电不对称流场流分离技术结合多种在线检测器分析生物-纳米相互作用

《Journal of Chromatography A》：Analysis of bio-nano interactions by Electrical Asymmetric Flow Field-Flow Fractionation with multiple online detectors

　　

理解生物-纳米相互作用（bio-nano interactions）和蛋白冠（protein corona）形成对于推动纳米药物向临床转化至关重要。然而，由于本体生物介质中未结合蛋白质的干扰，传统的纳米颗粒分析方法在原位分析（in situ analysis）方面效用有限。电不对称流场流分离技术（Electrical Asymmetric Flow Field-Flow Fractionation, EAF4），它将AF4与施加的电场相结合，实现了基于尺寸和表面电荷的分离，当与在线检测器（online detectors）耦合时，可同时测量颗粒尺寸、电泳迁移率（electrophoretic mobility）和Zeta电位（zeta potential），这些是调控生物-纳米相互作用的关键参数。在此，研究人员报告了多重EAF4（multiplexed EAF4）与在线检测的首次应用，用于评估在模拟细胞培养基蛋白质组成的条件下暴露于血清后，聚苯乙烯乳胶和丝素纳米颗粒（作为模型纳米药物系统）发生的生物物理变化。研究结果揭示，暴露于含蛋白质介质后，颗粒物理属性发生了显著改变，包括颗粒尺寸、形状因子（shape factor）、Zeta电位和电泳迁移率。此外，研究人员证明EAF4能够温和地分离复杂生物样本，对纳米颗粒-蛋白质复合物中不同的颗粒和大分子种类提供全面的物理化学分析。这项工作确立了EAF4作为一个强大的分析平台，用于解析纳米-生物相互作用并指导下一代纳米药物的合理设计。

研究背景：纳米药物从实验室向临床转化面临重大挑战，核心障碍在于纳米载体与生物系统界面间的复杂相互作用（生物-纳米相互作用），尤其是蛋白冠（protein corona）的形成。蛋白冠会改变纳米载体的生物学特性和安全性，理解这些相互作用对纳米药物的设计和表征至关重要。传统方法如动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）、颗粒跟踪分析（Particle Tracking Analysis, PTA）、电子显微镜和X射线光电子能谱等在复杂生物介质中对蛋白冠的原位分析存在严重局限，主要由于基质干扰、分离分辨率不足以及离心洗涤等样本处理过程会破坏蛋白冠结构。因此，亟需一种能够温和、无伪影地从本体生物介质中分离纳米材料，同时保持纳米载体特性和蛋白冠结构的创新分析技术。

研究内容与结论：研究人员首次应用电不对称流场流分离技术（Electrical Asymmetric Flow Field-Flow Fractionation, EAF4）耦合多个在线检测器（紫外检测器UV、多角度光散射MALS、动态光散射DLS），对聚苯乙烯乳胶纳米颗粒和丝素纳米颗粒这两种模型纳米药物系统进行原位分析。通过比较暴露于含血清培养基（10% v/v FBS）前后的物理化学参数变化，研究人员发现蛋白吸附显著改变了所有纳米材料的尺寸、尺寸分布、形状因子、Zeta电位和电泳迁移率，变化程度取决于纳米颗粒组成、生物分子环境、温度和孵育时间。研究表明，EAF4能够依据尺寸和电荷有效分离纳米载体与生物介质，同时实现原位表征，且相较于离心洗涤等传统方法，它能更温和地处理样本，减少聚集风险并提供高分辨率的多维分析。该论文发表在《Journal of Chromatography A》。

关键方法：研究人员主要采用了以下关键技术：1）电不对称流场流分离技术（EAF4），在不对称流场流分离（AF4）基础上施加电场，实现基于水动力学尺寸和表面电荷的分离；2）在线检测器联用系统，包括紫外检测器（UV-vis, 280 nm）、多角度光散射检测器（MALS, 28°-164°）和动态光散射检测器（DLS），用于同步测量颗粒尺寸、回转半径（radius of gyration, R_g）、水动力学半径（hydrodynamic radius, R_h）、形状因子（shape factor, SF）以及Zeta电位；3）颗粒跟踪分析（PTA）和动态光散射（DLS）作为参照技术，用于对比分析；4）场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）用于形态学验证。样本为羧基修饰和未修饰的聚苯乙烯乳胶纳米颗粒（100 nm）以及丝素纳米颗粒（89 nm），均在含10%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）中于37°C孵育24小时。

