炔基硝基标签技术实现了金纳米颗粒稳定且高效的蛋白质功能化

《ACS Applied Materials & Interfaces》：Alkyne Nitro Tag Enables Stable and Efficient Protein Functionalization of Gold Nanoparticles

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表面配体在制备稳定的共价结合的纳米粒子-蛋白质偶联物中起着关键作用。然而，大表面配体通常会引入空间位阻和抗污染效应，从而降低蛋白质偶联的产率，而小配体在激活过程中则容易引起纳米粒子聚集。在这里，我们介绍了一种名为 Alkyne Nitro Tag (ANT) 的紧凑型杂双功能配体，它代表了纳米粒子表面化学的设计原理。ANT 具有一个预先安装的反应性硝基苯酯，在温和的水性条件下可以与蛋白质残基发生亲核酰基取代反应，同时其硝基取代基通过静电排斥作用赋予 AuNPs 悬浮稳定性。在 ANT 中，末端炔基对于与 AuNP 表面的牢固连接至关重要，因为硫醇基团与该反应性酯不相容。通过侧向流动测定、Western 印迹、酶促传感和免疫沉淀实验，证明了 ANT-Capped AuNPs (Au@ANT) 与链霉亲和素 (SA)、辣根过氧化物酶 (HRP) 和免疫球蛋白 G (IgG) 的稳健偶联。与传统的物理吸附和 EDC/NHS 化学方法相比，Au@ANT 偶联物在生理条件和变性条件下显示出更高的产率、更好的稳定性以及更强的蛋白质活性保留能力。这些结果确立了 ANT 作为一种通用且高性能的策略，用于生成稳定且活跃的 AuNP-蛋白质偶联物，在纳米医学和先进材料科学中具有显著优势。

**引言**

金纳米粒子 (AuNPs) 由于其可调的表面等离子体共振、生物相容性和较大的表面积与体积比，在医学、生物学和化学领域得到了广泛应用，使其成为催化剂、传感器和治疗剂的理想支架。(1?3) 实现这些应用需要将 AuNPs 与生物分子（如蛋白质、肽和寡核苷酸）进行稳健的表面功能化。(4) 一般而言，AuNPs 上的生物分子固定可以通过物理吸附 (PA) 或共价化学偶联来实现。(4) PA 是一种直接的方法，不需要偶联剂，依赖于静电力、疏水相互作用或蛋白质上的半胱氨酸残基直接表面结合（图 1a）。通常使用柠檬酸盐修饰的 AuNPs (Au@Citrate) 进行 PA，通过调整溶液 pH 值至目标蛋白质的等电点 (pI) 或略高来促进吸附。到目前为止，由于其简单性和更高的蛋白质偶联效率，柠檬酸盐修饰仍然是基于 PA 的偶联方法的首选。然而，PA 通常需要较高的蛋白质浓度才能有效钝化 AuNP 表面并防止聚集。(5,6) 在低蛋白质浓度下，蛋白质吸附速率不足以克服溶液中盐离子对柠檬酸盐的置换，导致表面稳定性的丧失和纳米粒子聚集。此外，基于 PA 的偶联成功往往取决于针对每种特定抗体的 pH 优化，有些抗体在任何 pH 值下都无法通过直接吸附形成稳定的偶联物。(7,8) 此外，结合较弱的蛋白质可能会从 AuNP 表面脱附，从而导致信号损失并影响复杂环境下的检测准确性。(9,10)

**图 1**
图 1. 使用柠檬酸盐修饰的 AuNPs (Au@Citrate) 通过三种不同策略形成 Au@Protein 的示意图。(a) 物理吸附，(b) EDC/NHS 介导的酰胺偶联，以及 (c) Alkyne Nitro Tag。

用于 AuNP 功能化的共价化学方法通常使用硫醇化封端试剂，这些试剂可以锚定在金表面上，并提供末端功能基团（如羧酸、叠氮化物、马来酰亚胺、酪氨酸残基或 Ni2+-硝基三乙酸 (NTA)），以促进蛋白质偶联。(11?18) 这些末端基团支持多种生物偶联策略，包括肽偶联、点击化学、Michael 加成、酶介导的反应等相关方法。其中，蛋白质胺与羧基功能化的 AuNP 表面之间的酰胺键形成是最常用的方法，因为它可以固定各种天然蛋白质（图 1b）。这通常是通过 EDC/NHS 介导的羧基活化实现的。然而，表面羧基的活化常常会由于减少静电排斥而破坏悬浮稳定性，导致意外的纳米粒子聚集。(19?22) 为了缓解这一问题，经常使用羧基硫醇-聚乙二醇 (SH-PEG-COOH) 来在偶联过程中保持稳定性。然而，PEG 的抗污染性质可能会阻碍蛋白质接近纳米粒子表面，从而降低偶联效率。(23?25) 此外，NHS 酯虽然反应性很高，但容易迅速水解，这限制了有效的偶联窗口。(26) 在 pH 7 和室温下，NHS 酯的水解速度远快于硝基苯酯（t1/2 ≈ 40.6 分钟 对比 t1/2 ≈ 7.6 小时），使得它们在水溶液中不够稳定。(27?29) 尽管使用羧基化的 AuNPs、蛋白质和 EDC/NHS 的一步法可以部分解决这个问题，但这样的反应往往需要微调，并可能导致不希望的蛋白质间交联。(30) 此外，相邻羧基附近的羧酸活化可能导致分子内环化，形成环状酸酐，增加表面疏水性，尽管具有较高的内在反应性，但最终会降低偶联效率。(31) 这些限制突显了继续需要更稳健和可靠的 AuNP 表面功能化蛋白质偶联方法的需求。

