《Metabolic Engineering》：Combining Pathway Engineering and Precursor Enrichment to Build a Multi-Trait Soybean Platform for Aquaculture Feed Applications
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作者列表：Hyojin Kim、Truyen Quach、Kiyoul Park、Ming Guo、Hae Jin Kim、Hanh Nguyen、Tam Nguyen、Rebecca E. Cahoon、Shirley Sato、Jonathan A. Napier、Chi Z
作者列表：Hyojin Kim、Truyen Quach、Kiyoul Park、Ming Guo、Hae Jin Kim、Hanh Nguyen、Tam Nguyen、Rebecca E. Cahoon、Shirley Sato、Jonathan A. Napier、Chi Zhang、Tom Elmo Clementec、Edgar B. Cahoon
美国内布拉斯加大学林肯分校植物科学创新中心，内布拉斯加州林肯市
摘要
油料作物为生产富含长链ω-3多不饱和脂肪酸和高价值抗氧化剂的饲料提供了可扩展的平台，但异源途径的代谢通量常常受到前体物质可用性和内源性调控限制的制约。本研究通过引入九种微生物和植物酶（涉及脂肪酸去饱和/延长、酮类类胡萝卜素合成以及维生素E生物合成途径），对大豆种子进行了基因工程改造，使其能够同时产生二十碳五烯酸（EPA）、虾青素和生育三烯酚。转基因大豆中的EPA含量最高可达总脂肪酸的约3.8%，但ω-6中间体的积累量较高，且Δ12和Δ17去饱和酶的表达较弱，表明底物供应可能是主要的代谢瓶颈。这些限制反映了复杂代谢途径工程中的固有权衡，因此我们将该转基因品系与高α-亚麻酸（ALA）含量的大豆进行杂交，以扩大ω-3前体的来源。这一代谢育种策略使EPA含量提高了四倍，同时修复了包括发芽不良和油脂沉积减少在内的多种生理缺陷。杂交后代仍能保持稳定的虾青素（13 μg g?1）和生育三烯酚（1,300 μg g?1）积累水平。代谢、激素和转录组分析表明，碳和香叶基香叶基二磷酸的竞争可能是导致原始品系油脂和ABA含量下降的原因。这些结果表明，扩大前体池可以解决转基因种子中的主要代谢限制问题，并展示了结合合成途径与育种方法来构建多性状油料作物的可行性。
引言
大豆（Glycine max [L.] Merr.）是一种全球重要的作物，用于食品、饲料和工业领域。2024/25年度全球大豆消费量估计为4.19亿吨，预计到2025/26年度将增至4.3亿吨（国际谷物理事会，2025年）。大豆种子含有约40%的蛋白质和20%的油脂，以及异黄酮和生育酚等营养成分（Clemente和Cahoon，2009年；Rahman等人，2023年）。这些特性加上不断增长的全球需求，推动了提高种子产量、质量和代谢组成的努力，以满足食品、饲料和生物产品的需求。
通过育种和生物技术手段，大豆在农艺性能和种子成分方面取得了诸多改进（Liu，1997年；Rahman等人，2023年；Vargas-Almendra等人，2024年）。早期的研究主要集中在抗病虫害、耐非生物胁迫和除草剂抗性等关键性状上（An等人，2018年；Bass等人，2015年；Fuganti-Pagliarini等人，2017年）。最近的研究方向是改良种子营养价值，提高蛋白质和油脂含量，改善氨基酸平衡，并引入高价值代谢产物（Liu等人，2022年；Song等人，2023年；Vargas-Almendra等人，2024年）。生物技术方法已成功使大豆种子积累ω-3多不饱和脂肪酸、酮类类胡萝卜素（如虾青素）和维生素E相关化合物（Arias等人，2022年；Aznar-Moreno等人，2022年；Konda等人，2020年；Li等人，2019年；Park等人，2014年；Schmidt等人，2015年；Singer等人，2021年；Vogel等人，2019年；Zhang等人，2020年）。这些成果表明，大豆作为代谢工程平台，在生成营养增强和具有附加价值的性状方面具有巨大潜力。
