基于转录组学技术的金银花叶多糖对樱桃谷鸭免疫调节效应分析

《Poultry Science》：Analysis of the Immunomodulatory Effects of Honeysuckle Leaf Polysaccharides on Cherry valley Ducks Based on Transcriptomic Techniques

　　

本研究旨在优化金银花叶多糖（Honeysuckle leaf polysaccharides, HLP）的提取工艺，并探究其对樱桃谷肉鸭免疫功能的调控效应及其分子机制。研究人员以干燥金银花叶为原料，采用水提醇沉法提取HLP，通过单因素试验结合响应面法（Response surface methodology, RSM）优化提取参数，确定最优提取条件为料液比1:20、提取温度90°C、提取时间80 min，多糖得率为5.46 ± 0.18%。研究建立了3日龄樱桃谷鸭21天灌胃给药模型，体内外试验联合表明HLP在5~3000 μg/mL浓度范围内无细胞毒性，能显著提高鸭雏免疫器官指数并明显增强外周血淋巴细胞活力；HLP与脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）联用可协同促进淋巴细胞增殖。转录组学分析揭示HLP主要通过调控过氧化物酶体增殖物激活受体（Peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR）信号通路及细胞因子-细胞因子受体相互作用通路发挥免疫调节作用。该研究优化了HLP提取工艺，阐明了其在禽类中多通路协同免疫调节机制，为HLP作为天然免疫调节剂在可持续畜禽健康管理中的开发应用提供了坚实的实验与理论支撑。

## 研究背景与问题提出

免疫系统是维持机体稳态与免疫防御的核心机制，通过免疫调控作用调节免疫应答、维持内环境平衡并抵御疾病进程。天然产物因其多靶点调控活性及低毒性特点，已成为免疫调节剂开发的重要研究方向。金银花（Lonicera japonica Thunb.）作为传统药食同源植物，含有挥发油、有机酸、黄酮类及绿原酸等丰富成分，具有免疫调节、抗炎及抗氧化等多种生物活性。然而现有研究主要集中于金银花叶多糖的抗氧化等活性，对其免疫调节功能尤其是分子水平的系统研究仍十分匮乏，严重制约了该资源的高值化开发与应用。植物多糖作为一类重要的生物活性大分子，在免疫调节中占据核心地位，但金银花叶多糖在禽类中的免疫调节机制尚未明确。

肉鸭是目前主要的水禽养殖品种，但禽产业面临免疫调节剂短缺的困境。在集约化饲养条件下，因免疫力不足导致的高发病率已成为制约肉鸭产业可持续发展的关键瓶颈。鸭圆环病毒（Duck circovirus, DuCV）感染可破坏淋巴组织，鸭呼肠孤病毒（Duck reovirus, DRV）感染可诱导免疫器官病理损伤并降低免疫细胞活性，霉菌毒素可破坏免疫器官结构完整性并降低血清免疫球蛋白浓度。因此，开发安全有效的免疫调节剂以增强肉鸭免疫功能，对全球水禽养殖业的可持续发展具有深远意义。

转录组学（Transcriptomics）作为功能基因组学的核心技术，能够系统阐明特定生理或实验条件下生物体全部转录本（如mRNA和非编码RNA）的表达谱与调控网络。该技术已被广泛应用于解析不同生理或实验处理条件下基因表达谱的动态变化，通过高通量测序（High-throughput sequencing, HTS）准确识别差异表达基因（Differentially expressed genes, DEGs）和关键调控通路。

