤病学应用中天然、可持续替代品的需求。茶籽饼是茶树（Camellia sinensis）种子榨取茶油后的残渣，富含黄酮类化合物。本研究旨在探究茶籽黄酮（CSF）对紫外线诱导皮肤损伤的抗炎和抗光老化作用，为高级光损伤防护提供新的天然产物候选物和多靶点机制框架。
2. CSF成分分析
基于超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）分析，CSF提取物中主要富含黄酮类成分。其中，山奈酚的衍生物（如山奈酚-3,7-二葡萄糖苷、山奈苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、二氢山奈酚及山奈酚苷元）构成了其重要部分，这为后续研究提供了具有潜在抗炎和抗光老化特性的黄酮类物质基础。
3. CSF对UVB诱导的HaCaT角质形成细胞的多重保护作用
3.1. 缓解UVB诱导的氧化应激
在建立UVB诱导的炎症模型前，细胞毒性实验表明，CSF在0.25至10 μg/mL浓度范围内对HaCaT细胞无显著毒性，因此选择10 μg/mL用于后续实验。当HaCaT细胞暴露于30 mJ/cm2的UVB时，细胞活力下降至约50%，同时细胞内ROS水平急剧升高，表明HaCaT细胞光损伤模型成功建立。CSF处理显著减弱了这种UVB诱导的氧化应激，使ROS水平相较于模型组降低了20%。此外，UVB照射上调了Caspase-3 mRNA的表达，而CSF处理可有效抑制Caspase-3的表达，并将细胞活力提高20%，表明其通过抑制凋亡途径发挥保护作用。
3.2. 抑制UVB诱导的炎症反应
UVB照射显著提高了角质形成细胞内前列腺素E2（PGE-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-8（IL-8）的水平。CSF处理以浓度依赖性的方式显著减轻了这种炎症反应，使PGE-2、TNF-α、IL-6和IL-8的水平分别降低了52.6%、62.3%、55.1%和60.37%。机制研究表明，UVB暴露激活了MAPK信号通路的关键磷酸化蛋白p38和JNK，并促进了核转录因子NF-κB p65的表达。CSF干预后，p-p38、p-JNK和NF-κB p65的蛋白表达水平显著下调，导致其下游基因诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧化酶-2（COX-2）的mRNA表达也被抑制，最终表现为多种促炎因子水平的降低。这清楚地表明CSF通过抑制p38/JNK磷酸化，阻断NF-κB信号通路的激活，从而下调iNOS和COX-2的表达，减少包括ROS、PGE-2、TNF-α、IL-6和IL-8在内的炎症介质的产生，实现其抗炎作用。
3.3. 增强皮肤屏障保护相关mRNA的表达
皮肤屏障功能依赖于丝聚蛋白（FLG）和紧密连接核心组分claudin-1等关键蛋白。UVB照射显著下调了FLG和claudin-1的mRNA表达，表明屏障完整性受损。CSF处理有效逆转了这种损伤，恢复了这些蛋白的表达水平，从而证明了其在修复UVB损伤的皮肤屏障中的保护作用。
4. CSF对UVA诱导的皮肤光损伤的保护作用
4.1. 保护UVA照射的真皮-表皮连接（DEJ）
在人类真皮成纤维细胞（HDF）中，CSF在0.25–25 μg/mL浓度范围内无显著细胞毒性。选择8 J/cm2的UVA剂量建立光老化模型。IV型胶原是基底膜致密层的主要结构成分，XVII型胶原是连接角质形成细胞与基底膜的跨膜半桥粒蛋白，两者共同确保真皮-表皮连接的完整性。基质金属蛋白酶-9（MMP-9）是降解这些胶原的关键酶。ELISA结果显示，UVA照射显著降低了模型组中IV型和XVII型胶原的含量，同时qPCR分析显示MMP-9的mRNA表达显著上调。CSF干预有效下调了MMP-9的表达，从而显著减弱了IV型和XVII型胶原的降解，表明CSF通过抑制降解其必需胶原框架的酶的表达，为UVA应激下维持DEJ完整性提供了关键保护。
4.2. 减轻UVA诱导的真皮成纤维细胞结缔组织结构损伤
UVA照射显著降低了模型组中I型和III型胶原的含量，表明真皮结缔组织结构严重受损。在分子水平上，qPCR分析显示UVA照射显著上调了基质金属蛋白酶-1（MMP-1）和基质金属蛋白酶-3（MMP-3）的mRNA表达。MMP-1是降解包括I型和III型在内的纤维状胶原的主要酶，MMP-3（基质裂解素-1）则可以激活前MMP-1，从而放大胶原分解级联反应。CSF处理有效逆转了这些UVA诱导的改变，显著下调了MMP-1和MMP-3的mRNA水平，并与I型和III型胶原蛋白水平的恢复相关。
4.3. CSF保护HDF细胞及减轻UVA光老化损伤的通路机制
透明质酸合酶2（HAS2）催化皮肤细胞外基质中主要糖胺聚糖透明质酸（HA）的生物合成。在CSF处理组中，HAS2显著上调，导致HA合成增加。Western blot分析进一步阐明了所涉及的分子通路。UVA照射激活了AP-1通路，而CSF处理显著抑制了这种激活。同时，UVA暴露下调了转化生长因子-β（TGF-β）表达及其下游效应因子p-Smad3，而上调了抑制性Smad7，这些变化共同表明胶原合成信号受到抑制。CSF处理有效地逆转了这些改变，恢复了TGF-β水平，增加了p-Smad3，并减少了Smad7的表达。这些结果表明，CSF通过抑制AP-1介导的破坏性通路，同时挽救TGF-β/Smad胶原合成轴，减轻了UVA诱导的结缔组织结构损伤。
