Ardisia humilis Vahl.不同部位的植物成分及其生物活性：通过体外实验和分子对接方法研究其抗氧化活性及抗癌潜力

《Beni-Suef University Journal of Basic and Applied Sciences》：Phytoconstituents and bioactivities among different parts of Ardisia humilis Vahl.: antioxidant activity and anticancer potential via in vitro and molecular docking approaches

　　摘要
背景
Ardisia humilis Vahl. 属于 Ardisia 属，该属含有次级代谢产物。本研究探讨了 Ardisia humilis Vahl. 不同部位的植物成分、抗氧化特性和细胞毒性。

方法
使用甲醇提取 Ardisia humilis Vahl. 的不同部位（叶片、茎、种子、花朵和幼果），并研究了其在人乳腺癌细胞（Michigan Cancer Foundation-7/MCF-7）中的抗氧化和细胞毒性作用。此外，还利用超高效液相色谱-高分辨率质谱（UPLC-HRMS）进行了生化分析。同时，对雌激素受体 α（Erα，PDB ID = 6CBZ）和脂肪酸合成酶（FASN，PDB ID = 4PIV）进行了分子对接研究。

结果
叶片提取物表现出最高的抗氧化活性（IC50 = 32.869 μg/mL），其次是茎、种子、幼果、花朵和老果。叶片提取物中的酚类化合物含量最高（155.07 mgGAE/g 提取物）。茎提取物中的总黄酮类化合物含量最高（46.97 mgQE/g 提取物）。通过 UPLC-HRMS，在 Ardisia humilis Vahl. 的所有不同部位共鉴定出 38 种化合物。细胞毒性实验表明，在 200 μg/mL 浓度下，种子和叶片提取物分别显著抑制了 101.74% 和 92.56% 的癌细胞增殖。分子对接结果显示，主要存在于叶片提取物中的 4',4-二甲基皮加莱奇加酸酯（4',4-dimethylepigallocatechingallate）与 Erα 的结合亲和力最强（MolDock 分数为 ?145.667 kcal/mol），超过了阳性对照物 4-羟基他莫昔芬（?116.207 kcal/mol）。同样存在于叶片中的蒂利罗苷（tiliroside）与 FASN 的结合亲和力也最高（MolDock 分数为 ?172.372 kcal/mol），优于已知的抑制剂 IPI-9119 和 cerulenin。

结论
本研究证实了 Ardisia humilis Vahl. 的植物部位是抗氧化剂和抗癌物质的潜在重要来源。需要进一步的研究来分离、鉴定这些成分，并通过全面的体外和体内实验阐明其生物活性机制。