为了解决这些限制，我们引入了 Alkyne Nitro Tag (ANT)，这是一种紧凑型杂双功能配体，能够高效且稳定地将天然蛋白质共价偶联到 AuNPs 上（图 1c）。ANT 包含一个预先安装的反应性硝基苯酯部分，该部分在温和的水性条件下可以与蛋白质上的亲核残基发生亲核酰基取代反应，从而消除了通常导致聚集和低偶联产率的原位活化步骤的需要。为了锚定在 AuNP 表面上，ANT 使用了一个对亲电攻击不敏感的末端炔基，但能够与金形成强共价相互作用。(32?35) 尽管传统的杂双功能交联剂（如 DTSSP 和 DSNB）已广泛用于通过 NHS 酯-胺化学进行抗体-AuNP 偶联，但由于 NHS 酯的快速水解，它们的有效性受到限制，这通常会超过胺解反应并且需要大量的蛋白质过量。(36,37) 最近的报告显示，DTSSP 可能在共价偶联发生之前就已经水解，导致蛋白质吸附而不是真正的共价结合。(7,26,38) 值得注意的是，大多数中性小分子配体无法稳定 AuNPs，反而常常引起聚集。(39?43) 相比之下，ANT 尽管结构紧凑且总体呈中性，仍能赋予 AuNPs 显著的悬浮稳定性。这种稳定性可能归因于硝基中氧原子的形式负电荷，这可能有助于静电或偶极排斥。硝基上的这种局部负电荷特性可能会影响粒子间的相互作用，特别是在传统的小分子中性配体常引起聚集的系统中。ANT 的小尺寸和适度的疏水性可能有助于蛋白质吸附到 AuNP 表面上，通过邻近效应提高偶联效率。(25,44) 这种紧凑的设计不仅在温和的水性条件下提高了偶联效率，还保留了蛋白质活性并防止了脱附，有效地解决了物理吸附和传统的 EDC/NHS 基方法的关键限制。

在这里，我们展示了 ANT 用于将链霉亲和素 (SA)、辣根过氧化物酶 (HRP) 和免疫球蛋白 G (IgG) 等多种蛋白质功能化到 AuNPs 上的实用性，与传统方法相比，获得了更高的偶联产率和更好的稳定性。ANT 功能化的 AuNPs 的多功能性在多种分析方法和应用中得到了进一步验证，包括侧向流动测定、点印迹、Western 印迹、酶活性测定和比色传感。这些结果确立了 ANT 作为一种稳健且广泛适用的策略，用于实现稳定且高效的 AuNPs 蛋白质偶联。

**结果与讨论**

**设计理由及 Au@ANT 的悬浮稳定性**

为了证明使用末端炔基而不是硫醇进行 AuNP 表面功能化的合理性，我们首先比较了它们在电试剂存在下的化学稳定性。虽然硫醇化的 Nitro Tag (SNT) 在 DMSO 中 ?80?°C 下 3 天内降解，但 ANT 在 1 年后仍保持其原始的 HPLC 曲线（图 S1），证实了末端炔基在保护预活化基团方面的优越性。此外，ANT 中的硝基苯酯部分具有双重作用：它有助于稳定胶体的静电排斥，并为生物分子的亲核攻击提供活性位点。在本研究中，我们使用 ANT 将 AuNPs 与天然蛋白质功能化，生成了 Au@ANT@protein，并将其性能与使用传统 PA 和 EDC/NHS 方法制备的 Au@PA@protein 和 Au@CO2H@protein 进行了比较（图 1）。

对于表面功能化，将 100 μM 的 ANT 与 Au@Citrate 在 pH 7 的水溶液中于 25 °C 下孵育 4 小时以生成 Au@ANT。离心和洗涤后，Au@ANT 保持了其特征性的葡萄酒红色，其最大吸收峰从 521 nm 稍微移动到 524 nm，与 SH-PEG(1K)-COOH 修饰的 AuNPs (Au@PEG) 类似（图 2a,2b 和表 1）。相比之下，缺乏硝基基团的配体（如苯酯（配体 2）、NHS（配体 3）和二氟苯酯（配体 4）迅速变为蓝色，并伴有宽的吸收光谱和显著的红移，表明纳米粒子发生了聚集。这种聚集是由于炔基配体迅速取代了柠檬酸盐，导致静电稳定性的丧失。同样，含有硫酸酸、硫酯、羟基或伯胺基团的其他短炔基配体也无法保持葡萄酒红色，进一步证实了胶体的不稳定（图 S2）。值得注意的是，只有含有硝基的配体（ANT、配体 5 和 10）和含有羧酸的配体（MUA、MPA、PTA 和 SH-PEG(1K)-COOH）保持了 AuNPs 的胶体外观。在这些配体中，含有硝基的配体在没有带电基团或大分子聚合物的情况下独特地稳定了粒子，这是一种以前未报道的新行为。最后，为了证明末端炔基可以像硫醇一样有效地锚定在 AuNP 表面上，我们测定 ANT 在 15 nm AuNPs 上的表面覆盖率为大约 4.6 个分子/纳米2。这个值与类似尺寸的 AuNPs 上硫醇配体的报道表面密度（5.7–6.2 个分子/纳米2）相当。（45）表面覆盖率是通过 ICP-MS 和监测用 1 M NaOH 处理后释放的 p-硝基酚的吸收光谱（λmax = 400 nm）来确定的（图 S3）。

**表 1.**
配体修饰的 AuNPs 的最大吸收波长 (λabs)、ζ-电位和流体力学直径 (Z-平均)
| 配体 | λabs/nm | ζ-电位/mV | Z-平均/nm |
|------|------|---------|---------|
| Au@Citrate | 521–31.0 | 37.72 |
| Au@PEG | 523–13.1 | 35.03 |
| Au@MUA | 524–34.0 | 56.04 |
| Au@MPA | 521–25.0 | 3.85 |
| Au@PTA | 523–28.8 | 35.76 |
| Au@ANT | 524–20.4 | 8.37 |
| Au@254 | 1,634–16.6 | 25.38 |
| Au@35 | 28,593–25.1 | 24.49 |
| Au@46 | 44–19.7 | 7.21 |
| Au@55 | 24–19.3 | 9.0 |

