《Molecules》：Late-Stage Functionalization of the Rifamycin Core via Click Chemistry Toward New Antibacterial Derivatives
Lola Beeser,
Daniel Armstrong,
Marissa S. Fullerton,
Isabella Beasley,
Wyatt Treadway,
Clara Nikkel,
Mai Lan Ho,
Braden Glenn,
Catherine Mills and
Irosha N. Nawarathne
+ 9 authors
编辑推荐：
本期推荐：本文首创性地将点击化学与利福霉素核心化学相结合，开发了一种针对利福霉素S的C8位点进行后期功能化的模块化合成平台。该方法高效合成了C8-叠氮、C8-炔基及C8-三唑等系列新型衍生物，并建立了首个用于此类复杂天然产物衍生物的HPLC纯化方案。所获类似物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和变异链球菌(S. mutans)展现出有前景的抗菌活性，为应对多重耐药(MDR)细菌感染，尤其是结核病(TB)和耐药革兰氏阳性菌感染，提供了结构多样化的新型先导化合物，并为进一步探索生物正交应用奠定了基础。
1. 引言
抗菌药物耐药性(AMR)已成为全球性的健康危机，其与2019年490万例死亡相关。据世界卫生组织(WHO)估计，若不采取紧急措施，到2035年AMR可能导致全球预期寿命降低1.8年。结核病(TB)是第二大单一传染源致死病因，2022年造成约150万人死亡。其中，多重耐药结核病(MDR-TB)和利福平耐药结核病(RR-TB)是日益严峻的公共健康威胁，2022年约有41万人患病。此外，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)等耐药革兰氏阳性菌感染也对临床治疗构成巨大挑战。
利福霉素类药物，特别是利福平，是结核病治疗方案的关键组成部分。它们通过结合细菌RNA聚合酶(RNAP)的β亚基，抑制RNA合成，从而发挥杀菌作用。然而，随着临床的广泛应用，针对利福霉素的耐药性日益严重，其效力受到削弱。耐药性的产生主要与结核分枝杆菌(MTB)RNAP的利福平耐药决定区(RRDR)发生突变有关，这些突变破坏了药物与靶点的关键相互作用。在利福霉素的结构-活性关系(SAR)研究中，C8位的羟基(-OH)对药物与靶点的结合至关重要。然而，有研究表明，用硫甲基(-SCH3)等特定基团对C8位进行策略性修饰，可以保留甚至增强对携带临床主要S450L突变（约占41%的RR-TB分离株）的利福平耐药菌株的活性。此外，在C3和C4位之间连接了额外环的3′-羟基-5′-氨基苯并恶嗪诺利福霉素(bxRifs，如利福拉齐及其衍生物)也被报道对药物敏感和耐药的TB均表现出卓越活性，并能通过减少人孕烷X受体(hPXR)介导的肝细胞色素P450(Cyp450)诱导来降低利福平的肝毒性临床风险。同样，代表性利福霉素（如利福平、利福布汀、利福喷丁）的C25-脱乙酰代谢物(25-deacetylated rifamycins, deAcRifs)也能降低人肝脏中药代谢酶的诱导，从而缓解利福霉素诱导的肝毒性。因此，开发新型C8修饰的利福霉素衍生物，并将其进一步转化为bxRifs和deAcRifs，是克服现有耐药性和优化药代动力学性质的有效策略。
然而，传统的C8位修饰方法步骤繁琐、非正交且产率有限，限制了结构多样性的探索。同时，利福霉素类化合物因其亲脂性、易降解性及杂质谱重叠而难以纯化，现有高效液相色谱(HPLC)方法主要针对复杂基质中利福平的定量分析，缺乏用于结构多样类似物半制备分离的成熟方案。
