超临界流体萃取法用于多种生物活性成分的提取：一种可持续的橄榄树修剪残渣增值方法

《Talanta》：Supercritical fluid extraction method for multi class bioactives: a sustainable approach to Olea europaea pruning residue valorization

　　乔万娜·卡费奥（Giovanna Cafeo）、玛丽娜·鲁索（Marina Russo）、亚历乌西亚·阿雷纳（Alessia Arena）、马里奥西莫内·佐卡利（Mariosimone Zoccali）、路易吉·蒙德洛（Luigi Mondello）、保罗娅·杜戈（Paola Dugo）
墨西拿理工大学
墨西拿大学化学、生物、药物与环境科学系
G. 帕拉图奇大道13号（Viale G. Palatucci 13），98168，墨西拿，意大利

**摘要**
橄榄修剪残渣是生物活性化合物的一个有前景的来源。本研究首次提出了一种单步超临界流体提取（SFE）方法，用于同时从欧橄榄（Olea europaea）的叶子和枝条中回收酚类、类胡萝卜素和生育酚。使用生物乙醇改性的二氧化碳（CO2），优化后的方法回收率分别为：欧勒uropein 76%、α-生育酚 84%、叶黄素 88% 和 β-胡萝卜素 90%。与超声波辅助提取（UAE）相比，SFE虽然获得的绝对量较低，但保持了高的回收效率，并在自动化、溶剂安全性和可持续性方面具有优势。高效液相色谱-光二极管阵列质谱（HPLC-PDA/MS）和荧光检测器（FLD）分析证实，叶子中的生物活性成分比枝条更丰富，其中欧勒uropein 是主要的酚类化合物。绿色评估（AGREEprep）结果显示，SFE 的得分（0.44）高于 UAE（0.15）。这些结果证明了 SFE 是一种可扩展且环境可持续的方法，可以将橄榄修剪残渣转化为功能性食品成分，支持循环经济模式。

**1. 引言**
从食品工业副产品中提取生物活性化合物以及开发具有健康促进作用的功能性食品是食品化学领域的两大主要趋势。此外，人们特别关注开发环保的分析技术，以鉴定和表征这些生物活性化合物 [1]。生物活性分子属于不同的化学家族，每种家族具有独特的结构和性质，这些特性使它们对人体健康产生广泛益处 [2]。由于它们的结构多样性，需要采用多种分析策略来提取和分析这些化合物。这些方法中的一个共同点是选择适当的提取方法，通常需要根据特定的分子类别选择合适的溶剂。对于分析目的而言，液相色谱（LC） generally 被认为是最合适的技术 [3]。

一个特别重要的研究领域是多组分提取方法的发展，这些方法能够使用环境可持续的技术和食品废弃物材料同时回收不同化学类别的生物活性化合物 [4] [5] [6] [7] [8]。橄榄树（Olea europaea）的修剪残渣，包括叶子和枝条，已成为酚类、生育酚和类胡萝卜素等有价值的生物活性化合物的有前景的来源 [4] [5] [6] [7] [8]。这些植物残渣通常被丢弃或用于能源生产，但现在人们正在重新评估它们在循环经济模型中提高生物质经济价值的潜力。