## 研究设计与主要结论

为优化干燥金银花叶中多糖的提取工艺，研究人员采用水提醇沉法提取粗HLP，运用单因素试验结合响应面法进行参数优化，以粗HLP提取率为响应变量，通过三因素三水平Box-Behnken设计（BBD）深入分析三个因素的交互效应及其对提取率的综合影响。动物试验选用60只1日龄健康樱桃谷鸭，预饲3天后随机分为4组（对照组、低剂量HLP组0.2 mg/mL、中剂量HLP组2 mg/mL、高剂量HLP组20 mg/mL），每组5个重复，每重复3只，连续灌胃21天。试验期间测定生长性能指标（平均日增重Average daily gain, ADG、平均日采食量Average daily feed intake, ADFI、料重比Feed conversion ratio, F/G）和免疫器官指数（胸腺指数、脾脏指数、法氏囊指数）。采用CCK-8法检测外周血淋巴细胞（Peripheral blood lymphocytes, PBLs）活力，并通过转录组测序分析十二指肠和脾脏组织的基因表达谱变化，经qPCR验证关键基因表达。

研究得出以下主要结论：HLP在5~3000 μg/mL浓度范围内对淋巴细胞无细胞毒性且能促进其增殖，500 μg/mL时效果最显著；4000~5000 μg/mL高浓度则抑制淋巴细胞增殖。HLP与LPS联用呈现协同促增殖效应，体现"时间-剂量协同效应"。HLP显著提高鸭雏胸腺指数和法氏囊指数，对脾脏指数有提升趋势但无统计学差异。转录组学揭示HLP主要通过调控PPAR信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用通路发挥免疫调节作用，涉及IL-12B、CSF-1、CXCR6、IL-18RAP等免疫调控基因及ME1、CPT1B、ACSL1等代谢相关基因。该研究为HLP作为天然免疫调节剂在可持续畜禽生产中的应用提供了理论基础和实验依据。

## 关键技术方法

本研究采用的核心技术方法包括：（1）水提醇沉法结合响应面法（RSM）优化HLP提取工艺参数，通过Box-Behnken设计建立二次多项式回归模型；（2）樱桃谷鸭体内灌胃模型（样本来源：山东豪泰实验育种有限公司），分组处理并进行生长性能与免疫器官指数测定；（3）淋巴分离介质密度梯度离心法分离外周血淋巴细胞，CCK-8法检测细胞活力及增殖率；（4）BGI-MGI T⁷⁺测序平台进行高通量转录组测序，采用FastP进行质控、HISAT2构建参考基因组索引、HTSeq定量基因表达、DESeq2识别差异表达基因（筛选标准|log₂FC| > 1且P < 0.05）、clusterProfiler进行GO功能注释和KEGG通路富集分析；（5）qPCR技术验证转录组结果，以β-actin为内参基因，采用Evo M-MLV逆转录试剂盒进行逆转录，SYBR Green法进行定量分析。

## 研究结果

**单因素试验研究**

提取温度对HLP得率的影响显示，随温度从60°C升至100°C，得率持续上升，100°C时达最大值4.45%，高温可破坏植物细胞壁结构、扩大细胞间隙，促进多糖溶出。提取时间对得率的影响显示，20~100 min范围内得率显著上升，100 min时达峰值，适当延长提取时间有利于溶剂深入原料内部促进多糖释放。料液比对得率的影响呈现先升后降趋势，1:20（g/mL）时得率达最大值2.56%，该比例有利于细胞内HLP快速迁移，超过此比例后得率逐渐下降。

**响应面法试验结果**

基于单因素试验结果，采用BBD原理建立RSM模型，Design-Expert 13软件生成17组试验运行。多元回归分析得到二次多项式回归方程，方差分析显示模型F值为15.08、P < 0.05，表明模型显著且实验设计合理；非拟合项P值为0.4231 > 0.05，说明非实验因素影响较小。模型R²=0.9510，校正R²_Adj=0.8879，预测值与实际值差异小，变异系数C.V.=7.77%，表明模型具有优良的拟合度、通用性和预测能力。回归系数显著性检验表明线性项（A和B）和二次项（A²、B²和C²）对提取率有显著影响。三维响应面图和二维等高线图直观展示了料液比与提取温度、提取温度与提取时间、料液比与提取时间三对因素的交互效应。经模型预测和实验验证，确定最优工艺参数为：料液比1:20（g/mL）、加热温度90°C、提取时间80 min，HLP得率为5.46%。平行实验验证得率为5.46 ± 0.18%，与预测值吻合良好，证实模型可靠有效。

