通过脂质体介导的递送方式追踪小麦叶片中对硒的吸收：共聚焦显微镜和同步辐射微X射线荧光技术的分析

《ACS Agricultural Science & Technology》：Tracing Selenium Uptake in Wheat Leaves via Liposome-Mediated Delivery: A Confocal Microscopy and Synchrotron Micro-X-ray Fluorescence Insight

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将纳米封装技术与叶面施用相结合，为提高农业中硒（Se）的生物强化提供了一种有前景的方法。本研究利用基于同步辐射的微X射线荧光（μ-XRF）和共聚焦显微镜技术，研究了脂质体封装硒在小麦叶片（Triticum aestivum）中的叶面吸收情况。μ-XRF图谱显示，24小时后硒在叶片边缘积累，表明硒最初是通过气孔被吸收的；而游离态硒的吸收和运输速度更快，这凸显了脂质体封装的缓释效果，其作用时间超过了分析的时间范围。没有观察到硒立即转移到茎部的现象，说明这种内部移动需要更长的时间。微X射线近边结构（μ-XANES）物种分析表明，硒在植物体内被代谢为有机形式。最后，共聚焦荧光显微镜证实了脂质体在24小时内通过叶片表面被吸收，与μ-XRF的结果一致。这些结果对于优化脂质体配方、最大化硒向可食用部分的转移至关重要。

1. 引言
营养素、肥料和其他农用化学品的叶面吸收是现代农学和植物生理学中一个关键的研究领域。(1) 理解这些过程不仅对优化农业生产至关重要，也有助于解释调节植物营养的基本生理机制。(2) 在过去几十年中，叶面施肥作为一种补充土壤施肥的方法受到了越来越多的关注，因为它能更快速、更有效地吸收必需元素。(3,4) 在土壤养分供应有限或需要立即响应养分缺乏的情况下，这种方法尤为重要。(5,6) 全面了解叶面吸收机制对于开发更高效、更可持续的施肥策略至关重要。(7) 这包括探讨养分通过叶片表面的吸收、在植物组织内的运输以及影响吸收效率的关键因素。(3) 此外，该领域的进步有望显著提高农业生产力并改善作物品质，同时减少传统肥料过度使用所带来的环境影响。(8) 近年来，纳米技术作为一种提高叶面养分施用效率的方法应运而生。(9) 将不同化合物封装在纳米材料中显示出显著优势，包括增强吸收、控制释放速度以及降低环境足迹，相比传统肥料更具优势。(10?13) 在全球关注的微量营养素中，硒（Se）因其在人体营养中的重要作用以及在低剂量下对植物的有益作用（如抗氧化防御和耐逆性）而受到广泛研究。(14) 目前的硒生物强化方法主要依赖于离子硒盐（硒酸盐或硒亚酸盐）或硒纳米颗粒（SeNPs）。(15) 硒纳米颗粒在提高生物利用率、降低植物毒性以及增强多种作物的抗逆性方面表现出良好效果。(16) 然而，硒纳米颗粒的农艺性能高度依赖于其颗粒大小、结晶度、表面电荷和合成路线，这些因素强烈影响其在植物体内的溶解动力学、转化过程及其与土壤的相互作用。(17,18) 需要注意的是，尽管有关其低急性毒性的报道越来越多，但关于纳米颗粒在农业生态系统中的长期环境命运及其潜在生物积累仍存在不确定性。(19,20) 这些未解决的问题目前限制了它们的监管认可和大规模农业应用。

相比之下，基于纳米胶囊的输送系统，特别是脂质体纳米载体，代表了一种新兴且尚未充分探索的硒生物强化策略。脂质体是能够将硒物种封装在生物相容性双层结构中的磷脂囊泡，有助于保护硒、改善其在叶片表面的附着力，并实现叶面施用后的控释。(21) 与无机纳米颗粒不同，脂质体由通常被认为安全、可生物降解的磷脂组成，并已广泛应用于食品、制药和营养补充剂行业。(9) 因此，在纳米生物强化策略的更广泛框架中，载硒纳米脂质体通过结合高效的养分输送和优异的生物相容性，提供了一种比硒纳米颗粒更具吸引力的替代方案。