本文的核心工作是利用利福霉素核心化学的多样性，特别是通过铜(I)催化的叠氮-炔环加成反应(CuAAC，即点击化学)，建立一个模块化的合成平台，实现利福霉素S在C8位的后期功能化，快速合成一系列新型衍生物，并开发系统的HPLC纯化方法。该策略旨在为系统性探索SAR、合成bxRifs和deAcRifs前体以及未来基于生物正交化学的广泛应用奠定基础。
2. 结果与讨论
化学合成：基于前期文献，利福霉素S C8位酚羟基的活化使其能够被修饰。本研究选择了磺酰基、氨基、炔基、叠氮基和三唑等官能团，以探究C8位的化学反应性，引入用于点击化学多样化的模块化手柄，并评估在更广泛的C8化学空间平台内探索SAR的潜力。
具体而言，利福霉素S(1)与对甲苯磺酰氯和(4-氟苯)磺酰氯反应，分别得到化合物8和2，产率86-89%。其中，携带吸电子更强的氟化磺酰基的化合物2在功能化筛选中表现出更高的反应活性，这促进了新型8-氨基利福霉素S类似物3和7的合成，它们分别引入了叠氮基和炔丙基取代基。随后，通过Cu(I)催化的点击反应，将叠氮基取代的8-氨基利福霉素S化合物(3)与不同的末端炔烃（1-戊炔、1-环戊基乙炔、1-苯乙炔）反应，生成了在C8位带有不同取代三唑环的类似物4-6，经HPLC纯化后估计产率为37-71%。然而，多次尝试将炔基取代的类似物7与叠氮化物反应合成相应的三唑均未成功，这可能与复杂利福霉素结构中炔基的位阻有关。
HPLC纯化方法的开发：由于传统的快速柱层析法无法得到纯品，且观察到显著的降解，本研究转向反相半制备HPLC纯化。尽管文献中缺乏成熟方法，但通过系统优化，成功开发了三种高效的HPLC方法（方法1-3），使用配备二极管阵列检测器(DAD)的U3000 Prep HPLC系统和反相半制备柱。
3)的方法1-3的HPLC色谱图及TLC分析。">
通过调整溶剂梯度（如用四氢呋喃(THF)替代乙腈），最终优化的方法3将总运行时间缩短至11分钟，并能有效分离出多个高纯度产物馏分。所有用于生物学评估的化合物经分析型HPLC-DAD确认纯度均≥95%，且未检测到利福霉素S或相关利福霉素杂质。纯化后的化合物均通过核磁共振波谱(NMR)、高分辨电喷雾电离质谱(HRESIMS)和傅里叶变换红外光谱(FTIR)进行了表征。
生物学评估：本研究使用模型生物MRSA（USA300, LAC菌株）、变异链球菌(S. mutans)和大肠杆菌(E. coli) K-12，以及大肠杆菌RNAP体外测定，来评估新类似物对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和MTB病原体的活性。
大多数修饰的利福霉素（10 μM）在接种后3或6小时能显著抑制MRSA的生长，尤其是化合物4和9，与原始骨架利福霉素S相比表现出改善的MRSA生长抑制效果。通过测定最低抑菌浓度(MIC)，获得了对化合物效力的关键见解。利福霉素S的MIC值最低，而一些在筛选试验中活性较高的修饰利福霉素则显示出较高的MIC值，这可能区分它们是杀菌剂还是抑菌剂。在SAR分析中，带有8-磺酰基和8-氨基的衍生物对MRSA表现出高效力，而炔基、叠氮基和三唑类似物(3-7)活性较低。在三唑类中，线性烷基取代的化合物(4)优于体积更大的环状和芳基类似物(5和6)，表明结合位点存在空间敏感性。
修饰的利福霉素对变异链球菌(S. mutans)表现出适度但一致的活性，其中氨基衍生物(9)的活性与原始利福霉素核心(1)相当，而C8-对甲苯磺酸酯类似物(8)的效力与代表性bxRif利福平(10)相似。这一结果为开发旨在改善口腔健康的新型利福霉素类似物带来了鼓舞人心的结果。