1 引言
草本植物富含具有优异药用潜力的生物活性化合物，可用于开发药品和健康产品。草本植物中的生物活性化合物，如生物碱、黄酮类、单宁、萜类和皂苷，具有多种治疗作用，包括抗菌、抗病毒、抗炎、抗疟疾、抗衰老、抗真菌和抗癌作用 [1, 2]。这种潜力促使科学家进一步研究草本药物的化学性质，以寻找针对多种疾病靶点的新化合物 [1, 2]。癌症是全球主要的死亡原因之一，2020 年导致近 1000 万人死亡，占死亡人数的六分之一 [3]。抗氧化剂与癌症有关，因为自由基（如活性氧 ROS）的产生与身体中和或修复它们的能力之间的不平衡会损害细胞并导致多种疾病，包括癌症 [4]。目前的癌症治疗方法虽然有效，但常常会伤害正常细胞，因此需要发现替代疗法。草本植物提供了一种有前景的替代疗法，因为天然产品的副作用比传统药物少 [5]。
一种值得注意的草本植物 Ardisia humilis Vahl.（属于紫金牛科）含有丰富的次级代谢产物，包括多酚、黄酮类、三萜类、醌类和脂肪酸 [6]。多种 Ardisia 物种已被研究其药用特性，如抗炎、止痛、止泻、退烧、止咳、消肿、抗风湿、抗糖尿病以及抗癌作用 [7, 8]。多项研究表明，Ardisia elliptica 的果实具有抗癌和抗菌作用，而其叶片具有抗血小板聚集作用 [9, 10]。其他 Ardisia 物种，如 Ardisia crispa、Ardisia crenata 和 Ardisia gigantifolia，也表现出抗炎和抗癌作用 [11,12,13]。Ardisia humilis Vahl. 的叶片也被研究其抗糖尿病、抗炎和抗氧化作用 [14,15,16]。然而，该植物的其他部位尚未得到充分研究，因此有必要对其健康特性进行探索。
对药用植物的化学分析对于研究其生物活性成分至关重要。超高效液相色谱/高分辨率质谱（UPLC-HRMS）是一种现代分析技术，可以检测植物基质中的次级代谢产物，如生物碱、黄酮类、酚类化合物和萜类 [17, 18]。在之前的研究中，使用液相色谱-质谱（LC–MS）分析了 Ardisia elliptica 的叶片和果实及其生物活性，如抗氧化、抗菌和抗 α-葡萄糖苷酶作用 [19, 20]。然而，尚未对 Ardisia humilis Vahl. 的不同部位进行 UPLC-HRMS 分析。对叶片、茎、果实和花朵等植物部位的化学分析，结合体外和计算机模拟研究，可以为了解其药用特性提供宝贵信息，并指导新型治疗剂的开发。