近期研究表明，如脂质体和聚合物纳米球等纳米颗粒能够突破叶片角质层和气孔的物理屏障，实现双向运输（从叶片到根系），从而提高养分的生物利用效率。(22) 例如，基于大豆磷脂的脂质体（约100纳米）在番茄植株中的叶面渗透率达到了33%，远高于游离态养分的0.1%，有效解决了铁和镁的急性缺乏问题。(23) 类似地，在大麦（Hordeum vulgare）等作物中的研究表明，使用纳米肥料可使植物组织中的铜积累量增加18倍。(19) 而羟基磷灰石基配方则能增强酸性土壤中的磷吸收。(20) Farshchi等人的研究进一步支持了脂质体在罗勒（Ocimum basilicum L.）叶面施肥中的有效性，发现Fe脂质体处理显著提高了植物中的总铁和Fe2+离子水平，从而改善了作物的营养和品质。(24,25) 此外，脂质体配方还允许将微量营养素与其他生物活性化合物（如抗氧化剂、植物激素或其他矿物质营养素）共封装，为作物营养和抗逆提供了多功能平台。(24,25) 然而，总体上仍存在挑战，包括纳米颗粒生产协议的标准化、潜在毒性的长期评估以及应用参数（如颗粒大小、浓度和与植物物候阶段的同步）的优化。

在这种情况下，可视化纳米载体及其内部成分的吸收途径对于理解其背后的生理机制并优化其作为叶面肥料的实际应用至关重要。先进的成像技术为了解植物组织内的吸收和分布过程提供了宝贵见解。共聚焦荧光显微镜和基于同步辐射的微X射线荧光（μ-XRF）已成为可视化及量化叶面施用纳米载体及其负载物的吸收和分布路径的强大工具，因为它们具有高空间分辨率、无损或微侵袭性、化学特异性、准确的养分定量能力以及互补性。(26?29) 共聚焦荧光显微镜在揭示叶片表面特性如何影响养分吸收方面尤其有效。研究表明，毛状体密度和气孔开口等因素会显著影响叶面施用养分的渗透。例如，高毛状体密度可能增加叶片的疏水性，而气孔则有助于养分吸收。该技术还有助于可视化纳米载体在叶片叶肉中的分布情况，为新型农用化学品输送系统的吸收和转运提供了见解。(28) 在本研究中，将核壳纳米胶囊应用于番茄叶片，结果显示具有优化表面化学性质和尺寸的纳米胶囊在叶面施用后24小时内被吸收进入叶肉。X射线荧光映射也被用来追踪封装示踪金属的分布情况，从而实现了研究养分转运和韧皮部加载效率的双模态方法。(29) Kohay等人(29)比较了将层状双氢氧化物（LDH）纳米颗粒施用于番茄叶片的上下表面对于叶面养分和遗传物质输送的影响，旨在促进植物生长和产量。共聚焦显微镜用于观察LDH纳米颗粒的吸收途径，从而详细观察这些颗粒如何穿透叶片组织，并量化LDH在叶片表面的覆盖率和气孔开口面积，有助于更好地理解施用方法对纳米颗粒输送的影响。此外，该技术还允许分析LDH在角质层中的相对定位，揭示了纳米颗粒在叶片结构内的分布和相互作用情况。