许多研究论文探讨了橄榄叶中酚类的测定方法。最常用的技术包括固液提取 [4, [9] [10] [11] [12] 和超声波辅助提取 [8, 14, 15]。此外，还有一些研究人员使用了索氏提取法 [16, 17]、微波辅助提取 [18] 或深度共晶溶剂与微波的组合 [19] [20] [21]。虽然在一些情况下，超临界流体提取（SFE）在酚类化合物的提取效果上略低于其他方法 [25] [26] [27]，但它在脂肪酸和萜烯的提取方面表现出了很高的效率 [27] [28] [29]。有些作者对橄榄叶进行了固液多组分提取，例如 Olmo-Garcia 及其同事提出了一种利用超声波辅助提取法提取生育酚和酚类的方法 [5]。固液提取也被用于测定橄榄叶中的总酚类和类胡萝卜素含量 [4, 30, 31]。据作者所知，之前发表的研究中尚未有研究专注于同时提取类胡萝卜素、生育酚和酚类，并通过色谱分析对其进行表征以定量每种单一分子。本研究首次针对欧橄榄叶和枝条中的三类生物活性分子（生育酚、类胡萝卜素和酚类，它们具有不同的辛醇-水分配系数 log kow）优化了一个单一的 SFE 工艺。为了实现这一目标，通过添加可持续改性强化剂来略微改变二氧化碳（CO2）的极性。目标是开发一种在提取时间、样品处理量、自动化程度、材料可持续性和操作安全性方面都具有优势的方法。为了研究提取效率和实际的时间及安全节省情况，最初使用三种不同的经过验证的 UAE 工艺（每种工艺对我们的目标分子类别具有更高的选择性）[5, 9, 17, 32, 33] 对相同样品进行了提取。随后，利用获得的结果作为起点来优化多组分 SFE 工艺。

提取物随后使用高效液相色谱（HPLC）结合不同的检测器进行分析，具体取决于所研究的生物活性化合物类别。生育酚的表征使用荧光检测器（FLD）进行；类胡萝卜素和酚类的测定则分别使用光电二极管阵列检测器（PDA）与单四极杆质谱仪（MS）结合，质谱仪配备了大气压化学离子化（APCI）和电喷雾离子化（ESI）接口。

从实际应用的角度来看，本文提出的 SFE 方法为潜在应用提供了一个概念验证，其中自动化、安全性和环境可持续性正成为关键优先考虑因素。预计扩大生产规模将提高回收效率，同时保持 SFE 的固有优势，使其成为在可持续食品生产模式下利用橄榄修剪残渣的有前途的方法。

**2. 材料与方法**
2.1. 化学试剂
二氧化碳（CO2）4.8 级由 AIR LIQUIDE（意大利米兰）提供。
本研究中使用的所有标准品、溶剂和试剂均购自 Merck KGaA（德国达姆施塔特）。
水（H2O）、乙腈（ACN）、甲醇（MeOH）（UHPLC-MS 级，纯度 ≥99.9%）、丙酮（Ace）、异丙醇（IPA）、己烷（Hex）、生物乙醇（bio-EtOH）、甲基叔丁基醚（MTBE）、二氯甲烷（DCM）（HPLC 专用梯度级，纯度 ≥99.9%）和甲酸均用于提取和色谱分析。

用于定量酚类化合物、类胡萝卜素和维生素 E 的标准化合物包括：没食子酸、羟基酪醇、野玫瑰果苷、柳叶苷、芹菜素、欧勒uropein、叶黄素、反式 β-胡萝卜素、α-生育酚。

2.2. 样品与样品预处理
2025年2月，在意大利墨西拿收集了 Ogliarola 品种的欧橄榄（Olea europaea）叶子和枝条。从五棵橄榄树的四个方向随机采集植物材料。收获后，手动分离叶子和枝条，用蒸馏水清洗以去除污垢或昆虫，并在室温下干燥至恒重（约15天）。测定水分损失约为40%。之后，将干燥后的样品用实验室研磨机研磨并过筛，得到粒径小于0.3毫米的粉末。粉末在-20°C下避光保存于密封袋中，直至进一步使用。

2.3. 生物活性化合物的超声波辅助提取（UAE）
酚类化合物、类胡萝卜素和维生素 E 采用三种不同的 UAE 工艺提取，这些工艺基于先前发表的文献并稍作修改 [5, 9, 17, 32, 33]。表1列出了所使用的三种 UAE 工艺的详细信息。所有提取方法均重复进行至溶剂耗尽（酚类四次，类胡萝卜素和维生素 E 三次）。

