《Chemical Engineering Journal》：Isolation-to-delivery hydrogel enables efficient isolation and sustained release of exosomes to enhance wound healing
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杨丽华|黄晨龙|沈明伟|徐晨宇|郭宗林|胡安·加洛|郭美今|阿里·莫辛中国华东科学技术大学生物反应器工程国家重点实验室，上海，200237摘要促进伤口快速愈合对于预防瘢痕增生至关重要。基于外泌体的疗法在改善愈合效果方面显示出巨大潜力，但它们面临诸多挑战：1）外泌体的分离需要复杂、
杨丽华|黄晨龙|沈明伟|徐晨宇|郭宗林|胡安·加洛|郭美今|阿里·莫辛
中国华东科学技术大学生物反应器工程国家重点实验室，上海，200237
摘要
促进伤口快速愈合对于预防瘢痕增生至关重要。基于外泌体的疗法在改善愈合效果方面显示出巨大潜力，但它们面临诸多挑战：1）外泌体的分离需要复杂、耗时且成本较高的程序；2）由于外泌体脂质双层的pH值和温度敏感性，其稳定性有限。水凝胶因其亲水性和多孔结构而成为一种有吸引力的解决方案，既能将外泌体与高分子杂质分离，又能防止其降解。在这项研究中，我们设计了一种双层多糖水凝胶，其中普鲁兰（PL）和钙离子（Ca）构成内核，而海藻酸钠（SA）在含有外泌体的前体溶液中形成有效的隔离层。通过结合冷冻干燥和超声辅助溶解技术，该方法有效实现了外泌体的分离和可控释放。结果显示，PL?+?Ca?+?SA水凝胶的凝胶稳定性优于其他配方。在分离过程中，PL?+?Ca?+?SA水凝胶高效地富集了外泌体，同时保持了其特有的“茶杯形”形态和蛋白质标记。分离产率（87.2%）与超速离心法相当，且颗粒数量和杂质含量无显著差异。此外，超声辅助溶解技术使得外泌体释放可持续至少7天，符合Higuchi扩散模型的预测。功能上，EXO@PL?+?Ca?+?SA水凝胶提高了成纤维细胞的增殖和存活率（长达一周），降低了ROS含量（降低92%），并将小鼠伤口模型中的COL-I/COL-III比率调整为0.58。进一步的全转录组分析显示相关通路发生了显著变化。总体而言，这种双层水凝胶为外泌体的分离和可控输送提供了集成平台，为后续转化研究提供了初步实验依据。
引言
伤口的快速愈合是一个亟需关注的临床问题[1]。愈合不足可能导致各种皮肤并发症，如瘢痕增生，这会严重影响患者的生理和心理健康[2]。外泌体作为一种成熟的治疗手段，已被广泛应用于急性和慢性伤口护理[3]。外泌体是直径在40至160纳米之间的细胞外囊泡，包含核酸、蛋白质、脂质和miRNA等多种生物活性成分[4]。这些细胞外囊泡在细胞间通讯、免疫调节、组织修复和再生中发挥重要作用，并被提议用于疾病诊断和检测等场景[5]。此外，外泌体在促进伤口愈合期间的血管再生和胶原形成方面特别有益[6]。外泌体可来源于多种组织和器官，以及动物和植物细胞[7]。然而，其实际应用常常受分离和输送方法的限制。
尽管超速离心被认为是外泌体分离的金标准方法，但由于处理时间长、设备昂贵且提取效率低，不利于工业规模应用[8]。其他技术如PEG沉淀、超滤、体积排阻色谱或免疫亲和捕获同样因分离效率低而不适合大规模生产[9]。因此，当前的外泌体分离技术存在固有的局限性，且不符合外泌体储存和保存的标准化标准。分离后的外泌体通常需在-80°C下冷冻保存；然而，极端温度可能破坏脂质双层膜，导致封装的生物活性化合物过早降解，从而影响其后续输送的生物活性[10]。因此，探索有效的外泌体分离方法及其在储存和输送过程中的稳定性增强方法是科学研究的重点。
