StemQuant：一种用于量化划痕实验中间充质干细胞迁移的自动化方法

《Optics & Laser Technology》：StemQuant: an automated method for quantifying mesenchymal stem cell migration in scratch assays

　　李佳进|雷俊秋|韩宝辉|关彩忠|马晖|廖然
中国深圳518055，清华大学深圳国际研究生院

摘要
对微藻细胞进行原位表征对于理解种间竞争和藻华形成等生态过程至关重要。然而，现有的大多数技术依赖于采样、预处理或转移至专用比色皿，这阻碍了对活体微藻群落的连续、无损监测。在本文中，我们直接测量玻璃烧杯中悬浮单个细胞的穆勒矩阵，从而无需复杂预处理即可实现无标记的原位分析。在设计的共培养实验中，穆勒矩阵测量可区分链状亚历山大藻、利马原甲藻及其相互作用形成的聚集体，并能追踪群落组成随时间的变化。米氏矩阵和T矩阵模拟进一步将穆勒矩阵元素与细胞大小、形状及折射率的变化联系起来。所提出的框架为微藻群落及其相互作用的原位分析提供了一种实用方法。

引言
当两个或多个物种为有限资源而竞争时，就会发生种间竞争[1]。这是决定物种进化模式的重要因素，也是生物群落重组的关键因素。通过争夺营养物质、光照和其他资源，微藻会分泌某些物质，这些物质会直接或间接影响其他微藻的生长[2][3]。在自然水域中，微藻之间普遍存在激烈的种间竞争，营养物、细胞浓度、盐度、光照强度和温度等环境因素会显著影响这种竞争的结果[4]。微藻间的种间竞争主要分为两类：利用性竞争和干扰性竞争[5]。
利用性竞争是指生物对有限环境资源的竞争利用，当这些资源减少时，会对其生存产生不利影响[6][7][8][9]。例如，当美丽星形藻和肘形藻共同培养时，由于肘形藻会降低硅浓度，使其低于美丽星形藻生存和繁殖所需的水平，从而导致肘形藻胜出并取代美丽星形藻[7]。而干扰性竞争则是指微藻物种通过各种生物学机制相互影响[10]，其结果可能从相互抑制到中性，甚至对一个物种有利而对另一个物种有害[11]。在微藻细胞中，干扰性竞争的主要形式为化感作用和细胞间接触。化感作用是指生物向周围介质释放生物活性化合物，从而改变自身及邻近物种的生长和代谢[12]。因此，在无细胞滤液中培养微藻是一种有效的方法，可通过消除直接接触和营养竞争来分离化感效应[13]。例如，四尾裸甲藻的无细胞滤液已被证明能抑制波里安柱状藻的生长[2]。这类化感作用可通过破坏细胞结构、抑制光合作用以及降低酶活性来抑制微藻生长。因此，阐明基于化感作用的有害微藻抑制机制，对于预防和控制藻华与赤潮具有实际意义[14]。
要了解微藻间的种间竞争，就需要监测水生环境中的关键指标，包括细胞浓度、生理活性以及形态变化[15][16]。通过研究微藻在不同竞争条件下的反应，我们可以更全面地理解自然水域中藻华与赤潮的形成和演替机制[17][18]。对生物群落变化的原位监测有助于预防和控制有害生物事件，对于维持水生环境的生态健康与平衡也具有重要意义[19]。
微藻分析通常需要使用先进的仪器和方法。一般来说，光学显微镜仍是识别和计数微藻的传统金标准[20][21]。此外，扫描电子显微镜、透射电子显微镜和原子力显微镜等多种显微技术也被用于更深入地了解微藻的细胞结构和生理功能[22][23]。然而，这些显微技术大多耗时且劳动强度大，使得微藻的原位分析变得困难。光谱测量和比色法主要用于监测和分析整体生物量及生物分子[24]。目前用于微藻分析的光学方法存在诸多局限，包括处理时间、准确性、可靠性以及与实时数据采集的兼容性等问题。流式细胞术和DNA分析则是测量细胞浓度最强大且最具前景的技术之一[25]，但它们的实际应用通常需要对微藻细胞进行一些复杂的预处理。例如，在实验室流式细胞术中，微藻悬液必须先稀释并取样，再通过流体动力学聚焦引入流动系统。这些操作可能会损伤单个细胞和脆弱的聚集体，还常常导致进样口堵塞[26]。因此，对微藻浓度、群落组成和生理状态进行无损的原位测量仍然十分困难。这一状况凸显了需要新的微藻原位分析方法，以推动微藻种间竞争研究的发展。