当使用大肠杆菌K-12评估修饰利福霉素对革兰氏阴性菌的影响时，未观察到显著的抑制作用。对每种修饰利福霉素测定的大肠杆菌MIC值显示，其效力相对于原始骨架利福霉素S降低了10至20倍。这很可能归因于革兰氏阴性菌中药外排泵（如AcrAB-TolC）的作用，它能主动排出利福霉素等大分子抗生素，从而降低其有效性。目前正在研究已知小分子外排泵抑制剂(EPIs)与修饰利福霉素的协同效应，以增强其对革兰氏阴性菌感染的功效。
对野生型(WT) MTB RNAP和利福平耐药MTB RNAP (S450L)的抑制活性筛选显示，由于母体分子利福霉素S 8-OH位的修饰，活性降低了3至100倍。这与之前的生化和晶体学研究一致，突出了C-8羟基在利福霉素与大肠杆菌和MTB RNAP结合中的关键作用。目前正在开发一系列C-8修饰利福霉素的bxRifs，旨在与RNAP复合物的σ区域3.2及其他区域产生额外相互作用，以增强对MTB的RNAP抑制活性，同时阻断hPXR结合以改善药代动力学。同时，也在通过商品化的重组人芳基乙酰胺脱乙酰酶(AADAC)介导的脱乙酰化反应，选择性地生成一组8-修饰的deAcRifs作为概念验证。
选择性分析：通过对数转换的MIC比值（大肠杆菌/MRSA 和 变异链球菌/MRSA）热图分析，突出了每种类似物的选择性特征。较高的比值表示对MRSA相对于比较菌株具有更强的选择性。利福霉素S(1)在两种比较中都显示出对MRSA的最高选择性。值得注意的是，化合物5、6和9对变异链球菌(S. mutans)的效力高于MRSA，其中化合物9对变异链球菌的活性甚至超过了利福平(10)，这表明它们有潜力作为口腔生态位特异性的抗菌剂。类似物对大肠杆菌的一致较低选择性支持了它们作为机制探针的用途，以区分利福霉素的转运与RNAP靶点结合。总体而言，许多新类似物对临床上重要的耐药病原体MRSA表现出增强的选择性和效力，同时不影响共生菌，突显了其潜在的治疗相关性。
3. 实验部分
本节详细描述了所有新化合物的合成步骤、反应条件、纯化收率及结构表征数据（包括NMR、HRESIMS、FTIR谱图归属）。同时，详尽阐述了用于修饰利福霉素纯化的反相半制备HPLC方法的开发与优化过程，包括仪器、色谱柱、流动相梯度、检测波长等具体参数。此外，还系统介绍了针对MRSA、变异链球菌(S. mutans)和大肠杆菌(E. coli)的抗菌活性筛选方法、MIC测定方法（基于改性Gompertz函数），以及用于评估化合物对野生型和耐药突变型大肠杆菌RNAP抑制活性的体外滚环转录实验方案。
4. 结论
总之，本研究首次将定制的利福霉素化学与点击化学相结合，建立了一个模块化平台，用于生成一系列具有C8-叠氮、C8-炔基和C8-三唑取代基的利福霉素S类似物。该平台支持系统的SAR研究，并为下游的生物共轭（用于探针、成像剂和纳米颗粒-抗生素杂合物）奠定了基础。同时，本文首次报道了利福霉素衍生物的制备级HPLC纯化方案，这是天然产物类似物分离领域的关键进展。新获得的类似物显示出有前景的抗MRSA活性和对变异链球菌(S. mutans)的选择性作用，表明其在针对系统和口腔微生物群方面具有应用潜力。相比之下，对大肠杆菌活性的降低可能反映了外排泵介导的耐药性，而对RNAP结合力的减弱则与C8羟基的缺失相符。目前正在进行的努力包括合成点击化学启发的、C8修饰的bxRifs和deAcRifs，旨在提供具有改善选择性的RNAP抑制剂，并探索它们在基于机制的探针开发和革兰氏阴性菌增敏策略中的效用。本研究为开发具有广泛应用前景的下一代模块化利福霉素疗法铺平了道路。