**HLP对体重和生长性能的影响**

HLP处理组鸭体重在整个试验期（7~35天）呈持续上升趋势。与对照组相比，低浓度HLP组体重显著更高（P < 0.01），中高浓度组体重增加更为显著（P < 0.001），且随HLP浓度升高和试验时间延长该效应愈发明显。料重比（FCR）方面，HLP处理组在整个试验期均低于对照组，14~21天时各处理组FCR持续处于较低水平，高浓度组FCR显著降低（P < 0.001）。这些结果共同表明HLP对樱桃谷鸭雏具有促生长效应。

**HLP对胸腺、脾脏和法氏囊指数的影响**

胸腺指数方面，各HLP处理组在整个试验期呈现波动变化。低浓度组第7天较对照组升高（P < 0.01），中、高浓度组显著增加（P < 0.001）；高浓度组第14天升高（P < 0.05），第21天达峰值（P < 0.001）。脾脏指数方面，所有HLP处理组在7~35天内均高于对照组，但组间无统计学差异（P > 0.05）。法氏囊指数方面，第7天低浓度组升高（P < 0.01），中、高浓度组达峰值（P < 0.001）；第14天低浓度组显著增加（P < 0.01），中、高浓度组极显著增加（P < 0.001）；第21天高浓度组仍显示升高（P < 0.05）。

**不同浓度HLP对外周血淋巴细胞的毒性试验**

CCK-8法评估不同浓度HLP对樱桃谷鸭雏PBLs活性的影响显示，与阴性对照组相比，5~3000 μg/mL浓度范围的HLP显著促进淋巴细胞增殖，500 μg/mL时效果最显著，表明该浓度范围内HLP对淋巴细胞无细胞毒性且可增强其增殖活性。相反，4000~5000 μg/mL HLP组的淋巴细胞增殖活性显著低于空白对照组，提示高浓度HLP可能对淋巴细胞增殖产生一定抑制作用。

**CCK-8法检测HLP对樱桃谷鸭PBLs活性的影响**

CCK-8法评估HLP单独及与LPS联合对鸭雏PBLs增殖的影响结果表明，HLP单独作用时对淋巴细胞具有增殖效应，所有浓度均促进淋巴细胞增殖。第7天时低、中浓度HLP组增殖活性增加最显著（P < 0.0001）；第14天时所有HLP浓度均显著增强淋巴细胞增殖（P < 0.0001）。HLP与LPS协同作用于淋巴细胞时，中、高浓度HLP组第7天显著促进淋巴细胞增殖（P < 0.0001）；第14、21、28天时所有HLP浓度均显著增强淋巴细胞增殖（P < 0.0001），仅第21天出现增殖活性轻微下降，整体呈先升后降趋势。这些结果表明，HLP对淋巴细胞增殖发挥"时间-剂量协同效应"，通过调控淋巴细胞活化、细胞增殖周期和细胞代谢状态，在不同剂量和时间点呈现增殖活性的差异化动态变化；且HLP与LPS联合应用产生协同促增殖效应。

**转录组学分析**

样本基因表达分析与差异表达基因分析显示，为探究HLP作用机制，研究人员从对照组和HLP处理组脾脏及十二指肠样本中提取总RNA进行转录组测序分析。箱线图显示四组间基因表达水平变异较小，各组内样本整体基因表达水平高且重复性良好。主成分分析（PCA）结果显示，对于十二指肠样本，主成分1（PC1）、主成分2（PC2）和主成分3（PC3）的方差贡献率分别为38.16%、34.71%和27.13%；脾脏样本分别为41.27%、32.79%和25.94%，三个主成分解释了样本变异的主要来源。在PCA空间中，不同浓度HLP处理组样本与空白对照组样本明显分离，表明HLP处理显著改变了脾脏和十二指肠组织的转录谱特征。三处理组与空白对照组间的两两比较显示，HLP处理组脾脏基因表达存在显著差异，因此本研究重点呈现和讨论十二指肠的转录组结果与分析。

