基于HaloTag的方法用于量化TRPV3通道在亚细胞内的定位

《Biophysical Journal》：HaloTag-based approach to quantify subcellular localization of TRPV3 channels.

　　

Alexander Holloway | Joshua Chiang | Afroza Khan | Eric N. Senning | Andrés Jara-Oseguera

德克萨斯大学奥斯汀分校自然科学学院分子生物科学系，美国德克萨斯州78712

摘要

TRPV3通道对皮肤屏障的形成和头发生长至关重要，其功能失调与瘙痒、特应性皮炎、酒渣鼻以及Olmsted综合征等遗传性疾病有关。热量和电压可以直接激活TRPV3通道，使其通过孔道传导阳离子。此外，TRPV3与跨膜蛋白TMEM79之间的相互作用会影响通道的运输方式，而非孔道的开闭机制。然而，关于TRPV3通道如何被内源性调控，目前知之甚少。重要的是，我们缺乏能够在多种实验条件下（包括活细胞实验中）可靠量化TRPV3通道细胞表面表达水平的实验工具。为填补这一知识空白，我们将cpHaloTag融合到了小鼠TRPV3通道的细胞外表面，同时保留了其对电压、热量和激活剂的敏感性。我们发现，可以通过使用光谱可分离的膜通透性和非通透性HaloTag染料进行顺序标记，来区分HEK293细胞中表面表达和细胞内定位的TRPV3通道。利用这一工具和共聚焦显微镜技术，我们观察到由于TRPV3通道N端部分被截短或与TMEM79共表达，活细胞和固定细胞表面的TRPV3通道定位发生了显著变化。值得注意的是，这些亚细胞定位的变化可以通过低倍率的荧光显微镜和流式细胞术进行准确量化，使得我们的工具非常适合高通量筛选应用。此外，我们还将Halo-TRPV3通道与荧光Ca²⁺报告基因、质膜荧光标记物或溶酶体荧光标记物共表达，证明该系统可用于评估通道活性或细胞器的定位。因此，这项工作证明了这种新型工具在阐明TRPV3通道功能的分子和细胞机制方面的实用性和灵敏度。