为了进一步评估 ANT 功能化 AuNPs 的悬浮稳定性，我们进行了一系列补充分析。透射电子显微镜 (TEM) 显示金核尺寸约为 15 nm，这与 Turkevich 方法制备的 AuNPs 一致（图 2c）。(46) 值得注意的是，Au@ANT 显示出与 Au@Citrate 和 Au@PEG 相媲美的优异分散性，没有聚集迹象。金核的直径仍约为 15 nm，并且在与链霉亲和素和 Igg 蛋白质偶联后没有聚集迹象（图 S4）。相比之下，带有中性苯基配体的 Au@2 显示出明显的聚集，表明尽管结构相似，但悬浮稳定性较差。这些观察结果与图 2a,2b 中的 UV–vis 光谱和视觉外观一致。为了进一步评估胶体行为，我们进行了动态光散射 (DLS) 和ζ-电位测量（表 1）。含有硝基的配体（包括 ANT 和配体 5）修饰的 AuNPs 的流体力学直径 (Z-平均) 为 38.3–39.0 nm，与 Au@Citrate（37.7 nm）和 Au@PTA（35.7 nm）相当。相比之下，带有配体 2、3 和 4 的 AuNPs 显示出显著更大的流体力学尺寸（77.2–125.3 nm），尽管它们的分子尺寸较小（图 S5）。这个尺寸范围接近于含有较大聚乙二醇 (PEG) 测层的 Au@PEG（135 nm），表明配体 2–4 的尺寸增加是由于粒子聚集而不是配体厚度所致。ζ-电位测量进一步明确了这些发现。Au@Citrate 显示出高度负的表面电荷（?31.0?mV），与文献中报道的柠檬酸盐稳定的 AuNPs 一致。（47）相比之下，Au@ANT（?20.4?mV）、Au@5（?19.3?mV）、Au@2（?16.6?mV）和 Au@4（?19.7?mV）均表现出中等的表面电荷，表明表面电位和整体上都是中性的配体特征。有趣的是，尽管它们的ζ-电位相当，只有 Au@ANT 和 Au@5 在水溶液中保持了优异的分散性。这表明它们的增强悬浮稳定性并非仅由表面电荷幅度决定，而是可能源于硝基氧原子上的局部负电荷，这可能促进了静电排斥并抑制了聚集。这些发现强调了微妙的结构和电子特性在调节粒子间相互作用和胶体稳定性中的重要性。链霉亲和素（SA）与Au@ANT的结合
链霉亲和素（SA）因其对生物素具有强效且选择性的结合能力，被广泛用于生物测定、蛋白质组学和成像研究，这使其成为信号放大和分子定位的理想蛋白质。(48?50) 值得注意的是，SA不含半胱氨酸残基，因此适合作为评估不依赖于巯基化学的共价结合方法稳定性的模型。为了使用ANT策略在AuNP表面上功能化SA，将1 μM的SA与Au@ANT在pH 8.5的水溶液中于25°C下孵育过夜，以生成Au@ANT@SA。作为对比，SA还通过传统的物理吸附（Au@PA@SA）和EDC/NHS介导的化学偶联方法与各种羧基化的AuNP结合（见支持信息，材料与方法部分）。为了评估结合效率和纳米粒子的稳定性，采用了生物素结合测定法，包括侧向流动测定（LFA）和点印迹技术。这些功能性测定不仅依赖于吸收光谱和尺寸测量来推断结合是否成功，还提供了更直接和有意义的结果，以评估蛋白质在纳米粒子表面的附着及其生物活性的保持情况。

SA在AuNP上的结合效率首先通过包含固定在测试线（T）上的生物素化BSA的侧向流动测定（LFA）进行评估。每个试纸条浸入含有AuNP–SA结合物的Tris缓冲液中10分钟。随后使用智能手机相机捕捉图像，并通过凝胶扫描仪量化信号强度。如图3a所示，Au@ANT@SA产生的测试线比Au@PA@SA产生的测试线明显红29%，表明其生物素结合活性和结合效率显著提高（见图S6）。点印迹分析进一步证实了Au@ANT@SA产生的信号比Au@PA@SA更强。值得注意的是，Au@ANT@SA的表现也优于市售的AuNP–SA结合物，在点印迹和LFA试纸条上信号强度都更高（见图S7）。相比之下，通过EDC/NHS方法制备的SA–结合的AuNP显示出明显的结合效率降低。LFA和点印迹结果都显示，来自MUA-和MPA修饰的AuNP的结合物产生了微弱的信号并出现聚集现象。(20) 这种聚集可能是由于EDC激活后短羧酸配体迅速失去静电稳定作用所致（见图S8）。此外，Au@PEG@SA结合物在两种测定中均未能产生可检测的信号，这归因于PEG的抗污染特性，限制了SA与纳米粒子表面的有效结合。尽管可以使用较短的PEG链来提高结合效率，但经EDC/NHS处理的纳米粒子仍会出现聚集（见图S9）。吸收光谱和DLS分析显示，Au@ANT@SA和Au@PA@SA在结合后其表面等离子共振（SPR）光谱带发生了轻微的红移，这与纳米粒子尺寸的轻微增加一致（见图S10和表S1）。相比之下，Au@PEG@SA在EDC/NHS处理后没有明显的光谱变化。这些结果与先前的研究一致，即EDC/NHS介导的羧基配体偶联通常会导致结合效率低下和纳米粒子聚集。(19?25,51) 特别是当使用PEG作为连接体时，这种方法通常不会导致吸收光谱的显著变化。为了进一步量化结合效率，使用SDS-PAGE分析了上清液中未反应的SA量（见图S11）。使用ANT方法得到的结合产率（47%）明显高于物理吸附（27%）或EDC/NHS肽偶联（约0%），这凸显了ANT介导的策略在AuNP蛋白质功能化方面的优越性和稳定性。