水凝胶是由亲水高分子链交联形成的三维网络材料[11][12]。生产水凝胶的主要原料是天然来源的蛋白质和多糖。其中，天然多糖因其优异的塑性和生物安全性而更受欢迎，尤其是在不同温度和pH条件下相比蛋白质具有更低的降解率[13]。多糖可通过分子间力形成物理交联，或通过化学交联剂共价结合形成水凝胶[14]。虽然化学交联的稳定性更高[15]，但其键合和动态平衡重建速度较慢，不适合捕获活性分子。因此，由天然多糖和金属离子构成的物理交联水凝胶成为研究热点。例如，使用海藻酸钠（SA）/羧甲基壳聚糖/明胶制备水凝胶，并通过钙离子（Ca）作为交联剂装载纳林根宁，在治疗胃病方面取得了显著效果[16]。此外，陈等人（2024年）使用SA和Ca制备了用于去除废水中有害金属离子的复合水凝胶微球[17]。尽管SA:Ca水凝胶在化合物分离方面表现优异，但由于其“蛋盒”状空心结构，对水分子的保留率较高，不适合捕获外泌体。普鲁兰（PL）是一种中性、可生物降解、无毒、无免疫原性的非离子多糖，其主链结构具有独特的连接方式，具有优异的机械性能和非常高的生物膜粘附力[18]。先前的研究表明，尽管PL中的醚O基团可以与金属离子形成离子键，甲基基团和其他分子结构也能形成键，但其整体结构相对不稳定，容易受环境影响而降解[19]。因此，通常需要与其他化合物结合使用以增强水凝胶的稳定性[20]。因此，迫切需要开发以PL?+?Ca为核心成分，结合SA的双层网格状水凝胶，以实现外泌体的同时分离和输送。
此外，先前的研究指出，冷冻干燥过程中冰晶的升华可能导致水凝胶塌陷和收缩，降低交联的均匀性[21]。虽然复水可使水凝胶恢复到双层网格结构，但这可能影响被捕获外泌体的输送和应用。提出超声辅助溶解作为一种可行的解决方案来缓解这一问题。在特定频率和强度下的超声刺激会产生空化效应，造成局部高温和高压，同时产生强剪切力[22]。这些机械力可能破坏SA和Ca之间的协调键，降低PL?+?Ca?+?SA的凝胶形成能力。主要包含PL?+?Ca的稳定水凝胶的形成有望提高外泌体的输送效率和水的吸收性。
在这项研究中，我们介绍了一种多功能水凝胶，它能够同时分离、稳定并可控地释放外泌体（图1），显著促进伤口愈合，为基于外泌体的生物材料生产提供了变革性策略。以小鼠急性伤口为模型，讨论了EXO@PL?+?Ca?+?SA水凝胶的治疗效果。这是首次使用这种多功能普鲁兰/海藻酸钠水凝胶系统进行外泌体的分离、稳定和可控释放。总之，该研究通过设计新型水凝胶结构，为外泌体的工业生产和应用提供了创新策略。
节片段
材料
普鲁兰（CAS. 9057-02-7，粘度：124 Pa·s，分子量：1.6 × 10^5 Da）、海藻酸钠（CAS.9005-38-3，粘度：969 Pa·s，M/G比：1.6/2.0，分子量：3.0 × 10^5 Da）和氯化钠均购自中国河南高宝工业有限公司。高葡萄糖培养基（DMEM）和α-MEM基础培养基购自中国苏州幽翼生物科技有限公司。血清购自中国苏州绿赛生物科技有限公司。无血清培养基来自
PL?+?Ca?+?SA水凝胶的特性
对PL?+?Ca?+?SA水凝胶进行了全面表征，以了解其性能。PL?+?Ca?+?SA水凝胶和SA?+?Ca水凝胶呈白色块状，肉眼可见（图2A），而其他组则没有这种宏观特征。这些差异归因于海藻酸钠（SA）和钙离子（Ca）能够形成三维交联网络结构，从而赋予材料机械/结构强度[35]。
结论
本研究制备了一种多功能普鲁兰/海藻酸钠水凝胶，用于外泌体的分离、稳定和有效输送。此外，还考察了该水凝胶包裹的外泌体对小鼠模型伤口愈合的影响。PL?+?Ca?+?SA水凝胶在细胞培养基中有效保持了外泌体，分离后的外泌体数量与超速离心法的结果无显著差异。
CRediT作者贡献声明
杨丽华：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，实验研究，数据分析。黄晨龙：数据可视化，实验研究。沈明伟：数据可视化，数据分析。徐晨宇：撰写——审阅与编辑，数据可视化，实验研究。郭宗林：实验研究，数据分析。胡安·加洛：撰写——审阅与编辑，数据可视化。郭美今：撰写——审阅与编辑，监督，资金申请。阿里·莫辛：撰写——审阅与
写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
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资助
本工作得到了中国国家外国专家计划（项目编号：Y20240198）、国家自然科学基金（项目编号：22250410275）以及广东省基础与应用基础研究基金（项目编号：2024A1515010433）的财政支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的利益冲突或个人关系。
致谢
本工作得到了上海叶森生物科技有限公司的支持。同时，VDO Biotech（苏州）有限公司提供了Nano-flow细胞仪的帮助。
