《International Immunopharmacology》：Artesunate ameliorates
Staphylococcus aureus-induced mandibular osteomyelitis and promotes osteogenic differentiation via NOD2/p65 signaling pathway
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青蒿琥酯通过抑制NOD2/p65通路减轻金黄色葡萄球菌诱导的炎症并促进骨髓间充质干细胞成骨分化，联合抗生素效果更佳，动物实验证实其可改善慢性颌骨化脓性骨髓炎。
作者：董恩康、董晓菲、任一凡、龚凌雪、赵翠翠、聂荣荣、孟向峰
单位：南京大学医学院附属南京口腔医院修复科
摘要
目的
本研究旨在探讨青蒿琥酯（AS）在金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）诱导的炎症条件下对炎症和成骨分化的作用及其机制。
方法
采用碱性磷酸酶染色、Western Blotting、定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）和免疫荧光染色等方法，评估AS对金黄色葡萄球菌诱导的炎症状态下大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）炎症和成骨分化的影响。建立慢性化脓性下颌骨髓炎的大鼠模型，并在AS和/或头孢呋辛 axetil治疗后的组织学和微计算机断层扫描（CT）中进行评估。同时利用RNA测序和NOD2激动剂鼠胺酰二肽（MDP）来探讨相关机制。
结果
体外实验中，AS降低了rBMSCs中促炎因子的表达，并增加了抗炎和成骨因子的表达。体内实验表明，AS促进了大鼠的抗炎反应和新骨形成，与头孢呋辛 axetil联合使用时效果更显著。此外，AS降低了NOD2和p-p65的表达，而MDP则逆转了AS的抗炎和促骨效应。
结论
AS通过抑制NOD2/p65通路，减轻了rBMSCs的炎症并促进了其成骨分化。在体内实验中，AS有助于大鼠慢性化脓性下颌骨髓炎的愈合。
引言
骨缺损通常指由于多种原因导致的骨组织缺失。全球每年约有220万患者因骨缺损接受骨移植手术[1]。其中，感染是骨缺损的重要诱因之一，在骨髓炎中尤为常见[2]。骨髓炎是指发生在骨髓、松质骨、皮质骨和骨膜中的化脓性炎症，其年发病率约为每10万人21.8例[3]。尽管上颌骨血供丰富且皮质骨较薄，但下颌骨的骨髓炎更为常见[4]。虽然金黄色葡萄球菌（S. aureus）是下颌骨髓炎最常见的病原体，但由于口腔环境的复杂性，下颌骨髓炎常表现为链球菌（Streptococcus）和放线菌（Actinomyces）的混合感染[5]。当骨髓炎发展为慢性阶段并形成死骨时，其表面常形成细菌生物膜[6]。因此，下颌骨髓炎往往难以治愈。目前，治疗慢性化脓性下颌骨髓炎的主要方法是手术清创去除感染和死骨，并配合长期高剂量抗生素使用。在第二代头孢菌素中，头孢呋辛 axetil因其对革兰氏阳性和阴性细菌的广谱抗菌作用而被广泛推荐作为首选口服药物[7, 8]；研究还表明，其与万古霉素、妥布霉素和环丙沙星相比，对S. aureus生物膜的抑制效果更佳[9]。然而，这种标准治疗方法的治愈率仅约为40%[10]。此外，抗生素的过度使用会导致胃肠道反应、肝肾损伤、继发感染和抗生素耐药性等严重副作用。因此，寻找抗生素的有效替代方案迫在眉睫。
一些研究发现，抗菌肽具有抗菌、抗炎和促血管生成作用，从而有助于骨髓炎的愈合[11]。但由于肽类药物半衰期较短，容易被体内的蛋白酶降解[12]。Ren等人将抗生素与双膦酸盐结合使用，以改善抗生素的分布[10]；Zhou等人开发了针对特定病原体的抗菌载体，将识别S. aureus的抗体与抗生素结合，从而根除感染灶[13]。然而，这些针对特定病原体的药物在临床应用中存在困难。另有研究使用新型复合水凝胶支架填充骨髓炎区域，有效加速了愈合和骨再生[14]，但由于水凝胶仅具有局部治疗效果，对全身性感染的影响有限。目前，骨髓炎的治疗重点在于早期干预，以防止疾病进一步发展，并尽可能避免后续的骨移植。因此，具有抗炎和促骨生成作用的传统中药研究受到越来越多的关注。部分研究表明，姜黄素与抗生素联合使用可有效改善大鼠的骨髓炎，但其临床应用受到口服生物利用度和水溶性低的限制[15, 16]。鉴于上述治疗的种种局限性和困难，亟需新的治疗手段。