**表1. 生物活性化合物提取的 UAE 条件**
| 生物活性化合物 | 样品量（g） | 溶剂 | UAE 条件 | 离心速度（rpm） | 时间（分钟） | 温度（°C） | 时间（分钟） | 时间（分钟） | 离心速度（rpm） |
|------------|---------|---------|-------------|------------|-----------|-----------|-------------|------------|在本研究中，首先采用阿联酋（UAE）的程序结合液相色谱技术（HPLC-PDA-MS用于酚类和类胡萝卜素，HPLC-FLD用于维生素E）对植物材料进行了酚类、类胡萝卜素和维生素E的含量分析。关于橄榄修剪废弃物的大量文献数据被用作从这些材料中提取生物活性化合物的起点。由于所研究的三种分子极性不同，因此使用了多种溶剂进行提取。具体来说，分别使用bio-EtOH/H2O（8:2，v/v）、Ace/MeOH（1:1，v/v）和Hex来提取酚类、类胡萝卜素和维生素E[5,9,17,32,33]。所有化合物的提取过程均在25°C下进行10分钟。选择常温和黑暗条件以避免类胡萝卜素的降解。尽管如此，提取过程重复进行直至完全提取：酚类化合物提取四次，类胡萝卜素和维生素E提取三次。此外，酚类和维生素E的提取物直接注入LC系统，而类胡萝卜素的提取物在氮气流动下干燥后溶解在MeOH/MTBE（1:1，v/v）中进行分析。

3.1.1 色谱方法验证
针对三种提取物，采用了三种不同的液相色谱方法进行分析。酚类分析采用了HPLC-PDA-ESI/MS方法[32]。MS用于识别生物活性化合物，而PDA用于定量分析。在bio-EtOH中为可测量的酚类化合物（如没食子酸、羟基酪氨酸、紫草素、木犀草素、芹菜素和橄榄苦苷）构建了校准曲线，线性范围为0.5至100 mg L?1。方法验证结果总结在表S1中。首先从校准范围内的线性考虑进行了方法验证。所有目标分析物的决定系数（R2）均高于0.9996。其中，紫草素的LoD（最低检测限）和LoQ（最低定量限）值分别为0.023 mg L?1和0.007 mg L?1。羟基酪氨酸的LoD和LoQ值最高，分别为0.112 mg L?1和0.034 mg L?1。日内和日间重复性实验结果（见表S1）表明样品在三种浓度水平（0.5、10和100 mg L?1）下的稳定性良好。准确度值分别在0.5 mg L?1时为86.8%至116.2%，在10 mg L?1时为95.5%至101.9%，在100 mg L?1时为99.0%至100.6%。

3.1.2 UAE提取物中生物活性化合物的表征
橄榄叶和枝条显示出相同的植物化学成分。从定量角度来看，叶子是生物活性化合物最丰富的来源，其中鉴定出的酚类化合物含量为109586.2 ± 239.7 mg kg?1，色素（类胡萝卜素和叶绿素）含量分别为2326.2 ± 29.1 mg kg?1和224.9 ± 7.6 mg kg?1。图1显示了通过UAE方法从橄榄叶中提取的酚类化合物（A）、类胡萝卜素（B）和维生素E（C）的色谱图。橄榄叶和枝条的定量结果报告在表4中。

图1. 通过UAE（A, B, C）和SFE（D, E, F）方法获得的橄榄叶提取物的HPLC-PDA和HPLC-FLD色谱图。酚类化合物（A, D）和类胡萝卜素（B, E）的HPLC-PDA色谱图分别在280 nm和450 nm处检测；维生素E（C, F）的HPLC-FLD色谱图在333 nm处检测。峰的鉴定见表4。