2 材料与方法
2.1 植物材料
从印度尼西亚 Lampung 的 Sulusuban 收集了 Ardisia humilis Vahl. 的叶片、茎、种子、花朵和幼果（图 1）。将这些植物部位清洗后，在 40°C 的烤箱中干燥，使水分含量低于 10%。
2.2 甲醇提取
将 1 克干燥的植物材料溶解在 85.7 mL 甲醇（Merck，德国）中，然后用超声波提取器（J.P. Selecta，印度尼西亚）提取 1 小时。将所得溶液过滤后，使用 Heidolph 旋转蒸发器（德国）蒸发至获得干燥提取物。
2.3 总酚类化合物含量（TPC）的测定
使用 Folin–Ciocalteu 试剂（Merck，德国）测定提取物中的酚类化合物 [21]。校准曲线由 5 mg/10 mL 的标准溶液（没食子酸，Merck，德国）在甲醇中的浓度范围 15 至 120 mg/L 制备。向孔中加入 20 μL 标准溶液和 100 μL Folin–Ciocalteu 试剂，在室温下避光孵育。然后加入 100 μL 7.5% 碳酸钠（NaCO3，Merck，德国），并在室温下避光再孵育 90 分钟。使用酶联免疫吸附测定仪（ELISA reader，BioTek Synergy HTX，Agilent Technologies，美国）在 750 nm 处测量吸光度。同样方法用于空白（甲醇）和 Ardisia humilis Vahl. 提取物。总酚类化合物含量以每克提取物中的没食子酸当量（mgGAE/g）表示。
2.4 总黄酮类化合物含量（TFC）的测定
使用氯化铝（AlCl3，Sigma-Aldrich，德国）测定提取物中的总黄酮类化合物 [22]。使用槲皮素（5 mg/10 mL，Sigma-Aldrich，德国）在甲醇中制备校准曲线，浓度范围为 15、30、45、60、75、90、120 mg/L，以甲醇作为空白。向孔中加入 50 μL 标准品、样品或空白液，然后加入 10 μL AlCl3 和 10 μL 1 M 醋酸钾（CH3COOK，Merck，德国）。在室温下避光孵育 30 分钟。使用 ELISA reader（BioTek Synergy HTX，Agilent Technologies，美国）在 λ = 425 nm 处测量吸光度。结果以每克提取物中的槲皮素当量（mgQE/g）表示。
2.5 超高效液相色谱-高分辨率质谱（UPLC-HRMS）分析
将 5 mg/mL 的提取物溶解在甲醇溶液中制备样品。分析采用梯度洗脱法，流动相 A 为水（0.1% 甲酸），流动相 B 为乙腈（0.1% 甲酸）。梯度程序如下：0–1 分钟（5% B），1–25 分钟（5–95% B），25–28 分钟（95% B），28–33 分钟（5% B）。使用 Accucore C18 柱（100 × 2.1 mm，1.5 μm；Thermo Scientific），柱温为 30°C，流速为 0.2 mL/min，进样量为 2 μL。分析使用 UHPLC Vanquish 和 Q Exactive Plus Orbitrap HRMS（Thermo Fisher Scientific）。设置如下：喷雾电压 3.8 kV；毛细管温度 350°C；鞘气流量 15 单位；辅助气体流量 3 单位。总离子色谱（TIC）记录在 100–1500 m/z 范围内。数据依赖性采集程序用于进一步的质谱/质谱（MS/MS）分析。
2.6 体外生物活性
2.6.1 DPPH 抗氧化活性的测定
使用稍作修改的 DPPH 方法（Sigma-Aldrich，德国）测定 Ardisia humilis Vahl. 提取物的抗氧化活性 [23]。将样品稀释至 10–70 mg/L 的浓度。使用抗坏血酸（Merck，德国）作为甲醇中的阳性对照（3 至 14 μg/mL）。向每个孔中加入样品或阳性对照（100 μL）和 100 μL DPPH 溶液（0.2 mM）。在室温下避光孵育 30 分钟后，在 517 nm 处读取吸光度（BioTek Synergy HTX，Agilent Technologies，美国）。抗氧化活性以抑制百分比表示，并以 IC50 值表示（抑制 50% DPPH 自由基所需的样品浓度）。
$$\text{抑制百分比}\left(\text{\%}\right)=\hspace{0.33em}\frac{\text{空白吸光度 }-\text{样品吸光度}}{\text{空白吸光度}}$$
2.6.2 细胞毒性测定
使用 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四唑溴化物（MTT）试剂（Sigma-Aldrich，德国）测定 Ardisia humilis Vahl. 提取物对癌细胞增殖的抑制作用 [24]。样品在含有 10% FBS（Sigma-Aldrich，德国）的 Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基中制备，浓度为 100 和 50 μg/mL。MCF-7 细胞以 10 × 10^4 细胞/mL 的密度在 96 孔板中培养，置于 37°C 的培养箱中，含有 5% CO2，培养 24 小时。去除培养基后，加入 100 μL 样品，再孵育 24 小时。然后去除培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS，Sigma-Aldrich，德国）洗涤，向每个孔中加入 100 μL MTT 试剂（0.5 mg/mL），再孵育 4 小时。去除上清液后，加入 200 μL 10% 十二烷基硫酸钠，在黑暗中摇动孵育 10 分钟，然后在 570 nm 处使用 ELISA reader（BioTek Synergy HTX，Agilent Technologies，美国）测量吸光度。未加入样品的培养基作为对照孔。商业药物他莫昔芬和多柔比星用作阳性对照。根据对细胞增殖的抑制作用计算抑制 50% 细胞生长的样品浓度（IC50）。
$$\text{抑制百分比}=(1-[\text{As}/\text{A}0]\text{ x }100)$$
其中 A0 是对照品的吸光度，As 是样品的吸光度。
2.7 分子对接用的配体和蛋白质的制备
从 UPLC-HRMS 分析中鉴定出的化合物作为配体，通过 PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）获取结构，并使用 Biochem Ultrasoftware 版本 18 进行处理。2D结构被转换为Mol2格式的3D结构，并使用相同的软件施加驱动力场以进行能量最小化。目标蛋白质Erα和FASN受体是从蛋白质数据库（https://www.rcsb.org/pdb）[25]中获得的。然后这些蛋白质被加载到Molegro Virtual Docker（MVD）6.0版本中 for further processing。蛋白质制备包括去除水分子和辅因子、计算电荷以及使用Molegro算法添加氢原子。