青蒿素（ART）是从青蒿（Artemisia annua）中提取的药物，是治疗疟疾的一线药物[17]。其独特的过氧化物桥结构（-O-O-）能分解产生活性氧（ROS），这是其生物活性的关键[18]。我们之前的研究发现，ART在脂多糖（LPS）模拟的炎症环境中能够促进人类牙髓干细胞的增殖、抑制凋亡和抗炎[19]。近年来，通过在青蒿素中添加半琥酸盐，合成了青蒿琥酯（AS），显著提高了其生物利用度和水溶性[20, 21]。目前，AS已证实能减轻LPS引起的系统性炎症和糖尿病小鼠的牙槽骨丢失[22, 23]，但其是否对骨髓炎有效仍不明确。
大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）源自骨髓腔，具有多向分化能力。但在炎症环境中，rBMSCs的分化方向会偏向抑制成骨分化并促进脂肪分化[24]；同时，炎症因子释放会激活破骨细胞，导致骨缺损[25]。因此，调节rBMSCs的功能并促进其成骨分化对于治疗下颌骨髓炎具有重要意义[26]。越来越多的研究表明，AS对结肠炎、败血症和骨质疏松等疾病具有良好疗效，具有广阔的临床应用前景[27, 28]。例如，AS通过抑制核因子κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路以及减少促炎因子释放来发挥抗炎作用[29]；此外，AS还能通过调节RANKL/RANK/OPG信号通路抑制破骨细胞形成并减少骨吸收[30]。综上，我们推测AS可能改善炎症并促进感染性骨缺损的骨重建。
因此，本研究旨在探讨AS在金黄色葡萄球菌诱导的炎症状态下对rBMSCs炎症和成骨分化的影响，并探索其潜在机制。同时，通过建立下颌慢性化脓性骨髓炎的大鼠模型，进一步验证AS在体内的作用。
细胞分离、培养与鉴定
整个研究方案已获得南京口腔医院伦理委员会的批准（JX-2024-NL34）。选择三周大的雄性Sprague-Dawley大鼠，通过颈椎脱位处死后浸泡于75%乙醇中10分钟，分离胫骨和股骨，刮除附着的肌肉，用含有2%青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液（PBS，Gibco，NY，USA）反复冲洗三次。
rBMSCs的分离与鉴定
初次培养5天的rBMSCs呈现簇状生长，具有长梭形形态，符合贴壁干细胞的特征。流式细胞术显示，这些细胞表达间充质干细胞表面标志物CD29（99.3%）和CD90（98.4%），但不表达造血干细胞标志物CD34（0.23%）和CD45（0.14%）（图1B）。此外，分离出的rBMSCs具有高水平的ALP活性和矿化能力。
讨论
感染性骨缺损是指伴有感染或在治疗过程中发生的骨丢失，是骨科领域面临的全球性挑战。目前，感染性骨缺损的治疗主要采用手术结合抗生素。本研究发现，AS通过NOD2/p65信号通路降低了rBMSCs的炎症反应，并促进了其成骨分化。
科学写作中关于生成式AI的声明
作者声明本研究中未使用任何生成式AI技术。
作者贡献声明
董恩康：撰写初稿、数据可视化、方法设计、实验设计、数据分析。
董晓菲：审稿与编辑、方法设计、实验设计、数据分析。
任一凡：数据可视化、数据管理。
龚凌雪：项目监督、概念构思。
赵翠翠：数据管理。
聂荣荣：撰写与编辑、项目监督、资源协调、概念构思。
孟向峰：撰写与编辑、项目监督。
资助信息
本研究得到了南京大学医学院“2015年学术领军人才培养计划”[资助编号：0223A105]和南京口腔医院博士后研究启动基金[资助编号：2023101858]的支持。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。