表4. 橄榄叶和枝条的UAE和SFE提取物中酚类、类胡萝卜素、叶绿素和维生素E的浓度（mg kg?1 ± 标准偏差）。

3.3.2 生物活性化合物的表征
橄榄叶和枝条显示出相同的植物化学成分。从定量角度来看，叶子在生物活性化合物方面是较丰富的来源，其中鉴定出的酚类化合物含量为109586.2 ± 239.7 mg kg?1，色素（类胡萝卜素和叶绿素）含量分别为2326.2 ± 29.1 mg kg?1和224.9 ± 7.6 mg kg?1。图1展示了通过UAE方法从橄榄叶中提取的酚类化合物（A）、类胡萝卜素（B）和维生素E（C）的色谱图。橄榄叶和枝条的定量结果报告在表4中。

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3.3.3 UAE提取物中生物活性化合物的表征
橄榄叶和枝条显示出相同的植物化学成分。从定量角度来看，叶子是生物活性化合物最丰富的来源，其中鉴定出的酚类化合物含量为109586.2 ± 239.7 mg kg?1，色素（类胡萝卜素和叶绿素）含量分别为2326.2 ± 29.1 mg kg?1和224.9 ± 7.6 mg kg?1。表4报告了橄榄叶和枝条的定量结果。定性和定量结果
阿联酋（UAE）和超临界流体萃取（SFE）提取物的定性和定量结果分别展示在图1和表4中。如图1中的色谱图所示，定性分析表明SFE提取物和UAE提取物中存在相同的分子。然而，所有目标化合物在SFE提取物中的含量略有下降，这与报告的回收数据一致。在所研究的植物化学物质中，酚类化合物在两种提取物中占主导地位。特别是，橄榄苦苷（oleuropein）占总植物化学物质含量的大约70-80%，在UAE和SFE叶提取物中的含量分别为85358.5 ± 59.2 mg kg?1和64518.9 ± 25.6 mg kg?1，在UAE和SFE枝提取物中的含量分别为45075.7 ± 31.2 mg kg?1和31102.2 ± 31.5 mg kg?1。这种在橄榄中广泛存在的化合物已被证明具有多种生物活性，包括抗氧化、抗菌和抗炎作用[37,43,44]。此外，还鉴定出从橄榄苦苷衍生出的倍半萜类化合物，如羟基橄榄苦苷（hydroxyoleuropein）、橄榄苦苷葡萄糖苷（oleuropein glucoside）和橄榄苷（oleoside）。在橄榄叶和枝中检测到的另一类重要酚类化合物是酪氨酸衍生物（tyrosol derivatives）。其中，羟基酪氨酸（hydroxytyrosol）仅存在于叶提取物中（UAE和SFE提取物中的含量分别为812.5 ± 7.6 mg kg?1和534.7 ± 7.3 mg kg?1），而其葡萄糖苷形式在叶和枝提取物中的含量都较高。实际上，酚类化合物的糖苷形式在橄榄组织中通常比在油中更为丰富，因为它们在提取过程中会被水解[5]。考虑到欧洲食品安全局（EFSA）建议每日从橄榄（果实、榨油废水、橄榄油Olea europaea L.提取物和叶子）中摄入200毫克的多酚，其中包含2-15毫克的羟基酪氨酸或橄榄苦苷复合物[45]，因此叶和枝是提取这些化合物的有趣来源。分析显示，仅1克干燥的Ogliarola品种叶子就含有大约90毫克的羟基酪氨酸和橄榄苦苷衍生物，而1克干燥的枝含有约50毫克。除了这些化合物外，还检测到了其他倍半萜类化合物（如lucidumoside C、verbascoside）和酚酸（如gallic acid）。尽管倍半萜类化合物作为橄榄油及其生产链副产品的主要生物活性成分受到了广泛关注，但黄酮类化合物的量也相当可观。根据文献资料[27,46]，黄酮苷类（如apigenin和luteolin）是主要的黄酮类化合物。此外，taxifolin仅在枝提取物中被检测到（UAE和SFE提取物中的含量分别为994.1 ± 14.6 mg kg?1和715.7 ± 12.9 mg kg?1）。