在其他油料作物（尤其是 camelina 和 canola）中，长链ω-3多不饱和脂肪酸（LC-PUFA）的工程改造取得了显著进展。在这些物种中，异源去饱和酶和延长酶的引入使得二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）的积累量显著增加（Napier和Betancor，2023年；Petrie等人，2020年；Ruiz-Lopez等人，2014年；Usher等人，2015年）。在camelina中，天然较高的α-亚麻酸（ALA）含量促进了Δ6–Δ5–Δ17途径的顺畅进行；而在canola中，则需要通过共表达Δ12和Δ15去饱和酶来扩大ALA池以实现类似的积累效果。相比之下，大豆油中的ALA含量较低，ω-6代谢途径更为显著，以往的大豆LC-PUFA工程改造由于前体限制和与内源性脂肪酸途径的竞争，导致产物积累量有限（Kinney等人，2008年；Park等人，2017年）。这些代谢差异表明，大豆在ω-3途径重建方面存在更多限制，需要采取措施扩大前体供应或重新平衡代谢途径。这一挑战反映了多途径代谢工程中的普遍问题：有限的前体供应常常限制了引入途径的代谢通量，而扩大前体池是缓解此类瓶颈的有效策略。
基于大豆的成分（通常以SPC形式存在）因其高蛋白质含量和良好的氨基酸组成而被广泛用于水产饲料（Gatlin III等人，2007年）。部分替代鱼粉使用大豆成分可以维持多种养殖鱼类的生长和健康（Herman和Schmidt，2016年；Romano等人，2021年；Voorhees等人，2019年）。然而，传统大豆粉缺乏海洋饲料中的关键营养成分，如EPA、DHA和虾青素，这些成分对鱼类健康、色素形成和氧化稳定性至关重要（Idenyi等人，2022年）。这些化合物通常通过鱼油、藻类生产或化学合成添加到水产饲料中，但这些来源存在可持续性、成本和可扩展性的限制（Glencross等人，2025年；Napier和Betancor，2023年）。此外，传统海洋来源的成分可能存在重金属（如汞和镉）积累的风险，影响饲料质量和食品安全（Gatlin III等人，2007年）。因此，开发替代的、更清洁的LC-PUFA来源（如工程化植物平台）显得尤为重要。富含ω-3 LC-PUFA的饲料在储存、造粒和挤压过程中容易发生氧化，导致EPA和DHA浓度下降，虾青素稳定性降低，进而影响饲料适口性和鱼产品的感官品质。生育三烯酚作为比生育酚更强的亲脂性抗氧化剂，在多不饱和脂质体系中具有很强的保护作用，可提高水产饲料和养殖鱼类的氧化稳定性（Ng等人，2004年；Serbinova等人，1991年）。因此，通过基因工程使大豆同时产生生育三烯酚、EPA和虾青素，为提高饲料和水产产品的营养价值、色素稳定性和保质期提供了综合策略。
章节摘录
温室生产
在由Metromix 300（Sun Gro Horticulture）组成的土壤混合物中播种了Thorne品种的大豆种子，并在温室条件下进行培养，光照周期为14小时/10小时，昼夜温度分别为28～30°C和23～25°C。
田间评估实验
2019年、2020年和2021年，在美国内布拉斯加州Mead的Eastern Nebraska Research, Extension and Education Center（ENREEC；41°08'41.3"N 96°26'14.0"W）进行了T3、T4和T5代转基因品系的田间试验。
构建多性状大豆载体以实现油脂、色素和抗氧化剂的生物合成
大豆种子主要含有C18脂肪酸，其中约50%为亚油酸（LA；18:2Δ9,12）和15%为α-亚麻酸（ALA；18:3Δ9,12,15）。为了实现长链ω-3多不饱和脂肪酸（LC-PUFA）二十碳五烯酸（EPA；20:5Δ5,8,11,14,17）的生物合成，我们从微生物和苔藓中选取了五个编码脂肪酸延长酶（Elo）和去饱和酶（Des）的基因，方法类似于camelina中的EPA工程改造（Usher等人，2015年）（图1）。
通过前体富集克服代谢瓶颈
在油料作物中工程化ω-3 LC-PUFA的主要挑战之一是克服限制代谢通量的瓶颈（Clemente和Cahoon，2009年）。在我们的转基因大豆品系pPTN1331中，尽管相关基因稳定表达并遗传了多个生长季，但EPA的积累量仅约为总脂肪酸的3.8%，这表明内源性前体供应不足。
作者贡献声明
Ming Guo：撰写 – 审稿与编辑、研究。Hae Jin Kim：撰写 – 审稿与编辑、方法学、研究、数据分析、概念化。Edgar Cahoon：撰写 – 初稿撰写、监督、项目管理、方法学、研究、资金获取、数据分析、概念化。Truyen Quach：撰写 – 审稿与编辑、方法学、研究、数据分析。Kiyoul Park：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法学。
数据可用性
转录组数据已存入NCBI Gene Expression Omnibus（GEO），访问号为GSE313681。
致谢
我们感谢内布拉斯加大学林肯分校植物生物技术田间设施（位于内布拉斯加州Mead的Eastern Nebraska Research, Extension and Education Center）的Pat Tenopir及其团队对转基因大豆品系的田间维护工作。同时感谢Samantha Link及其团队对温室环境的维护。本研究得到了内布拉斯加大豆委员会、TEC、EBC以及美国农业部国家食品与农业研究所的资助。