2.8 Erα和FASN蛋白的分子对接
分子对接是使用MVD 6.0软件进行的。一个重要的初步步骤是通过将参考配体重新对接到目标蛋白质上来验证对接方法。验证方法的坐标是基于参考配体选择的，对于PDB ID: 6CBZ，坐标为x=24.18, y=-2.91, z=7.61，半径为11；对于PDB ID: 4PIV，坐标为x=10.06, y=6.61, z=-33.72，半径也为11。使用了MolDock评分函数，网格分辨率为0.30 ?。应用了MVD的默认参数，包括每次运行最多1500次迭代、种群大小为50，以及使用MolDock SE算法进行10次运行。优化的方向能量阈值确定为100。简单评估进行了最多300次迭代，邻居距离因子为1。验证方法结果显示均方根偏差（RMSD）小于2。验证之后，使用经过验证的坐标将38种Ardisia humilis Vahl的配体进行了对接。最后，研究了配体与目标蛋白质活性位点之间的相互作用，以识别配体相互作用。

2.9 统计分析
使用Past 4.0软件来分析数据[26]。进行了ANOVA比较了提取物的产量、总酚含量（TPC）、总黄酮含量（TFC）、抗氧化活性和抗癌活性。使用p值0.05来表示统计显著性。

3 结果
3.1 提取物的产量
提取物的产量是按照粗提取物的干重相对于Ardisia humilis Vahl样品的干重计算的。表1显示了来自不同部位的Ardisia humilis Vahl提取物的产量。单因素ANOVA显示植物部位对提取物产量有统计学上的显著影响（p值<0.05）。老果实的产量最高，为24.257±0.94%，其次是花（8.552±1.483）、种子（7.47±0.64%）、幼果（7.376±0.675）、茎（4.37±0.33%）和叶（3.85±0.9%）。表1显示了Ardisia humilis Vahl不同部位的提取物产量。

3.2 总酚含量（TPC）
在Ardisia humilis Vahl的不同部位之间观察到了总酚含量的显著差异（p值<0.05）。叶子的TPC最高（155.20 mgGAE/g提取物），其次是花（111.71 mgGAE/g提取物）和茎（104.29 mgGAE/g提取物）。幼果（42.76 mgGAE/g提取物）和老果（42.76 mgGAE/g提取物）的TPC含量较低。最后，种子提取物的TPC值最低（39.60 mgGAE/g提取物）。

图1 Ardisia humilis Vahl的各个部分：a为叶子，b为种子，c为茎，d为果实，e为花
图中的不同字母表示在p值<0.05时具有统计学上的显著差异。

3.3 总黄酮含量（TFC）
Ardisia humilis不同部位的总黄酮含量如图2b所示。在不同植物部位之间观察到了总黄酮含量的显著差异（p值<0.05）。幼果和茎提取物的总黄酮含量最高，分别为47.40 mgQE/g提取物和46.57 mgQE/g提取物。其次是花和种子提取物，分别为30.98 mgQE/g提取物和30.68 mgQE/g提取物。相比之下，叶子和老果提取物的总黄酮含量最低，分别为19.16 mgQE/g提取物和3.40 mgQE/g提取物。

3.4 Ardisia humilis Vahl不同部位的化学组成
图3显示了Ardisia humilis Vahl每个部位的基峰色谱图（BPC）。使用内部和在线数据库（包括ChemSpider和mzCloud）对Ardisia humilis Vahl提取物中的代谢物进行了推测性鉴定。此外，对检测到的化合物进行了第二阶段质谱（MS2）分析，并将其质谱与竞争性碎片化建模（CFM-ID）库中的质谱进行匹配，以提高鉴定准确性。总共在Ardisia humilis Vahl的叶子、种子、茎、花以及老果和幼果提取物中鉴定出了38种化合物，如表2所总结的。观察到植物化学物质的明显部位特异性分布。叶子提取物是最丰富的来源，包含几乎所有化合物类别，包括大量的黄酮类和儿茶素。相比之下，花提取物在黄酮类和酚酸方面表现出更大的化学多样性。而种子提取物中的酚类化合物较少，但皂苷和脂肪酸含量较高。