研究结果：

**Analysis of nanoparticle protein corona effects on particle size by centrifugation-resuspension and in situ analysis**
通过PTA（散射模式）和批式DLS分别对原位和离心洗涤分离后的样本进行测量。结果表明，所有纳米颗粒在含蛋白介质中孵育24小时后，平均粒径均增大，粒径分布变宽（PDI和跨度值增加），颗粒浓度降低。其中，羧基修饰聚苯乙烯纳米颗粒的浓度减少程度低于未修饰颗粒，归因于其更好的胶体稳定性；丝素纳米颗粒在两种分析方式间粒径变化不显著，可能与其抗污特性有关。FE-SEM图像显示孵育后颗粒出现严重聚集，形态从球形变为不规则，验证了粒径变化结果。这些发现表明蛋白冠形成会改变纳米颗粒物理稳定性，且离心洗涤方法可能造成额外损失和聚集。

**Analysis of particle size and shape**
采用EAF4-UV-MALS-DLS进行高分辨率分离和表征。EAF4分形图显示，孵育后聚苯乙烯纳米颗粒的保留时间延长（从15-27分钟移至23-24分钟和31-32分钟），表明回转半径（R_g）和水动力学半径（R_h）增大，且出现双峰分布，提示尺寸异质性增加。通过形状因子（SF = R_g/R_h）计算，基线样本呈球形（SF≈0.7），孵育后双峰分别对应球形（SF≈0.6）和长条形（SF≈1.1）颗粒，与FE-SEM形态学结果一致。丝素纳米颗粒基线时在13分钟出峰（较小尺寸），孵育后出现36-41分钟的窄峰，且峰位随电场极性变化，表明其电泳行为对表面电荷敏感。不同电场施加条件（0 mA, ±0.2 mA）对纳米颗粒尺寸属性影响不显著。

**Analysis of charge-related parameters**
通过EAF4和电泳光散射（ELS）比较Zeta电位和电泳迁移率（μ）。基线时所有颗粒的Zeta电位更负（-66.1至-71.0 mV），孵育24小时后显著降低（-28.5至-38.0 mV），表明蛋白大量吸附于颗粒表面，削弱了表面电荷，降低胶体稳定性并促进聚集。EAF4-MALS与EAF4-UV测得的Zeta电位值在不确定度内一致，且R² > 0.9，表明拟合质量可接受。然而，ELS测得的Zeta电位绝对值低于EAF4，且无法分辨孵育后的双峰亚群，而EAF4能揭示尺寸和电荷相关的异质性。所有样本24小时后Zeta电位趋于相似值，证实蛋白冠形成主导了表面电荷特性，无论初始表面功能化如何。

讨论总结：EAF4在分析蛋白冠引起的尺寸和电荷变化方面具有显著优势：它能温和分离纳米颗粒-蛋白复合物，减少样本处理伪影，提供高分辨、多维度的综合表征。同时，该技术存在局限性，如兼容的载液和施加电流范围较窄，影响对不同纳米颗粒类型的适用性。载液离子强度、pH和样本浓度等因素显著影响分离结果。未来需要深入研究载液组成优化，以提高EAF4在馏分回收和下游成分分析中的效用。

研究结论翻译：
复杂生物介质中的纳米颗粒分析是阐明生物-纳米相互作用和推进纳米药物开发的瓶颈。全面理解生物-纳米相互作用对于准确预测纳米颗粒在生物相关环境中的行为至关重要。蛋白冠的形成会显著改变纳米颗粒的物理化学性质、稳定性和生物反应，因此需要稳健可靠的表征策略。通过使用分离-分析方法比较基于聚合物和基于蛋白质的纳米材料在蛋白冠形成过程中的变化，本研究为将联用EAF4与UV-Vis、MALS和DLS作为解析纳米颗粒在富蛋白环境中行为的强大平台提供了概念验证。研究发现，蛋白质吸附显著改变了所有研究纳米材料的物理化学性质——包括尺寸、尺寸分布、形状和表面电荷（电泳迁移率μ和Zeta电位ζ）——变化程度取决于纳米颗粒组成、生物分子环境、温度和孵育时间。研究人员首次证明，EAF4能够根据尺寸和电荷有效从生物介质中分离纳米载体，同时实现暴露于含蛋白质环境后颗粒尺寸、Zeta电位和形态参数的原位表征。与传统测量技术相比，EAF4具有多项优势：它能够以最小扰动实现温和分离纳米颗粒-蛋白冠，减少样本处理和聚集风险，并在单一集成工作流程中提供高分辨率、多维度的分析。此外，EAF4解耦尺寸和电荷相关效应的能力为探测传统方法难以解析的复杂纳米-生物相互作用提供了独特优势。尽管EAF4具有优势，但载液组成的优化仍是一个研究不足的领域。因此，进一步研究载液组成并应对这些挑战对于增强EAF4在洗脱馏分回收及其下游组成分析中的效用至关重要。