通过离体休眠枝条试验评估桃树细菌性溃疡病的方法

《Methods and Protocols》：Detached Twig Assay to Evaluate Bacterial Canker on Peaches Bilgehan A. Geylani, Stephen M. Parris, Jhulia Gelain, Guido Schnabel and Ksenija Gasic

　　

Pseudomonas syringaepv. syringae（Pss）是细菌性溃疡病的致病因子，该病害在全球核果类水果中可导致产量损失、地上组织损伤和树木死亡。桃作为主要核果作物之一，在美国因细菌性溃疡病而遭受显著的产量损失和树木死亡。南卡罗来纳州作为第二大桃生产州，受到Pss的直接和严重影响。早期对桃接穗响应Pss感染的评估主要依赖于砧木试验中的间接田间观察。尽管已有关于桃的实验室评估报告，但这些研究主要关注病原菌毒力测试或小规模种质材料，并未建立标准化、可扩展的离体枝条方案用于系统性种质表型分析。缺乏明确描述的实验室方法限制了桃树细菌性溃疡病耐受性的可重复和大规模评估。为解决这一空白，研究人员对先前为樱桃开发的离体休眠枝条试验进行了调整和优化，以用于桃树。从九个桃种质材料中采集的休眠枝条被切成10 cm的片段，表面消毒后，用制备于10 mM MgCl2缓冲液中的Pss悬浮液或仅用缓冲液（对照）进行接种。经过六周的培养后，通过视觉评估内皮层病变大小，并使用ImageJ进行量化。研究人员建立了一种新的视觉评分量表，并将其与定量的病变测量结果进行了比较。斯皮尔曼相关性分析显示，在两个独立重复中，视觉病害评分与基于ImageJ的病变测量之间存在强正相关性（ρ = 0.80–1.00, p < 0.01），而枝条段直径与病害严重度呈弱至中度的负相关。这种调整和整合的休眠枝条试验为桃树细菌性溃疡病耐受性的表型分析提供了一个实用、可重复和可扩展的方法，并支持未来的种质筛选和育种工作。

研究背景、问题与目的

细菌性溃疡病由Pseudomonas syringaepv. syringae(Pss)引起，是全球核果作物（Prunusspp.）生产面临的重大威胁，也是美国东南部桃园衰退的主要原因。桃是美国重要的核果作物，年产量巨大，但Pss感染可导致显著的产量损失和树木死亡。Pss通常被视为一种弱致病性或机会性病原菌，其感染需要有利的环境条件。由于其附生特性，Pss可在休眠芽、叶片和植物残体等部位越冬和定殖，当树木因其他因素（如修剪损伤、冬季冻害、线虫胁迫等）而处于易感状态时，这些部位成为后续感染的接种源。Pss还具有冰核活性，可降低植物的过冷却能力，增加其对低于2°C冷冻温度的敏感性，使得冬季霜冻成为病害发展的关键诱因。

目前，化学杀菌剂的效果有限，且存在病原菌产生抗药性的风险，因此Pss的管理主要依赖于旨在减少与冬季冻害、病原线虫存在和营养管理相关树木胁迫的栽培措施。然而，这些方法在多变的环境条件下通常提供不一致且不可靠的控制。因此，遗传耐受性被视为Pss管理最可持续和长期的策略。尽管其重要性，但桃品种对细菌性溃疡病的耐受性尚未得到系统表征，部分原因是缺乏标准化和可重复的表型分析方法。虽然已有研究报道了在温室条件下生长的桃及其他核果品种的反应，并且描述了使用基于蛭石系统的实验室致病性测定（包括桃），但这些研究主要关注幼苗反应或病原菌毒力测试。一个整合且标准化的、针对桃种质表型分析优化的离体休眠枝条方案尚未明确建立。

在核果作物中，关于Pss耐受性的全面研究仅在甜樱桃（Prunus avium）中进行过。这些研究涉及评估田间和实验室反应，并确定樱桃种质中耐受性的遗传基础。只有两项研究关注Prunus作物（杏仁和杏）中Pss耐受性的遗传成分，而没有针对桃的研究。先前关于桃的研究主要集中在管理、营养、线虫侵染和砧木对桃易感性的影响上。

表型分析的质量对于下游分析（特别是识别特定性状的基础基因）至关重要，并且可能因实验条件和人为观察产生的混杂因素而受到阻碍。此外，针对田间和实验室病害测定的详细方案很少，并且很少产生可比的数据。樱桃中的Pss研究已成功利用实验室叶片和离体枝条试验，通过执行均匀接种和可控的病害发展来进行。数据收集是基于图像的，并通过与先前创建的评级量表进行比较和/或使用自动化图像分析工具（如ImageJ）视觉获取。

缺乏评估桃种质细菌性溃疡病耐受性的研究，限制了旨在开发对这种毁灭性病害耐受的新品种的育种工作。为了实现未来的遗传研究并促进桃树对Pss耐受性的育种，研究人员调整了先前在甜樱桃中建立的休眠枝条试验，以用于桃树。本研究旨在建立一个实用、可靠的表型分析方法，用于评估桃种质对细菌性溃疡病的耐受性，并将获得的表型数据与基因组或转录组资源整合，以识别与桃树Pss耐受性相关的候选基因和基因组区域。