3.5 抗氧化活性
使用DPPH测定法研究了Ardisia humilis不同部位甲醇提取物的抗氧化活性，以维生素C作为标准参考，如图4a所示。在测试的提取物中，叶子提取物显示出最强的抗氧化活性，IC50值为37.60 μg/mL，其次是茎（53.37 μg/mL）、花（68.93 μg/mL）、幼果（85.93 μg/mL）和种子（96.99 μg/mL）。相比之下，老果提取物的IC50值最低，为171.55 μg/mL。

3.6 Ardisia humilis Vahl甲醇提取物的增殖抑制活性
在200 μg/mL浓度下，对Ardisia humilis Vahl不同部位的评估显示了对MCF-7人类乳腺癌细胞具有明显的抗癌活性（图4b）。值得注意的是，种子提取物表现出最高的癌细胞抑制增殖能力，达到101.738%，超过了花（97.83%）、叶子（92.56%）、果实提取物（83.40%）和茎提取物（67.29%）。

3.7 分子对接和能量亲和力
在对接之前，按照Permatasari等人（2024）[31]描述的程序，通过将天然配体重新对接来进行验证。补充材料（表S1和S2）展示了所有38种化合物的对接分数。针对Erα，化合物4',4-二甲基皮加allocatechingallate表现出最佳的结合亲和力，MolDock得分为-145.667 kcal/mol。其次是epigallocatechin 3-O-(3-O-甲基)gallate、tiliroside、(-)-epiafzelechin 3-O-gallate和ardisiphenol B。这些值显著低于参考配体estradiol（-98.545 kcal/mol）和比较配体4-羟基他莫昔芬（-116.207 kcal/mol），表明其具有更强的结合潜力（表3）。表3显示了Ardisia humilis Vahl 6CBZ蛋白对接得分最高的五种化合物的MolDock得分和氢键相互作用。

3.7 Ardisia humilis Vahl各部分的分子对接和能量亲和力
表4总结了使用MolDock评分对Ardisia humilis Vahl前五种最佳对接化合物与FASN活性位点的结合亲和力评估。在测试的配体中，参考抑制剂GSK2194069表现出最强的结合亲和力，MolDock得分为-177.804 kcal/mol，其次是提取物中鉴定出的黄酮苷tiliroside，得分为-172.372 kcal/mol。阳性对照化合物IPI-9119的MolDock得分为-156.307 kcal/mol，而另一种已知的FASN抑制剂cerulenin的结合力最弱，为-96.196 kcal/mol。提取物中的几种多酚化合物也显示出有利的结合亲和力，包括asinensin A（-146.750 kcal/mol）、4',4-二甲基皮加allocatechingallate（-144.711 kcal/mol）、(-)-catechin gallate（-143.558 kcal/mol）和epigallocatechin gallate（EGCG）（-142.031 kcal/mol）。