已有研究表明，橄榄叶和枝中的黄酮类化合物可以显著提高提取物的总抗氧化潜力[38]。因此，虽然羟基酪氨酸和橄榄苦苷被确定为这些基质中的主要生物活性物质，但也需要认识到存在的黄酮类化合物的重要性和影响。在这方面，据报道橄榄叶和枝提取物的抗氧化活性受到其中所有酚类化合物的协同促进[47]。尽管枝提取物在酚类化合物方面含量较低，但其中也含有相当数量的香豆素（coumarins）。与其他作者的先前描述一致，阿魏酸苷（aesculin）和阿魏酸脂（aesculetin）仅在枝提取物中被定量[5,48]。定量结果表明，由于酚类化合物的极性较高，SFE方法对它们的回收效率较低。众所周知，向超临界CO2中添加改性剂可以提高酚类化合物的提取效率，这一过程依赖于溶剂极性的增加[41]。尽管如此，本研究提出的SFE方法旨在提取非极性分子，如类胡萝卜素和维生素E。通过结合不同比例的改性剂进行动态提取，色素和维生素E的回收率达到了84%至90%。对类胡萝卜素和叶绿素的全面分析显示，橄榄叶是色素的重要来源（UAE和SFE提取物中的含量分别为2326.2 ± 29.1 mg kg?1和1934.5 ± 35.3 mg kg?1）。关于叶绿素，基于β-胡萝卜素校准曲线鉴定并量化了两种形式的叶绿素a和b。这两种叶绿素在化学结构和生物活性方面都有所不同。叶绿素a在光合作用过程中起关键作用，而叶绿素b则是一种增强光吸收和能量转换的辅助色素[49]。除了在光合作用中的作用外，这些色素在食品工业中也作为食品添加剂和着色剂受到高度重视[27]。显然，叶中的叶绿素a和b含量高于枝。类胡萝卜素也表现出类似的趋势。通过UV-Vis和MS光谱的评估，总共鉴定出六种类胡萝卜素化合物。根据文献资料[27,50]，在UAE和SFE叶和枝提取物中最丰富的化合物是叶黄素（lutein）。此外，还鉴定出三种β-胡萝卜素异构体（trans、9-cis和15/13-cis）以及两种黄质（neoxanthin和zeaxanthin）。类胡萝卜素对健康的重要作用已有充分记载[51]；因此，橄榄叶可以被认为是回收这些分子的宝贵来源。最后，关于维生素E，叶和枝中的维生素E种类和分布有所不同。根据文献资料[5]，在UAE和SFE橄榄叶提取物中鉴定出四种维生素E：α-生育酚（α-tocopherol）、β-生育酚（β-tocopherol）和γ-生育酚（γ-tocopherol）以及α-生育三烯酚（α-tocotrienol）。叶中的维生素E总含量中α-生育酚占89%，其次为α-生育三烯酚（7%），β-生育酚和γ-生育酚（4%）。而在枝中，维生素E的总含量明显低于叶（UAE提取物中为54.5 ± 3.5 mg kg?1，SFE提取物中为50.5 ± 3.3 mg kg?1）。此外，仅在枝中检测到α-生育酚和α-生育三烯酚。最丰富的维生素E种类是α-生育三烯酚，占总维生素E含量的73%。显然，橄榄叶和枝是生物活性化合物的重要储存库，这些化合物因其潜在的健康益处而受到广泛关注。系统地回收和利用这些植物材料不仅为进一步的科学研究提供了有希望的途径，也为医药、营养保健品和功能性食品等领域的应用带来了重大机会。尽管SFE的提取效率略低于UAE，但考虑到一次提取可以同时获得多种生物活性成分，这种差异并不显著。虽然UAE通过使用特定类别的溶剂和程序来最大化回收率，但这一过程耗时且依赖于危险且不可再生的溶剂。相比之下，尽管需要高压设备，SFE在经济和操作上具有优势，适合在可持续循环经济环境中使用。此外，使用回收的CO2作为主要溶剂可以降低购买和处置成本，减少下游纯化步骤，通过自动化降低劳动力 demand，缩短整体处理时间，并实现优化的闭环CO2回收系统。从实际角度来看，所提出的SFE方法应被视为未来工业应用的概念验证，其中过程自动化、安全性和环境合规性越来越受到重视。在更大规模上的优化将进一步提高回收率，同时保持SFE的固有优势，使其成为在可持续食品生产框架内利用橄榄修剪残余物的有前景的技术。