关键研究方法概述

本研究采用了调整自甜樱桃的离体休眠枝条试验方案。研究人员从九个桃种质材料中收集一年生休眠枝条，将其切成10厘米长的片段，表面消毒后，在受控实验室条件下，用Pss悬浮液（处理）或用缓冲液（模拟接种，对照）进行接种。每个种质设立处理组和对照组，并进行两次独立重复实验。接种后，枝条在生长室中培养一周，随后进行低温处理，再继续培养四周。六周后，通过视觉评估内皮层病变大小，并使用ImageJ软件进行量化。同时，建立了一个五点视觉评级量表，并与ImageJ测量的病变面积百分比进行对应。病害严重度评估通过视觉评分和图像分析两种方法进行，并使用统计软件R进行数据分析，以验证两种评估方法之间的一致性以及试验的可重复性。

研究结果

1. 1.
   试验验证与症状表征：
   调整后的休眠枝条试验在九个桃种质中进行了验证。观察到的症状被用于制定一个五点视觉评级量表，并与相应的ImageJ病变面积百分比对应。视觉评分范围为1（无症状）至5（严重病变），对应0-100%的病变面积。该试验成功区分了九个桃种质之间的病害严重度反应。平均视觉病害严重度评分（基于每个种质十个枝条段）范围从1.1到5.0。ImageJ测量的病变面积范围从0.08到0.85。休眠枝条段直径在两个重复中相近。
2. 2.
   评估方法的相关性与可重复性：
   斯皮尔曼相关性分析显示，视觉评分（VR1和VR2）与基于ImageJ的病变测量（JR1和JR2）在不同重复之间呈强且显著的正相关（ρ = 0.80–1.00, p < 0.01），证明了试验的高可重复性以及手动和数字表型分析方法之间的高度一致性。相比之下，枝条段直径与病害严重度呈弱负相关，表明枝条大小的变化对病变评估的影响不大。

讨论与总结

可靠且可重复的表型分析对于识别遗传变异和支持多年生作物的育种工作至关重要。由Pseudomonas syringaepv. syringae引起的细菌性溃疡病是全球核果类水果的重要病害，而开发具有遗传耐受性的品种仍然是最可持续的长期管理策略。然而，在田间条件下评估细菌性溃疡病反应具有挑战性，因为环境变异性以及病原菌的机会性和常常无症状的特性限制了病害反应的准确评估。已开发的实验室离体叶片和枝条试验能够在木本作物中实现可控和均匀的病害发展评估。虽然此类试验已成功应用于甜樱桃以评估细菌性溃疡病反应，但程序细节并不总是得到完整描述，并且针对桃的标准化方案尚未建立。因此，研究人员调整了用于樱桃细菌性溃疡病评估的休眠枝条试验，并制定了一个整合的方案，以实现对桃种质细菌性溃疡病耐受性的可重复评估。

当应用于桃时，调整后的休眠枝条试验在接种六周后产生了清晰且可测量的症状，这与樱桃类似。基于本研究中观察到的症状范围和进展，开发了一个五点视觉评级量表。视觉评分与ImageJ得出的病变面积测量的对应关系为定性和定量评估提供了一个标准化框架。不同重复间视觉和图像测量之间的高度一致性证实了视觉量表适用于快速筛选，同时与定量图像分析保持一致。不同重复间一致的病变严重度模式进一步证明了调整后试验的可重复性。虽然检测到枝条直径与病变严重度之间存在弱负相关，但回归分析表明，枝条厚度仅占观察到的变异的一小部分。这表明该试验主要反映了寄主反应的差异，而非样本间的形态变异。

本文描述的方案主要基于Krzesinska和Azarenko描述的最初离体枝条方法，以及后来Li等人用于开发自动化图像检测系统的方法。在将该方法调整用于桃时，观察到了一些实际差异。与樱桃相比，桃枝条由于外皮较薄而更难剥离，这增加了损伤内皮层和暴露形成层的风险。暴露的内皮层快速氧化是另一个实际限制，特别是在桃中。剥离外皮后，快速变色可能会干扰准确的病变测量。因此，成像应在剥离后立即进行。此外，在涉及大量种质的实验中，将枝条段临时储存在4°C下可以停止症状进展并便于批量处理。与原始的樱桃方案一致，病变评估在枝条段的上部3厘米内进行。由于剥离更长部分而不损伤内皮层的困难，这个长度在桃中也是实用的。然而，病变进展可能超出这个区域，将评估限制在3厘米可能会降低症状发展更缓慢的基因型之间的分辨率。与其他离体枝条试验一样，培养期间的高湿度可能促进次生真菌生长。当观察到真菌污染时，将枝条短暂浸入杀真菌剂溶液中可有效减少表面真菌发育，而不干扰症状评估。

尽管离体叶片和枝条试验已应用于甜樱桃和其他Prunus物种以评估细菌性溃疡病反应，但详细的方法描述通常分散在多个出版物中，或为不同的实验目的而调整。通过为桃整合和标准化这种方法，本研究提供了一个明确描述的可重复方案，该方案考虑了物种特异性因素，并支持育种规模的种质评估。

结论

本研究结果表明，调整后的离体休眠枝条试验能够在受控实验室条件下区分桃种质间细菌性溃疡病严重度的差异。独立重复间的一致结果证实了该方法是可重复的。本文描述的方案为筛选桃种质和生成适用于未来遗传研究的表型数据提供了一个实用工具。未来的工作应确定实验室观察到的反应是否与田间的实际病害表现相对应。表型数据与基因组或转录组分析的整合可能有助于识别参与细菌性溃疡病耐受性的候选基因。此外，应在田间条件下评估砧木-接穗相互作用的潜在影响。