4 讨论
本研究首次全面评估了Ardisia humilis Vahl不同部位的植物化学成分、抗氧化活性和抗癌潜力。我们的发现表明，植物各部位的生物活性存在显著差异，这与它们不同的代谢物谱型一致。甲醇提取结合超声辅助提取法从Ardisia humilis Vahl植物中高效提取了广泛的生物活性化合物。这种方法相比传统方法具有显著优势，包括更高的效率、更短的提取时间和更低的溶剂消耗。植物各部位之间代谢物浓度的差异与植物内部植物化学成分的变化一致，这影响了其生物活性[32]。甲醇的极性使其能够提取多种多样的化合物，支持其在植物化学研究中的实用性[33]。在本研究中，Ardisia humilis Vahl的叶子和果实显示出比先前报道的物种（如Ardisia elliptica）更高的总酚含量（TPC）。例如，Chatatikun & Chiabchalard（2017）和Siti-Azima等人（2013）的研究报告Ardisia elliptica的叶子和果实的TPC分别为84 mgGAE/g和41.75 mgGAE/g，而我们的结果显示更高的酚类含量[34, 35]。Al-Abd等人（2017）报告Ardisia elliptica的叶子和果实的总酚含量分别为71 mgGAE/g和37 mgGAE/g[20]。酚类化合物具有一个或多个羟基的芳香环，对植物生长和发育至关重要，因为它们可以保护植物免受紫外线、病原体和生物及非生物胁迫的影响[36]。Ardisia humilis Vahl的TPC也高于泰国Ardisia elliptica叶子的研究结果（分别为18.56 mgQE/g和36.91 mgQE/g[34, 35]。马来西亚的另一项研究观察到Ardisia elliptica果实的TPC高于叶子[20]。另一项研究则得出相反的结果，即果实的TPC高于叶子[20]。另一项研究发现，使用75%乙醇提取Ardisia compressa的果实时，TPC最高，为271.75 mgQE/g[37]。这些结果表明提取方法和植物器官对植物化学产量的具体影响。