5. 讨论
植物来源的生物活性化合物由于其固有的化学复杂性而具有独特的治疗优势。本研究观察到的保护作用与已知的黄酮类生物活性一致。紫外线辐射由于其光谱特性对皮肤各层产生不同的影响：UVB主要靶向表皮，诱导直接DNA损伤和炎症，而UVA则穿透至真皮，促进氧化应激和慢性光老化。作为紫外线诱导光老化中的核心介质，ROS通过直接氧化攻击和间接信号破坏双重机制造成皮肤损伤。在分子水平上，ROS诱导脂质过氧化、损害蛋白质完整性并导致氧化性DNA损伤和突变。在细胞层面，ROS通过激活MAPK和NF-κB等通路来延续炎症，同时抑制TGF-β信号轴。这种不平衡通过上调基质金属蛋白酶（MMPs）和下调胶原合成来促进细胞外基质降解。这些事件共同驱动慢性炎症、损害屏障功能并诱导细胞凋亡和衰老，最终表现为光老化的临床特征，包括皱纹形成、弹性丧失和皮肤干燥。CSF还在抗炎作用之外保护皮肤屏障完整性。皮肤屏障依赖于丝聚蛋白（FLG）等结构蛋白的物理强度和claudin-1等紧密连接蛋白的选择性渗透性。CSF显著逆转了UVB诱导的FLG和claudin-1下调，表明其在恢复物理和功能屏障方面的作用。DEJ的结构完整性对于表皮粘附和信号传导至关重要，严重依赖于基底膜内的IV型胶原和半桥粒中的跨膜锚定蛋白XVII型胶原（BP180）。UVA辐射部分通过上调MMP-9来破坏此连接处。CSF治疗通过抑制UVA激活的转录因子AP-1（MMP-9基因表达的关键上游调节因子）来减轻这种损伤。皮肤的主要机械性能由真皮基质决定，其主要成分是纤维状胶原（I型和III型）和糖胺聚糖HA。UVA照射触发了双重失调：同时增强ECM降解并损害其合成。分解代谢反应是通过AP-1依赖性上调MMPs介导的，特别是MMP-1（启动胶原纤维切割）和MMP-3（通过激活前MMP-1和降解其他ECM成分来放大损伤）。同时，UVA抑制主要的合成代谢TGF-β/Smad通路。它通过诱导抑制性Smad7的表达来实现这一点，Smad7干扰Smad3信号转导，导致前胶原合成减少。结果表明，CSF通过双重机制抵消这种失衡。首先，它抑制AP-1/MMP轴，减少I型和III型胶原的降解，显示出与25 μg/mL EGCG相似的效力。其次，它可能通过下调Smad7来恢复合成代谢的TGF-β/Smad3信号，从而促进胶原蛋白的产生。此外，CSF通过上调透明质酸合酶2（HAS2）的表达来增强真皮HA含量。这些对胶原转换和HA合成的共同作用有助于保持真皮基质的结构体积和组成。
6. 材料与方法
6.1. 黄酮类化合物的提取与纯化
茶籽饼粉末用60%乙醇超声提取，经石油醚脱脂后，用乙酸乙酯萃取富集黄酮。粗提物经D101大孔吸附树脂纯化，用水洗脱杂质，70%乙醇解吸目标黄酮，经浓缩冻干得到纯化的CSF。经硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定，CSF中黄酮纯度为72%。
6.2. 细胞培养与处理
人永生化角质形成细胞（HaCaT）和人真皮成纤维细胞（HDF）分别在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。
6.3. 细胞活力与氧化应激检测
使用CCK-8法检测细胞活力。使用荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS水平，并通过荧光显微镜观察和酶标仪定量。
6.4. 炎症因子与细胞外基质成分检测
使用商品化ELISA试剂盒检测细胞上清液中PGE-2、TNF-α、IL-6、IL-8、胶原（I、III、IV、XVII）及透明质酸（HA）的含量。
6.5. 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析
提取细胞总RNA，反转录为cDNA后，进行RT-qPCR，检测Caspase-3、iNOS、COX-2、FLG、Claudin-1、MMP-1、MMP-3、MMP-9、HAS2等基因的mRNA表达水平。
6.6. 蛋白质印迹（Western Blot）分析
提取细胞总蛋白，通过SDS-PAGE分离并转印至PVDF膜，用特异性一抗（p-p38、p-JNK、NF-κB、AP-1、TGF-β、Smad3、Smad7等）和二抗孵育，化学发光法显影并分析条带灰度值。
6.7. 统计分析
数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）及Tukey's HSD检验，p < 0.05被认为具有统计学意义。
7. 结论
本研究证明，茶（Camellia sinensis）籽黄酮（CSF）通过协同的多靶点途径保护皮肤细胞免受UVB和UVA诱导的损伤。在角质形成细胞中，CSF通过清除ROS、抑制MAPK/NF-κB通路、抑制凋亡途径和增强皮肤屏障相关蛋白，缓解UVB引发的氧化应激和炎症。在成纤维细胞中，CSF通过抑制AP-1/MMP驱动的基质降解和恢复TGF-β/Smad依赖的ECM合成来抵消UVA介导的光老化。总之，这些发现表明CSF作为缓解UVB诱导的炎症和UVA诱导的光损伤的潜在候选物值得进一步研究。但需注意，当前发现基于体外细胞模型，需要使用三维皮肤模型或体内人体研究进一步验证其功效和转化潜力。