**处理组间相关性分析与差异表达基因聚类分析**

Pearson相关系数热图显示，低浓度HLP组（B）、中浓度HLP组（C）、高浓度HLP组（D）与空白对照组（A）之间的基因表达相关性R²值均为0.97，表明样本间基因表达谱具有极高的相似性。DEGs聚类分析中，红色代表高表达基因，绿色代表低表达基因。聚类结果显示表达模式相似的基因聚类在一起，空白对照组（A）和中浓度HLP组（C）低表达基因比例较高，而低浓度HLP组（B）和高浓度HLP组（D）高表达基因比例较高，清晰反映了不同浓度HLP对基因表达模式的差异化调控效应。

**差异表达基因分析**

十二指肠组织中，各HLP处理组与空白对照组相比的DEGs数量为：低浓度组749个（上调305个、下调444个）；中浓度组776个（上调417个、下调359个）；高浓度组782个（上调410个、下调372个）。Venn图结果显示（表达阈值=1）：空白对照组特有表达基因143个，低浓度HLP组85个，中、高浓度HLP组各138个；空白对照组分别与低、中、高浓度组共享基因63、96、86个；四组共表达基因10,391个。综合差异基因表达分析共识别1,682个DEGs，其中140个基因显示显著的组间表达差异。

**Gene Ontology富集分析**

DEGs的GO富集分析显示，生物学过程（BP）显著富集于多细胞生物过程、病毒过程和炎症反应等相关通路。关键候选基因包括SLC26A6、APOLD1、ABCB11和GOLGA3，在离子/有机酸转运、血管通透性调控和胆汁酸分泌等核心生理过程中发挥重要作用。细胞组分（CC）富集分析主要识别出膜复合物和离子转运相关细胞结构的显著富集，代表基因包括SGCE、SGCA和ATP1B4，表明其参与膜蛋白复合物组装和离子泵功能。分子功能（MF）富集分析识别出核心基因CYP2C9、CYP1A4-like、Mb、CYP2K6和CCL4L，显著富集于氧化还原酶活性和趋化因子活性，反映这些基因在药物代谢、氧化应激反应和炎症信号通路中的核心作用。

**Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes富集分析**

KEGG富集分析显示DEGs涉及两大类通路：免疫相关通路（如沙门氏菌感染、PPAR信号通路、肠道免疫网络IgA产生）和营养代谢相关通路（如谷胱甘肽代谢、维生素消化与吸收）。HLP处理后，DEGs主要富集于PPAR信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用通路。黏膜免疫调控相关关键基因包括IL-12B、CSF-1和IL-18RAP，营养代谢相关基因包括ME1、CPT1B和ACSL1，这些免疫和代谢通路呈现协同调控效应。

**蛋白质-蛋白质相互作用网络分析**

通过计算节点度值进行基因相互作用网络的拓扑结构分析，揭示与高 degree 值节点相关的基因在网络中占据中心位置，核心功能集中于细胞调控和代谢稳态。不同HLP浓度组间基因交集的Venn图分析结合基因相互作用网络分析，识别出四组间共享的10,391个基因（占88.22%），构成核心共享基因集。其中ALDH18A1和MET在网络中占据中心节点位置，提示它们可能在上述免疫和代谢通路中发挥关键调控作用。