接下来，我们比较了使用不同预活化配体（包括ANT、苯基酯（配体2）、NHS酯（配体3）和二氟苯基酯（配体4）以及未加入偶联试剂的羧基化配体（如PTA、MUA和MPA）将SA与AuNP结合的效率（见图3b）。其中，只有Au@ANT@SA在LFA和点印迹测定中产生了强烈的酒红色测试线。相比之下，使用配体2–4制备的结合物产生的信号较弱或无法检测到，常常伴有测试线变黑或印迹区模糊，表明结合效率低且粒子发生显著聚集。需要注意的是，LFA和点印迹测定可能会得出不同的结果。在结合过程中形成的大聚集体可能无法通过LFA试纸条，导致测试线信号微弱或消失，而同样的聚集体仍可以在点印迹上观察到。对于未经EDC/NHS活化的SA–结合的AuNP，PTA修饰的颗粒产生了微弱但可检测的信号，而MUA-和MPA修饰的AuNP在两种测定中均无可见信号。这表明较短且更疏水的PTA配体比MUA和MPA更有利于蛋白质的吸附，这与先前的研究结果一致，即较短且疏水的配体通常能增强表面相互作用和蛋白质负载。(25) 为确认SA与Au@ANT的结合是通过共价键而不是吸附实现的，我们发现ANT中的硝基苯酯部分能与蛋白质亲核试剂有效反应（见图S12和S13）。此外，我们还研究了不同碳链长度的ANT衍生物对结合效率的影响（见图S14）。碳链长度增加到14个碳原子时，配体的疏水性显著增强，导致金纳米粒子部分聚集，从而降低了胶体稳定性和结合效率。相反，碳链缩短到3个碳原子时，虽然保持了纳米粒子的分散性，但SA结合后的信号强度略有降低（见图S9）。这可能是由于硝基苯酯的共振效应降低了其反应性，从而影响了蛋白质的结合效率。

总体而言，ANT的优异性能归功于其预先安装的硝基苯酯部分，该部分在无需原位活化的情况下提供了足够的稳定性，同时能够有效地与蛋白质上的亲核残基发生共价偶联。相比之下，配体2–4未能保持胶体稳定性，导致结合效率低和纳米粒子聚集。这些发现强调了配体设计的重要性，不仅对于实现高效的生物偶联至关重要，而且对于在整个蛋白质修饰过程中保持纳米粒子的分散性也非常关键。

在复杂环境中保持纳米粒子的稳定性和表面修饰蛋白质的活性对于纳米材料在生物医学领域的成功应用至关重要。为此，我们将Au@ANT@SA和Au@PA@SA分别在60%胎牛血清（FBS）和1 M NaCl中孵育，并使用含有BSA-biotin的LFA试纸条评估其稳定性（见图4a）。如图4a所示，Au@ANT@SA在37°C下孵育24小时后仍保持强生物素结合活性，信号损失很小。相比之下，Au@PA@SA在相同条件下稳定性较差，信号强度大幅下降。此外，Au@ANT@SA在含有0.1% BSA、0.1% tween 20和5%蔗糖的缓冲液中于4°C储存180天后仍表现出优异的稳定性，而Au@PA@SA的信号强度逐渐减弱（见图4b和S15）。Au@ANT@SA还表现出对硫醇诱导的置换具有更高的抵抗力，并且在冻干后仍保持良好性能（见图S16和S17）。这些结果突显了ANT的卓越生理稳定性和蛋白质保留能力，支持其在生物分析应用中的广泛潜力。

接下来，我们将Au@ANT@SA应用于Western blotting实验中。目前，只有少数研究使用AuNP–蛋白质结合物作为印迹测定中的染色剂，而这些方法通常需要银增强或更敏感的检测技术。(52?54) 我们的结果显示，Au@ANT@SA能够在不需要额外放大的情况下直接一步检测PVDF膜上的生物素化蛋白质（见图4c）。由于ANT系统的高结合效率和稳定性，Au@ANT@SA产生的可见信号强度足以用肉眼观察到，并且比Au@PA@SA具有更高的分析灵敏度，能够检测到至少50 nM的生物素化蛋白质。Au@ANT@SA在生物素化蛋白质检测方面的优越灵敏度还通过点印迹分析得到了进一步验证，即使在Au@ANT@SA稀释400倍后仍能观察到可见信号（见图S18）。

为了展示Au@ANT@SA在生物学相关系统中的实用性，我们将其用于检测天然的人类碳酸酐酶XII（hCAXII），这是一种在多种癌症中过表达的跨膜糖蛋白。(55?57) 作为缺氧相关的生物标志物，hCAXII通过酸化细胞外环境和促进侵袭行为来促进肿瘤发展。使用针对hCA的生物素化亲和标记探针（HLP）选择性地标记A549癌细胞表面的hCAXII，这些细胞已知会过表达这种hCA亚型（见图S19）。(58) 标记后，细胞裂解物通过SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜上，然后使用Au@ANT@SA进行一步印迹。如图4d所示，只有在存在hCA靶向探针的情况下才能观察到明显的条带。当省略探针或用hCA抑制剂ethoxzolamide预处理细胞时，未检测到信号，因为ethoxzolamide会阻断探针的结合。这些结果共同证明了ANT作为生成高度稳定和功能性蛋白质–AuNP结合物的双重功能配体的有效性和可靠性。