3.3.2. 环境评估
为了评估所开发的SFE方法及其在本研究第一步中使用的三种UAE方法的环保性，采用了AGREEprep分析评估工具[52]。如图3所示，所提出的多组分SFE方法（图3B）被证明比UAE更具环保性，总得分为0.44，而UAE的得分为0.15。这一得分的主要贡献因素是原则2（危险材料）、原则3（可持续性）、原则5（样品的规模经济性）、原则7（自动化）和原则10（操作员安全）。实际上，SFE仅使用了可持续的材料，如CO2和生物乙醇（bio-EtOH），而UAE则需要危险且不可再生的溶剂，包括甲醇（MeOH）和MTBE（原则2和3）。此外，SFE过程是半自动的（原则7），系统的离线特性减少了潜在的样品污染并确保了操作员的安全（原则10）。

另一方面，单次SFE程序大约需要40分钟，而三种单独的UAE技术则分别需要约3小时。这反映在SFE方法的吞吐量增加（原则6）和能耗降低（原则8）上。SFE过程中使用的总溶剂量为44毫升（包括系统清洗），而三种UAE程序仅使用了10毫升溶剂。需要注意的是，完全自动化的SFE减少了操作员接触溶剂的机会。然而，SFE仪器的能耗仍然很高（每次分析约1300瓦），且吞吐量不足以获得积极的评价。此外，考虑到补充泵和系统清洗，生物乙醇的高消耗也是一个需要改进的方面（原则4）。

4. 结论
本研究展示了通过SFE方法实现橄榄修剪残余物增值的分析可行性，该方法能够在单次全自动提取步骤中同时回收酚类、类胡萝卜素和维生素E。所提出的SFE方法使用CO2和生物乙醇作为可持续溶剂，为所有目标分析物提供了满意的回收率（76–90%），证实了其适用于从复杂植物基质中进行多组分提取。与传统UAE技术相比，SFE提高了自动化程度、样品吞吐量、材料可持续性和操作员安全性。然而，某些酚类化合物的回收率略低。总体而言，所提出的方法是一种稳健且更环保的多目标植物化学物质提取替代方案，前提是根据具体应用情境仔细评估回收性能与可持续性优势之间的平衡。其应用可以支持在循环经济框架内开发功能性成分和天然添加剂，用于食品、药品和化妆品行业。然而，为了进一步验证SFE的大规模实施，可能需要进行额外的技术和经济评估以及生命周期评估。为了进一步提高工艺的环境可持续性，未来的工作将集中在开发一种能够一次性分析所有选定植物化学物质的色谱方法上。此外，还将探索将提取、分离和检测集成到自动化在线系统中，并评估使用水作为改性剂的可能性，以进一步降低方法的环保性。

【作者贡献声明】
Giovanna Cafeo：撰写——原始草稿、验证、软件开发、方法论设计、调查、形式分析、数据管理。
Marina Russo：撰写——原始草稿、可视化、监督、项目管理、方法论设计、资金获取、概念构思。
Alessia Arena：软件开发、方法论设计、调查、形式分析。
Mariosimone Zoccali：撰写——审稿与编辑、监督、方法论设计、概念构思。
Luigi Mondello：监督、资源协调。
Paola Dugo：撰写——审稿与编辑、监督、资源协调。