UPLC-HRMS分析显示Ardisia humilis Vahl叶子提取物中黄酮类和多酚类化合物占主导地位。这一发现与其他Ardisia属物种的化学谱型一致。例如，Ardisia elliptica的叶子中也报告了类似的黄酮类和酚类丰富的组成[19]，以及其他物种如Ardisia gigantifolia Stapf、Ardisia hanceana Mez和Ardisia crenata Sims[38]。这些化合物的丰富性也扩展到了其他植物部位。Ardisia compressa的果实是黄酮类化合物的主要来源，如槲皮素-3-O-葡萄糖苷和异鼠李素-3-O-鼠李糖苷[39]，而Ardisia japonica的整个植物部分也以黄酮类化合物为主，包括芸香苷、山柰酚3-O-α-L-鼠李糖苷和槲皮素[40]。相比之下，一些部位的特征化合物类别不同，例如在Ardisia crenata的根部发现了22种三萜皂苷[41]。尽管有这些研究，但大多数Ardisia物种的花、茎和种子中的生物活性化合物仍需进一步研究。通过测量提取物在生物系统中清除自由基的能力来评估其抗氧化潜力。抗氧化结果与相关物种的研究结果一致。例如，先前的研究表明Ardisia elliptica的果实和叶子的IC50值分别为45 ppm和95 ppm[20]，而Ardisia solanacea的叶子显示出强烈的AOX活性，IC50值为52.11 μg/mL[42]。同样，Prunus humilis Bunge的研究发现，由于TPC和TFC含量较低，老果实的抗氧化活性较低[43]。本研究中观察到的抗氧化活性与酚类和黄酮类化合物的含量密切相关，这些化合物通过羟基（–OH）的氧化还原性质捐赠电子并中和自由基[44]。我们的研究表明，较高的TPC和TFC水平与较低的IC50值相关，表明更强的抗氧化活性。使用UPLC-HRMS进行的化学分析也支持了这一发现。Ardisia humilis Vahl的每个部分都表现出不同的代谢物谱型，其中叶子提取物含有最多的多酚类和黄酮类化合物。叶子提取物中的黄酮类化合物，如山柰酚、槲皮素和木犀草素，以及多酚类化合物如儿茶素及其衍生物和asinensin A已被广泛报道具有抗氧化潜力[46]。此外，几种黄酮类化合物，包括芸香苷、orientin、槲皮素和山柰酚，也被报道具有抑制乳腺癌细胞的潜力（Mir等人，2023年）。其他物种的研究也表明，由于叶提取物中含有较高的TPC（总多酚）和TFC（总黄酮类化合物）含量，因此具有强烈的抗氧化活性[47, 48]。此外，抗氧化能力的作用不仅体现在体外测试中，研究表明其强大的抗氧化活性可能维持生物系统的稳定性，减轻代谢过程中产生的活性氧（ROS）和活性氮物种（NOS）的有害影响，防止氧化损伤[49]，从而保护细胞完整性[4]，这一机制与糖尿病、心血管疾病、神经系统疾病和癌症等疾病有关[50]。在不同植物提取物中观察到的细胞毒性表明，生物活性代谢物具有器官特异性分布。叶提取物的细胞毒性效应与之前关于Ardisia属植物的文献一致，这归因于多酚介导的抗癌机制[51,52,53]。鉴于对其特性的研究有限，花提取物对癌细胞的适度细胞毒性尤其值得注意。叶提取物和花提取物的生物活性与其植物化学成分密切相关，这一点通过UPLC-HRMS和TPC分析得到了证实。这两种提取物中都富含多酚，已知多酚具有抗癌活性，包括诱导细胞凋亡、抑制肿瘤生长和抗炎作用[54]。在抗癌能力方面，这些化合物具有多种功能，如诱导细胞周期停滞、抑制致癌信号通路、控制细胞增殖和凋亡、调节ROS水平、促进肿瘤抑制蛋白（如p53）的表达，并增加细胞分化为正常细胞的能力[55]。在卤虫实验中，Ardisia humilis的甲醇提取物的致死浓度（LC50）为2.26 μg/mL，而标准长春新碱硫酸盐的LC50为0.81 μg/mL[14]。来自Ardisia属其他物种的支持性发现进一步证实了这一结果。一项研究发现，Ardisia gigantifolia的叶提取物通过抑制细胞增殖和减少癌细胞数量表现出抗癌活性[56]。此外，Ardisia sieboldii的叶子对多种癌细胞系表现出细胞毒性[57]。同时，Ardisia compressa的茎部表现出拓扑异构酶I和II的抑制活性，这是癌症治疗的关键靶点[57]。有趣的是，尽管种子提取物的TPC和TFC含量不高，但其抑制活性最强。这表明非酚类化合物可能在其强大的抗癌效果中起着关键作用。UPLC-HRMS分析显示，种子提取物中含有多种生物活性化合物，包括embelin、ardisiphenol B和cornudentanone。embelin和cornudentanone被报道为强效抗癌化合物，其IC50值分别为1.2 μg/mL和≤4 μg/mL[58, 59]。此外，该研究还发现ardisiphenol B是对FASN（脂肪酸合成酶）有效的五大化合物之一。关于Ardisia属植物的文献，包括Ardisia elliptica，也支持了这一点，这些文献中鉴定出具有抗癌活性的生物活性萜类化合物。