辣根过氧化物酶（HRP）与Au@ANT的结合
辣根过氧化物酶（HRP）是一种含有血红素的金属酶，在生物医学分析中有着广泛的应用，包括显色和荧光信号放大、酶联免疫测定（ELISA）、生物传感器和免疫组化染色，这得益于其在过氧化氢（H2O2）存在下的氧化催化活性。(59) 除了诊断用途外，HRP还在引发聚合物聚合反应和材料交联中发挥关键作用。(60) 尽管HRP含有八个半胱氨酸残基，但由于所有半胱氨酸都参与了对结构稳定性至关重要的二硫键形成，因此无法参与巯基–金结合。虽然物理吸附常用于将HRP固定在AuNP上，但通常会导致酶的保留率较低。(61?63) 最近有研究报道，使用巯基修饰的HRP可以提高结合效率和稳定性，但这需要对酶进行预先化学修饰，增加了酶修饰的操作复杂性。(64) 为了直接比较不同结合策略的性能，我们分别使用ANT、物理吸附（PA）和EDC/NHS介导的偶联方法制备了HRP–AuNP结合物，得到Au@ANT@HRP、Au@PA@HRP、Au@PEG@HRP和Au@MUA@HRP。Au@PA@HRP的制备遵循文献报道的协议，表明辣根过氧化物酶（HRP）在微酸性条件下结合时活性最高（见图S20）。(64) 然后使用四甲基联苯胺（TMB）显色测定法评估了这些结合物的酶活性和稳定性（见图5a）。记录了每个结合物在TMB/H2O2处理后的450 nm处的吸光度，结果显示Au@ANT@HRP保留了约56%的天然HRP的催化活性，而Au@PA@HRP、Au@PEG@HRP和Au@MUA@HRP的活性分别只有28%、1%和10%（见图5b）。为了深入了解酶的催化性能，评估了天然HRP和HRP–AuNP结合物的最大速度（Vmax）和米氏常数（Km）（见图5c和表S2）。Au@ANT@HRP的Vmax为10.8 μM/min，几乎是Au@PA@HRP（4.8 μM/min）的两倍。另一个催化性能指标Kcat/Km也显示Au@ANT@HRP的值显著高于Au@PA@HRP（38 min–1 μM–1），证实了ANT是制备HRP结合物的优秀方法。然后通过连续三次离心、清洗和在TMB测定中的重复使用来评估结合物的稳定性和可重复使用性（见图5d）。Au@ANT@HRP在三次循环后仍保持96%的初始活性，显示出极好的稳定性。相比之下，Au@PA@HRP在相同循环次数后活性大幅下降，仅保留了约41%。除了可重复使用性外，Au@ANT@HRP还表现出对蛋白酶降解的显著抵抗力（见图5e）。在37°C下经过16小时的胰蛋白酶消化后，Au@ANT@HRP保留了大约76%的初始活性，而天然HRP和Au@PA@HRP分别仅保留了约28%和32%的活性。图5：辣根过氧化物酶与Au@ANT的结合。(a) HRP催化的TMB被H2O2氧化以及Au@HRP结合物的回收的示意图。(b) 由天然HRP、Au@ANT@HRP、Au@PA@HRP、Au@PEG@HRP和Au@MUA@HRP催化的氧化产物(TMBDI)的吸收光谱。(c) 使用不同H2O2浓度比较天然HRP、Au@ANT@HRP和Au@PA@HRP的催化活性的Michaelis–Menten图。(d) 通过37°C下经过16小时胰蛋白酶消化后，通过450nm处TMBDI的吸光度分析Au@ANT@HRP、Au@PA@HRP和Au@PEG@HRP的重复使用性。(e) 天然HRP、Au@ANT@HRP和Au@PA@HRP对蛋白酶降解的抵抗力。高分辨率图片下载MS PowerPoint幻灯片

总体而言，这些结果表明，ANT介导的结合产生的HRP–AuNP结合物比通过PA或EDC/NHS偶联制备的结合物具有更高的催化活性、动力学效率和稳定性。性能的提高归因于ANT稳定的共价连接，这可以防止酶的脱附，最小化结构变形，并保持活性位点的可及性，使其成为一种稳健且通用的蛋白质在金纳米粒子上固定的策略。

抗体重叠(IgG)与Au@ANT的结合
抗体，特别是免疫球蛋白G (IgG)，是广泛应用于免疫测定和生物传感器、靶向癌症治疗以及先进成像技术中的关键免疫蛋白，这些应用常常将其与金纳米粒子(AuNPs)结合。(4,5,65) 在大多数情况下，IgG是通过物理吸附(PA)固定在AuNP表面上的，这种吸附由静电相互作用或可接近的半胱氨酸残基介导。这种简单且无需偶联剂的方法已经使得许多IgG–AuNP结合物能够商业化，用于即时检测。然而，PA的一个固有局限性是需要高浓度的IgG来完全钝化AuNP表面，这在处理昂贵或稀有的抗体时尤其成本高昂。实际上，许多研究表明，在抗体覆盖率不足或在中性pH条件下制备的AuNP–IgG结合物容易发生聚集。(5?8,65) 为了解决这些问题，采用了ANT介导的共价结合策略，使得在较低的抗体浓度和中性pH下能够实现稳定的IgG固定，同时保持胶体稳定性和功能活性。

为了评估ANT介导的抗体重叠，使用ANT、PA、EDC/NHS偶联以及2,3,4,PTA、MUA和MPA等配体，将100 nM的小鼠IgG与AuNPs结合。通过侧向流动 assay (LFA) 评估了结合效率和性能，在该测试中，山羊抗小鼠IgG被固定在测试线上作为捕获靶标。在所有测试的条件中，Au@ANT@IgG表现出最高的胶体稳定性，并在LFA条带上产生了最强的测试线信号(图6a和S21)。相比之下，使用EDC/NHS偶联或2,3,4,PTA等配体制备的IgG–AuNP结合物显示出较弱的信号强度，并且在结合过程中出现了明显的聚集现象。实验结果一致地显示，IR光谱在EDC/NHS激活或IgG处理后没有显著变化(图S22)。我们还使用SDS-PAGE分析了结合后上清液中未反应的IgG的相对负载量，结果表明ANT提供了最高的蛋白质结合效率(图S23)。值得注意的是，Au@ANT@IgG的吸光度通常略低于相应的Au@PA@IgG样品(图S24)。虽然Au@ANT@IgG和Au@PA@IgG在FBS和1 M NaCl条件下都表现出显著的稳定性，但Au@ANT@IgG对如二硫苏糖醇(DTT)这样的巯基化合物具有更强的抵抗力(图S25)。这些发现与SA和HRP功能化的AuNPs的结果一致，进一步证实了ANT配体在实现稳定和高效蛋白质附着方面的改进作用。

图6：IgG与Au@ANT的结合及应用。(a) 使用ANT、PA、EDC/NHS偶联以及不同表面配体修饰的AuNPs制备的IgG结合物的代表性LFA测试条结果。(b) 使用不同浓度IgG制备的Au@ANT@IgG的LFA测试条，即使在较低的抗体负载量下也能显示出强烈的测试线信号。(c) 使用不同浓度IgG制备的Au@PA@IgG的LFA测试条，在低抗体负载量下显示出聚集现象和信号丢失。(d) Au@ANT@IgG与9.1 nM兔IgG(靶标)或91 nM非靶标蛋白孵育后的吸光度。(e) Au@ANT@IgG在37°C下与不同浓度兔IgG处理后的吸收光谱。沉淀测定的详细方案见支持信息文件。高分辨率图片下载MS PowerPoint幻灯片