**外周血淋巴细胞中转录组学分析结果的qPCR验证**

本研究中IL-10、IL-18B和CXCR6的筛选流程如下：基于转录组测序数据和核心研究目标，研究人员进行DEGs初筛、功能富集分析和核心靶基因验证。首先使用DESeq2软件对各HLP处理组与空白对照组的测序数据进行差异表达分析，筛选符合|log₂FC| > 1和P < 0.05阈值的基因构建HLP调控的DEG集合。随后进行GO功能注释和KEGG通路富集分析，优先关注免疫应答相关通路并识别与这些通路相关的候选DEGs。最终基于基因表达差异幅度及其功能核心相关性，选择IL-10、IL-18B和CXCR6作为qPCR验证的靶基因。这些基因介导免疫稳态调控、炎症信号放大和免疫细胞迁移过程，其对外周血淋巴细胞免疫功能的调控效应通过qPCR进一步探究。qPCR验证结果显示，免疫调控因子IL-10、IL-18B和CXCR6显著激活免疫相关基因的转录：各HLP处理组中所有检测基因的表达水平均明显高于空白对照组，大多数呈现极显著差异（P < 0.0001），表明这些因子有效促进免疫细胞（如CD4⁺ T细胞）的激活和炎症信号通路（如CD86介导的抗原呈递过程）的放大。同时数据揭示不同的调控特异性：不同免疫因子在其下游靶基因中表现出不同程度的上调，如CXCR6在其对应HLP处理组中的表达显著高于其他组，而TLR4在IL-18B调控组中的上调幅度明显高于IL-10处理组。这与细胞因子及其受体的特异性配对模式一致，表明这些免疫因子并非非特异性激活基因，而是通过靶向不同功能基因参与免疫应答的不同阶段，如IL-18B优先激活TLR4介导的炎症信号通路，而IL-10主要调控CD4⁺ T细胞的免疫功能，共同在免疫和炎症信号轴内形成协同调控网络。

**十二指肠组织中转录组学分析的qPCR验证**

qPCR验证结果显示，各HLP处理组中所有检测基因的表达水平均显著高于空白对照组，大多数呈现极显著差异（P < 0.0001），表明包括IL-10和IL-12B在内的免疫调控因子可广泛激活免疫相关基因的转录，提示这些因子可能参与免疫细胞激活和炎症信号通路的放大。同时数据同样揭示调控特异性：不同免疫因子表现出不同程度的靶基因上调，如CXCR6在其对应组中的表达显著高于IL-10和IL-12B组，而TLR4在IL-18B组中的上调幅度明显大于IL-10组。这表明免疫因子与其下游靶基因之间存在相对特异性的调控关联，而非非特异性泛激活，这种特异性符合细胞因子-受体配对原理（如CXCR6作为趋化因子受体直接受其同源配体诱导），证实这些因子并非无差别激活基因，而是靶向特定功能基因参与免疫应答级联的不同阶段。

## 讨论部分总结

本研究通过提取工艺优化、体内外活性验证及转录组学分析相结合，阐明了HLP调控樱桃谷鸭免疫与营养代谢的协同机制。结果表明，HLP不仅显著改善鸭雏生长性能、促进免疫器官发育、增强淋巴细胞增殖活性，还与LPS产生协同促增殖效应。这种协同源于先天免疫与多糖调控的互补机制：LPS通过TLR4通路快速启动免疫信号并诱导初始增殖，而HLP优化免疫细胞能量代谢、增强其对LPS信号的敏感性，并缓冲过度炎症激活，从而放大增殖效应、强化适应性免疫并维持免疫稳态。此外，HLP通过靶向PPAR信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用等核心信号通路，构建了"免疫激活-代谢增强"的正向调控网络。

生长性能与免疫功能的协同改善是畜禽健康养殖的核心目标。本研究中HLP处理组鸭雏ADG显著提高、F/G降低，中、高浓度组呈明显剂量依赖关系，与香菇多糖可同时提升亚洲海鲈生长性能和免疫功能的既往发现一致。值得注意的是，HLP对鸭雏免疫器官发育呈现选择性调控效应：显著增加胸腺指数和法氏囊指数，而脾脏指数呈非显著性增加。胸腺作为禽类T细胞成熟的核心器官、法氏囊作为B细胞分化的主要场所，其指数增加直接反映了HLP在启动鸭雏适应性免疫应答中的作用。脾脏作为免疫细胞聚集和免疫应答启动的主要场所，其指数动态波动可能与HLP调控的免疫细胞激活和迁移有关。