偏振是光的固有属性。偏振状态由斯托克斯向量描述，表示为S=[I,Q,U,V]T，其中I为总光强，Q、U、V分别为偏振分量。穆勒矩阵是一个4×4矩阵，可用于描述样本的全部偏振特性，如方程（1）所示：
M=M11M12M13M14M21M22M23M24M31M32M33M34M41M42M43M44
一般来说，散射光（Sout）的斯托克斯向量与入射光（Sin）的斯托克斯向量之间存在如下关系（2），利用这一关系即可确定样本的穆勒矩阵：
Sout=M·Sin
近年来，偏振光学技术发展迅速[27][28][29]。偏振光包含了关于微藻形态和微观结构的丰富信息，而从斯托克斯向量或穆勒矩阵得到的偏振参数已被证明能有效区分不同的微藻种类[30][31][32][33][34][35]。此外，基于偏振光散射的仪器也可方便地用于原位测量[36][37]。在本研究中，我们提出了一种利用穆勒矩阵偏振法分析微藻细胞的新颖原位方法[38]。该方法无需采样和任何预处理，即可对悬浮单个细胞的穆勒矩阵进行原位测量[39][40]。穆勒矩阵可用于监测烧杯内微藻种类、浓度及相对比例随时间的变化，从而详细研究干扰性竞争。实验结果表明，我们的方法能够准确、原位地评估微藻的浓度和比例，以及其生理状态的变化，进而揭示生物群落内的动态变化，为相关微藻及生物学研究提供了新的研究范式。

实验样品
本研究选取了两种常见的有害微藻作为测试样本[41][42]，即链状亚历山大藻和利马原甲藻，这些样本由中国上海的上海广宇生物科技有限公司提供。本研究旨在通过共培养和滤液培养实验，探讨这两种有害微藻之间的种间相互作用机制，研究它们在生长和生理反应方面的相互影响。

实验样品
准确的浓度测量是微藻分析的关键。在本研究中，我们通过在同一个烧杯中逐步添加链状亚历山大藻，并利用穆勒矩阵偏振法测定每次添加后的浓度，从而构建浓度梯度实验。通过主成分分析降低穆勒矩阵数据的维度，找出链状亚历山大藻的主要特征。随后，应用3-西格玛原则筛选链状亚历山大藻数据，剔除那些出现显著偏差的异常值。

链状亚历山大藻与利马原甲藻之间的种间竞争
考虑到利马原甲藻的无细胞滤液和细胞悬液对链状亚历山大藻的影响，可以明显看出利马原甲藻通过多种机制抑制链状亚历山大藻的生长。通过对同一烧杯中链状亚历山大藻细胞的原位监测，我们更深入地了解了链状亚历山大藻如何应对利马原甲藻无细胞滤液中的化感物质。在培养初期，利马原甲藻的无细胞滤液会对链状亚历山大藻产生抑制作用，但一旦链状亚历山大藻细胞适应了新的环境，情况又会发生变化。

结论
我们建立了一种无标记、无损的穆勒矩阵偏振法框架，用于微藻的原位分析。该方法完全在玻璃烧杯内实施，无需复杂预处理，即可实时量化细胞浓度、物种组成及相互作用动态。利用这一框架，我们获得了链状亚历山大藻与利马原甲藻之间存在干扰性竞争的明确证据。理论计算进一步证明了穆勒矩阵具备区分不同微藻物种的能力。

致谢
作者贡献说明：
李佳进：写作——审稿与编辑、写作——初稿撰写、可视化、方法学、研究工作。
雷俊秋：指导、研究工作、数据整理、概念设计。
韩宝辉：验证、数据整理。
关彩忠：研究工作。
马晖：项目管理。
廖然：写作——审稿与编辑、指导、项目管理、方法学、研究工作、资金筹集、概念设计。

资助
本研究得到了海南省科技发展计划（ZDYF2022SHFZ323）、国家自然科学基金（62275141）、浙江省自然科学基金（LQN25D060003）、东海实验室科学基金（L25QH004）以及舟山海纳计划（202301）的支持。

利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。