为了进一步研究表面覆盖率对结合物稳定性的影响，使用ANT和PA方法以不同的抗体浓度对AuNPs进行了功能化处理。LFA、吸收光谱和视觉检查显示，尽管是在中性pH 7的水溶液中制备的(这种条件通常会通过PA方法促进聚集)，Au@ANT@IgG仍然保持了优异的胶体稳定性和强烈的信号强度(图6b，7,8,66)。值得注意的是，即使在5 nM的低抗体负载量下，结合物也保留了其特征性的酒红色，并且没有出现光谱宽化。相反，Au@PA@IgG随着IgG浓度的降低而逐渐聚集，其吸收光谱在100 nM时就已经出现宽化，并在更低负载量时变得更严重(图6c和S26)。这些观察结果与先前的报道一致，说明在低蛋白质浓度下制备的IgG–AuNP结合物容易发生聚集。Au@ANT@IgG在低抗体负载条件下保持稳定和功能性的能力突显了其在最小化抗体消耗方面的实际价值，这对于涉及昂贵或稀有抗体的成本敏感应用来说是一个重要优势。

免疫沉淀是最常用的抗原检测方法之一，其原理是抗体可以结合多价抗原形成交联的聚集体并从溶液中沉淀出来。已经开发了几种基于这种聚集诱导沉淀原理的IgG–AuNP结合物，用于比色或浊度抗原检测，以提高检测灵敏度。(67?70) 然而，这些方法通常需要大量的抗体来防止非特异性聚集，或者灵敏度较低。使用仅含有25 nM山羊抗兔IgG制备的Au@ANT@IgG，在非靶标蛋白过量10倍的情况下，仍能够选择性地检测到9.1 nM的兔IgG(靶标)(图6d和S27)。这些结合物的检测限(LOD)约为0.85 nM，远低于传统蛋白质沉淀测定的检测限(1.7–133 nM)(图6e和S28，67?70)。相比之下，使用25 nM IgG制备的Au@PA@IgG无法用于沉淀测定，因为它在低抗体负载量下容易聚集(图S29)。这些结果突显了Au@ANT@IgG在实现高灵敏度免疫沉淀检测的同时最小化抗体消耗的潜力。

结论
我们引入了炔基硝基标签(ANT)作为一种紧凑的异双功能配体，它通过其硝基取代基的静电排斥效应独特地稳定了金纳米粒子，同时允许通过预装的硝基苯酯直接进行共价蛋白质结合。这一设计规避了传统策略的局限性，如物理吸附的不稳定性和EDC/NHS偶联的低效率，提供了一个稳健且通用的蛋白质功能化平台。通过与SA、HRP和IgG的系统比较，证明了ANT能够在严苛的生物和化学条件下制备出具有更高稳定性、活性保留和重复使用性的结合物。此外，Au@ANT蛋白质结合物支持多种应用，包括侧向流动测定、Western blotting、酶感应和免疫沉淀，实现了更高的灵敏度和显著降低的蛋白质消耗。综上所述，这些发现确立了ANT作为一种全新的蛋白质-纳米粒子结合物工程策略，为高级纳米材料设计和生物分析技术开辟了新途径。

实验部分 材料和仪器
所有化学品和试剂均从Sigma-Aldrich或TCI购买，并按原样使用。溶剂包括DMSO、DMF、DCM、乙腈、己烷、乙酸乙酯和甲醇，均从Sigma-Aldrich或TCI购买并直接使用。快速柱层析使用硅胶(230–400目，Merck)进行。分析HPLC在XBridge BEH C18柱(130 ?, 5 μm, 4.6 × 250 mm2)上进行。产品使用半制备型HPLC柱(Cosmosil 20 mm ID × 150 mm, 5C18-AR-300, Nacalai Tesque)纯化。抗体来自Jackson ImmunoResearch。链霉亲和素(streptavidin)从Fitzgerald获得，辣根过氧化物酶(HRP)来自Sigma-Aldrich。侧向流动测定(LFA)膜(Whatman FF120HP)来自Cytiva，背衬卡片来自Prisma Biotech，吸水垫来自Merck，样品垫来自Advanced Microdevices。

1H和13C NMR光谱在Varian UnityInova-500、Varian MR-400或Bruker-400光谱仪上记录。化学位移(δ)以ppm表示，相对于残留溶剂信号：1H的δ 7.24 (CDCl3)和δ 3.31 (CD3OD)；13C的δ 77.0 (CDCl3)和δ 49.0 (CD3OD)。高分辨率质谱(HRMS)采用电喷雾离子化(ESI)在JEOL JMS-T100LP 4G上进行测量。UV–vis吸收光谱使用TECAN Infinite M200 PRO微孔板读取器和Thermo Scientific 96孔微孔板记录。图像在ChemiDoc Touch成像系统(Bio-Rad, CA, USA)上捕获，并使用Image Lab软件(Bio-Rad, CA, USA)进行分析。TEM图像使用Hitachi HT7700获得。动态光散射(DLS)和ζ-电位测量使用Malvern Zetasizer Nano进行。本工作中展示的所有LFA条带和点印迹图像均使用智能手机相机捕获。

柠檬酸封端的AuNPs (Au@citrate)的合成
使用柠檬酸钠还原法(Turkevich方法)合成了球形AuNPs(约15 nm)。将HAuCl4的水溶液(1 mM, 50 mL)加热至回流状态，然后迅速加入柠檬酸三钠溶液(38.8 mM, 6 mL)。混合物在回流条件下保持7分钟，随后将所得AuNP溶液冷却至室温并在4°C下保存以备后续使用。

AuNPs的表面修饰
用ANT或其它配体修饰AuNPs
将200 μL的6.6 nM AuNPs与ANT反应。离心后，将生成的Au@ANT重新悬浮至50 μL。将生成的Au@ANT溶液与等体积的1 M NaOH混合2小时，以完全水解硝基苯酯。在10,000 rpm下离心30分钟后，收集上清液并丢弃。沉淀物在去离子水中(990 μL)重新悬浮，并在相同条件下再次离心。去除上清液后，收集纯化的配体修饰AuNP以用于进一步实验。