这些化合物可以干扰癌症发展的各个阶段，如靶向早期肿瘤形成、诱导细胞周期停滞、抑制癌细胞分化并促进凋亡。值得注意的是，从Ardisia crenata的根中分离出了两种三萜皂苷，ardisiacrispins A和B；它们的组合（2:1）通过诱导细胞凋亡和破坏癌细胞中的微管表现出抗癌活性[60]。此外，特定萜类化合物已被报道可以通过调节关键的细胞内信号通路有效抑制血管生成和转移[61, 62]。这些证据强烈强调了非酚类成分（如embelin和其他萜类化合物）在破坏肿瘤形成、诱导凋亡和防止转移中的重要作用。为了进一步了解作用机制，对与乳腺癌相关的两个关键蛋白靶点Erα和FASN进行了分子对接研究。Erα通过调节活性和促进细胞增殖及肿瘤生长在癌细胞进展中起核心作用，因此抑制Erα是一种关键的治疗策略。相比之下，FASN是癌症治疗的靶点，因为它在许多癌症中过度表达，从而支持肿瘤细胞的生长、存活和侵袭性。首先，在与Erα复合体中，雌二醇通常与Arg 394、His 524、Glu 353和Gly 521相互作用，而4-羟基他莫昔芬则与Leu 387、Met 388和Glu 353形成氢键。这些相互作用与文献中报道的一致，文献显示雌二醇与Glu353、Arg394、Leu391和His524形成氢键，而4-羟基他莫昔芬与Glu 353、Asp351和Met 343相互作用[63]。在叶提取物中发现的表现最佳的化合物4',4-二甲基pigallocatechingallate与关键残基形成氢键，包括Arg 394、His 524、Gly 521、Phe 404和Met 421（图5）。这些相互作用与已知的高亲和力Erα配体的结合特征一致，这些配体通常与Glu353、Arg394和His524侧链形成氢键[64,65,66]。此外，活性位点中的Leu 387在配体与Erα的结合中起着重要作用[67]。另一种表没食子儿茶素衍生物epigallocatechin 3-O-(3-O-methyl)gallate也显示出与关键氨基酸的氢键结合，如表4所总结的。它与Phe404、His524和Gly521形成氢键，其MolDock得分（?143.905 kcal/mol）为第二高。这一发现得到了关于绿茶中主要儿茶素EGCG的先前研究的支持，EGCG显示出强大的抗氧化和抗增殖作用[68]。EGCG已知在乳腺癌中具有多种有益作用，包括抑制细胞增殖、侵袭、凋亡和DNA去甲基化[69]。图5显示了化合物4',4-二甲基pigallocatechingallate与6CBZ蛋白结合位点的分子对接情况，包括对接复合物A、分子表面B、3D图C和2D图D。对于脂肪酸合成酶（FAS，PDB ID：4PIV），叶提取物中发现的tiliroside表现出强烈的结合亲和力，其MolDock得分为?172.372 kcal/mol，与参考配体GSK2194069（?177.804 kcal/mol）相当，且强于阳性对照化合物IPI-9119（?156.307 kcal/mol）和cerulenin（?96.196 kcal/mol）。Tiliroside与Ser2023、Gly2027、Arg1462、Ser2081、Val2080、Ala2062和Gly2061形成氢键（图6）。这些相互作用位点与GSK2194069和IPI-9119观察到的相互作用位点一致，表明它们具有相似的结合机制。一项研究强调，GSK2194069的三唑酮核心与Ser2081形成特定的氢键[70]。其他高得分配体，如asasinensin A、4′,4-二甲基pigallocatechingallate、（?）-catechin gallate和epigallocatechin gallate也与Ser2081形成氢键。这种相互作用支持Ser2081作为高亲和力配体与FASN结合的关键接触点的作用。图6显示了化合物tiliroside与4PIV蛋白结合位点的分子对接情况，包括对接复合物A、分子表面B、3D图C和2D图D。未来的研究需要进一步验证这些发现。下一步的关键研究应集中在通过生物测定法分离和结构表征最活跃的化合物上。通过体外和体内实验严格验证它们的生物活性对于开发来自Ardisia humilis Vahl的化合物作为新型治疗剂至关重要。5 结论总之，本研究表明Ardisia humilis Vahl的不同部分具有独特且显著的生物活性。叶提取物和花提取物表现出最高的抗氧化活性，这与它们高含量的多酚和黄酮类化合物一致。虽然叶提取物和花提取物也对癌细胞表现出高细胞毒性，但种子提取物表现出最显著的抗癌活性，表明非酚类化合物是其毒性的主要驱动因素。从机制上看，分子对接为叶提取物和花提取物中发现的化合物的抗癌潜力提供了有力证据；4',4-二甲基pigallocatechingallate和tiliroside分别表现出对雌激素受体α和脂肪酸合成酶最强的结合亲和力。这些发现表明Ardisia humilis Vahl是一种具有抗癌和抗氧化潜力的有前景的新生物活性化合物来源，可能成为药物开发的宝贵候选物。