转录组分析揭示了HLP的组织特异性调控模式：十二指肠DEGs显著多于脾脏，且这些DEGs显著富集于免疫调节和营养代谢相关通路，这与肠道作为家禽黏膜免疫和营养吸收中心器官的双重生理角色高度一致。KEGG富集分析表明，HLP诱导的DEGs显著富集于PPAR信号通路。相关研究报道PPAR-γ激活可上调FATP4、FAT/CD36和FABP4的表达。该通路通过调控PPARα和PPARγ等转录因子调节脂质代谢和免疫细胞功能。HLP激活PPAR通路后，下游代谢基因ME1和CPT1B显著上调。ME1催化苹果酸转化为草酰乙酸或丙酮酸，参与三羧酸循环和糖异生，促进细胞能量产生；CPT1B作为脂肪酸β-氧化的关键酶，促进脂肪酸转运至线粒体进行β-氧化生成ATP，对维持细胞能量稳态至关重要。本研究中ME1、CPT1B和ACSL1等基因的上调，不仅促进了脂肪酸分解代谢和能量代谢为免疫细胞激活提供充足能量，还通过优化脂质代谢稳态减轻炎症细胞因子的过度释放，体现了HLP介导的代谢与免疫之间的协同调控串扰。这与PPARγ通过调控巨噬细胞脂质代谢增强抗原呈递能力的既往结论一致，进一步验证了PPAR信号通路在多糖介导的免疫-代谢串扰中的核心作用。

此外，IL-12B、CSF-1、CXCR6和IL-18RAP等免疫相关基因的上调促进了促炎和趋化因子的分泌与信号转导。IL-12B作为Th1型免疫应答的关键调控因子，其上调促进T细胞向效应细胞分化。细胞因子-细胞因子受体相互作用通路的富集进一步阐明了HLP介导的十二指肠黏膜免疫调控的分子网络。CD4作为调控辅助性T细胞激活的核心分子，通过其高表达促进免疫应答从先天免疫向适应性免疫转换；局部黏膜IgA分泌增加通过"免疫排斥"机制清除肠道病原体，强化鸭雏肠道黏膜屏障功能。qPCR验证揭示IL-12B、CD4、IgA和趋化因子受体CXCR6等基因显著上调。TLR4表达升高表明HLP可能通过TLR4介导的先天免疫信号通路激活细胞因子分泌，从而启动鸭雏适应性免疫应答。炎症抑制因子IL-10的上调可防止过度炎症对肠黏膜的损伤，维持黏膜免疫稳态。

## 研究结论

综上所述，本研究通过单因素试验结合响应面法（RSM）优化了金银花叶多糖（HLP）的高效提取工艺。通过免疫器官指数和生长性能评价、淋巴细胞增殖活性检测及转录组学分析，首次在肉鸭（樱桃谷鸭）模型中证明HLP通过协同调控过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用网络发挥免疫调节效应。该发现填补了HLP在禽类中免疫调节机制的研究空白。HLP对肠道黏膜免疫和营养代谢的同步调控效应，以及本研究中识别的新型分子靶标，为HLP作为天然免疫调节剂应用于可持续畜禽生产提供了坚实的理论和实验支撑。基于生长性能、免疫器官发育和淋巴细胞增殖活性的综合检测结果分析，推荐从3日龄开始对樱桃谷鸭雏采用2~20 mg/mL的HLP灌胃剂量进行免疫调节和促生长干预。该剂量范围可实现免疫功能与营养代谢的协同优化，为HLP在畜禽生产实践中的应用提供具体剂量参考。HLP通过协同调控PPAR信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用通路激活免疫应答并间接调控代谢过程。免疫细胞的激活需要大量能量支持，代谢通路上调提供充足营养和能量，从而形成免疫激活、代谢增强、继而免疫功能强化的正反馈回路。该调控回路不仅改善鸭雏营养利用效率，还协同强化机体免疫稳态。