AuNPs上ANT的表面覆盖率测定
将200 μL的6.6 nM AuNPs与ANT反应。离心后，将生成的Au@ANT重新悬浮至50 μL。将生成的Au@ANT溶液与等体积的1 M NaOH混合2小时以完全水解硝基苯酯。在10,000 rpm下离心30分钟后，收集上清液并采用UV–vis吸收法进行分析。通过与已知浓度的标准品比较，确定释放的p-硝基酚的浓度为4.4 nmol。通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)确定初始Au@citrate溶液(200 μL)中的金浓度为142 ppm，从而计算出15.2 nm AuNPs的浓度为6.6 nM，因此配体修饰反应中存在0.00132 nmol的AuNPs。根据这些值，估计每个AuNP上的ANT分子数量约为3333个，ANT的表面覆盖率为每纳米2个分子。

AuNPs与蛋白质的结合
将Au@ANT溶液用去离子水(pH 7)或硼酸盐缓冲液(pH 8.5)稀释至最终体积198 μL。加入蛋白质溶液(2 μL)，以达到最终浓度：1 μM链霉亲和素(SA)、50 nM辣根过氧化物酶(HRP)或0–500 nM小鼠IgG。在室温下摇摇混匀过夜，然后用150 μM BSA封闭1小时。悬浮液在10,000 rpm下离心30分钟并丢弃上清液。沉淀物用200 μL去离子水清洗一次，然后再次在10,000 rpm下离心30分钟。将生成的结合物重新悬浮并储存在Tris缓冲液(对于Au@ANT@HRP)或结合物缓冲液(5 mM硼酸盐, 0.1% BSA, 0.1% Tween-20, 5% D-蔗糖)中，最终体积为100 μL。对于抗体沉淀测定，将25 nM山羊抗兔IgG与Au@ANT@IgG孵育6小时后，再用100 nM BSA封闭12小时。按照上述步骤进行离心和洗涤后，将偶联物储存在PBS缓冲液中以备使用。通过EDC/NHS肽偶联法制备AuNP–蛋白质偶联物（Au@citrate，200 μL，OD520 = 1.0），然后在5000 g下离心30分钟。小心去除上清液，将沉淀物重悬于200 μL去离子水中。向此悬浮液中加入2 μL SH-PEG(1k)-COOH、MUA或MPA（10 mM），并在25 °C下振荡1小时。将反应混合液以10,000 rpm离心30分钟，然后丢弃上清液。用去离子水清洗沉淀物一次。在相同条件下再次离心后，将沉淀物重悬于200 μL去离子水中以进行后续的蛋白质偶联。对于一步法协议，先向AuNP溶液中加入EDC（100 mM，2 μL），然后立即加入sulfo-NHS（100 mM，2 μL）。10分钟后，加入2 μL蛋白质，最终达到1 μM SA、50 nM HRP或100 nM IgG的浓度。将混合物在室温下振荡过夜，然后用150 μM BSA封闭1小时。以10,000 rpm离心30分钟，丢弃上清液。用200 μL去离子水清洗沉淀物一次。在相同条件下再次离心后，将沉淀物重悬于Tris缓冲液或偶联缓冲液中储存。对于两步法协议，先向AuNP溶液中加入EDC（100 mM，2 μL），然后加入sulfo-NHS（100 mM，2 μL）。1小时后，以10,000 rpm离心30分钟以去除多余的偶联剂，将沉淀物重悬于200 μL去离子水中。接着加入蛋白质（2 μL，最终浓度为1 μM SA、50 nM HRP或100 nM IgG），并按照一步法协议进行后续步骤。

通过物理吸附法制备AuNP–蛋白质偶联物：调整Au@citrate（200 μL，OD520 = 1.0）的pH值，使其分别达到pH 8.0（用于SA）、pH 6.5（用于HRP）或pH 8.5（用于IgG）。加入蛋白质溶液（2 μL），最终达到1 μM SA、50 nM HRP或0–500 nM小鼠IgG的浓度。将混合物在室温下振荡1小时，然后用150 μM BSA封闭1小时。以12,000 rpm离心15分钟，丢弃上清液。用200 μL去离子水清洗沉淀物一次。在相同条件下再次离心15分钟后，去除上清液，将沉淀物重悬于Tris缓冲液或偶联缓冲液中，最终体积为100 μL以储存。

通过SDS-PAGE测定未反应的链霉亲和素和偶联产率：收集通过ANT、PA和EDC/NHS方法（未使用BSA封闭）进行的AuNP–SA偶联反应的上清液。每种上清液与4×加载缓冲液（250 mM Tris-HCl、40%甘油、8% SDS、20% DTT）混合，并在90 °C下加热10分钟。将样品加载到10% SDS–PAGE凝胶上，然后在95 V和50 A的条件下进行电泳。电泳完成后，用Coomassie Brilliant Blue (CBB)对凝胶进行染色。使用智能手机摄像头和ChemiDoc Touch Imaging System（Bio-Rad）拍摄图像。为了确定偶联产率，还对已知浓度的SA标准品进行SDS–PAGE分析，以生成校准曲线。利用Image Lab软件量化条带强度，并计算每种上清液中未反应SA的浓度。通过比较未反应SA的量与初始蛋白质的量来确定偶联产率。

AuNP偶联物的TEM成像：将AuNP样品（10 μL）沉积在TEM支持网格（TED PELLA INC., 01800-F, F/C, 200 mesh）上。7分钟后，用镜头擦拭纸去除多余液体，并在化学通风橱中干燥过夜，再进行成像。

AuNP偶联物的DLS和ζ-电位分析：对于动态光散射（DLS）测量，将Au@ligand样品用去离子水稀释至最终体积1.5 mL，并装入一次性比色池中。每次测量进行10次扫描，每次10秒。对于ζ-电位分析，将Au@ligand样品稀释至最终体积0.75 mL，装入DTS-1070样品池中，每次运行进行20次测量，共重复三次。LFA测试：使用Au@SABS（20 μM）和山羊抗小鼠IgG（0.25 mg/mL）分别涂布测试线和对照线。运行溶液包含Tris缓冲液（50 mM）、BSA（250 μM）、SDS（1%）和测试颗粒（5 μL），总体积为50 μL。对照颗粒是通过物理吸附方法用小鼠IgG（300 nM）标记的AuNPs。使用智能手机摄像头拍摄图像，并使用ChemiDoc Touch Imaging System和Image Lab软件（Bio-Rad）记录和量化信号强度。测试线的强度作为偶联稳定性和性能的主要指标。对于复杂介质稳定性测试，在含有Au@SA的运行溶液中加入FBS或NaCl（2 M），最终浓度分别为60% FBS或1 M NaCl。将混合物在37 °C下孵育0、1、2、4、8、16和24小时。对于巯基干扰测试，将Au@SA偶联物与GSH（5 mM）或DTT（5 mM）在运行缓冲液中孵育1小时，然后将测试条（涂有BSA–生物素的测试线）浸入溶液中30分钟。对于长期储存测试，将Au@SA偶联物在4 °C下储存，并在第0、7、14、30、60、90、120和180天进行评估。

AuNP偶联物的冷冻干燥测试：将偶联物冷冻干燥以去除溶剂，并用100 μL H2O重新溶解。将冷冻干燥和未冷冻干燥的偶联物分别与2.5 μL 5 mM BSA和1% SDS在50 mM Tris缓冲液中混合（最终体积：50 μL），然后将测试条浸入混合液中30分钟。

Au@SA的点印迹：将硝酸纤维素膜切成1 cm × 1 cm的方块，并分成四部分。在膜上涂布BSA–生物素，然后在37 °C下孵育30分钟以去除残留水分。接着用5%牛奶在PBS中封闭1小时，再用PBS清洗膜。测试时，将Au@SA（50 μL）用50 mM Tris缓冲液稀释至最终体积1 mL，然后将膜浸入溶液中过夜。孵育后，用PBST（1% Triton X-100在PBS中）清洗膜。使用智能手机摄像头拍摄图像，并使用ChemiDoc Touch Imaging System和Image Lab软件（Bio-Rad）记录信号强度。

Au@SA的Western印迹：通过SDS–PAGE（95 V，50 A，100分钟）分离蛋白质样品，并将其转移到甲醇活化的PVDF膜上（90 V，150 A，90分钟）。然后用PBST（0.1% Tween-20在PBS中）清洗膜，并用5%牛奶在PBST中封闭膜。随后在含有Au@SA（40 μL，浓度为3倍）和PBST（8 mL）的混合物中以100 rpm孵育过夜。孵育后，用PBST清洗膜三次。使用智能手机摄像头拍摄图像，并使用ChemiDoc Touch Imaging System记录信号强度。

hCA标记：按照先前报道的方案进行hCA标记（ACS Sens. 2022, 7, 2691–2700）。

TMBA显色反应：将TMB储备溶液溶解在DMSO中，浓度为10 mg/mL。H2O2溶液通过将30% H2O2与柠檬酸–PBS缓冲液（25 mM，pH 5）稀释至25 ppm来制备。反应时，先将400 μL H2O2溶液、390 μL去离子水和5 μL TMB储备溶液混合。然后向微离心管中加入100 μL该混合液，再加入5 μL天然HRP或Au@HRP。在37 °C下孵育15分钟后，加入100 μL 3 M H2SO4以终止反应。使用UV–vis吸收光谱仪（TECAN Infinite M200 PRO）分析氧化后的TMB产物（TMBDI）。

天然HRP和Au@HRP的酶动力学：对于动力学测定，将1.8 μL 41.6 mM TMB（10 mg/mL在DMSO中）和6 μL天然HRP或Au@HRP与277.2 μL去离子水混合。然后加入不同浓度的H2O2（15 μL，浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、5.0、15和20 mM），最终体积为300 μL。每隔30秒抽取50 μL反应混合物，用等体积的3 M H2SO4终止反应，并在450 nm处进行UV–vis吸收分析。通过拟合初始速率（V0）到Michaelis–Menten方程来确定动力学参数。

Au@HRP的回收率：对于回收率测试，将400 μL H2O2溶液、395 μL去离子水和5 μL TMB储备液混合。向含有20 μL Au@HRP或Tris缓冲液（空白对照）的微离心管中加入100 μL混合液。在37 °C下孵育5分钟后，以7400 g离心15分钟。从上清液中抽取50 μL，用等体积的3 M H2SO4终止反应，并在450 nm处进行UV–vis吸收分析。丢弃剩余的上清液，用200 μL Tris缓冲液（25 mM）清洗沉淀物，然后以7400 g离心30分钟。丢弃上清液，将沉淀物重悬于20 μL Tris缓冲液中，准备下一循环。

胰蛋白酶消化测定：将Au@HRP（2 μL）与去离子水（38 μL）和胰蛋白酶溶液（10 μL，0.25% w/v，Corning，USA）在微离心管中混合，并在37 °C下孵育16小时。同时，将H2O2溶液（400 μL，25 ppm）与TMB储备溶液（5 μL，10 mg/mL在DMSO中）混合。向胰蛋白酶处理过的样品中加入50 μL该混合液。在37 °C下孵育5分钟后，用100 μL 3 M H2SO4终止反应，并使用UV–vis吸收光谱仪分析氧化后的TMB产物（TMBDI）。

Au@IgG的LFA测试：使用山羊抗小鼠IgG（0.25 mg/mL）涂布测试线。运行缓冲液包含Tris（50 mM）、BSA（250 μM）和Tween-20（1%），总量为50 μL。将测试条浸入混合液中15分钟。使用智能手机摄像头拍摄图像，并使用ChemiDoc Touch Imaging System和Image Lab软件（Bio-Rad）记录和量化信号强度。对于复杂介质中的稳定性测试，在含有Au@IgG的运行溶液中加入FBS或NaCl（2 M），最终浓度分别为60% FBS或1 M NaCl。将混合物在37 °C下孵育0、24和48小时。对于巯基干扰测试，将Au@IgG偶联物与0.5 mM GSH、半胱氨酸（Cys）或DTT在运行缓冲液中孵育1小时。然后将测试条浸入处理过的混合物中15分钟。

沉淀测定：将Au@IgG（20 μL）与样品蛋白（2 μL）混合并在37 °C下孵育1小时，然后加入PBS缓冲液（80 μL）。在37 °C下再孵育1小时后，小心抽取90 μL反应溶液并进行UV–vis吸收光谱分析。选择性测试中，目标蛋白（兔IgG）的浓度为9.1 nM，非目标蛋白的浓度为91 nM。检测限（LOD）的计算公式为LOD = 3.3σ/S，其中σ是空白测量的标准差，S是校准曲线的斜率。