基于同步辐射的μ-XRF结合了高分辨率的植物组织元素分析，为研究通过叶面喷洒施用的微量元素的分布模式提供了有力支持，具有较高的灵敏度，有助于开发和优化叶面肥料施用技术。(30) 最近的研究利用μ-XRF比较了不同形式叶面施用养分（如硫酸锌和锌-EDTA）在植物体内的转运情况，揭示了它们在植物系统内的运动性和效果差异。(26) Arsic等人(31)利用生物成像技术（包括基于同步辐射的方法）可视化了缺磷大麦叶片中的磷酸盐吸收途径。这项研究强调了叶面施用磷对恢复光合作用过程的潜力。我们小组之前的研究展示了基于磷脂酰胆碱的脂质体在小麦植株中吸收硒的新用途，其效率比直接施用水溶液高1.5倍。(32) 然而，关于这种增强吸收及其后续分布的机制，科学文献中仍存在不确定性。在本研究中，我们的目标是利用基于同步辐射的μ-XRF和μ-XANES技术结合共聚焦显微镜，研究24小时内（即叶面施用纳米脂质体制剂后不久）硒和脂质体的吸收、转运和化学形态变化，将脂质体封装的硒与游离态硒进行比较。这项工作侧重于阐明硒在茎部的初始行为，而非长期评估硒的生物强化效果。

2. 材料与方法
2.1. 试剂
磷脂质on 90H（90%氢化大豆磷脂酰胆碱）购自Lipoid GMBH（德国路德维希港）；硒亚酸盐（Na2SeO3）、2-(N-morpholino)乙磺酸（MES）、氯化钙（CaCl2）和Triton X-100购自VWR Internationals LLC（西班牙巴塞罗那）；Tissue-Tek O.C.T.购自Sakura, Finetek USA, Inc.（美国加利福尼亚州托伦斯）；异戊烷、硒代-L-半胱氨酸（SeMet）、硒代-L-半胱氨酸（SeCys）和硒-(Methyl)硒代半胱氨酸盐酸盐（MetSeCys）购自Sigma Merck（德国施内尔多夫）；硒酸盐购自Acros Organics（西班牙巴塞罗那）。
2.2. 脂质体制备
根据先前的研究方法，使用磷脂质on 90H通过脂质膜水合协议制备硒封装脂质体（以下简称P90H），并使用Na2SeO3进行封装。(16) 通过动态光散射（DLS，Zetasizer Nano ZS，Malvern Instruments Ltd.）分析了囊泡的粒径分布、多分散性和Zeta电位。测量在25°C下进行，检测角度为90°，并在制备后24小时及超声处理5分钟（温度55°C以上）后进行。根据Peng等人(33)和Boelter及Brandelli(34)的方法，通过离心（分子量截留值10 kDa）滤膜过滤后的滤液中未封装硒的含量以及ICP-MS（X Series 2，Thermo Elemental）测定P90H脂质体中的硒封装效率和负载能力（详见支持信息中的公式和表征结果）。脂质体在4°C下储存，直至施用于植物。
2.3. 植物生长
种植小麦植株以研究P90H脂质体中含有的硒的吸收情况。使用自来水在湿润的包装纤维素纸上发芽Triticum aestivum L. cv. Bancal（Fitó S.A.，西班牙巴塞罗那）种子，先在黑暗条件下培养5天，然后光照2天。发芽的幼苗被转移到含有半浓度Hoagland营养液的塑料盆中，通过MES缓冲剂维持pH值6.0，并持续通气。(35) 环境条件控制如下：温度18–22°C，相对湿度50–60%，光照强度320 μE·m–2·s–1，光照周期为16小时光照/8小时黑暗。选择水培系统而非传统土壤，以便精确控制养分供应。
2.4. 硒的测定
生长5周后，对小麦植株进行叶面硒处理。植株分别施用1 mM硒亚酸盐封装在脂质体中的制剂（Se–P90H）或1 mM硒亚酸盐水溶液（Se-CK）作为对照。（在整个研究中使用这些术语。）处理一周后，收获水培盆中的植株（每盆3株，每种处理3株）。每株植株浸泡在10 mM CaCl2冰冷却溶液中10分钟以去除表面残留的养分。(35) 将茎和叶与根部分离。Se–P90H处理过的植株的茎部用1% Triton X-100彻底清洗，然后用milli-Q水清洗以去除叶片表面未吸收的硒和脂质体。Se-CK处理过的植株仅用milli-Q水清洗。去除多余水分后，将茎部和根称重并在-20°C下储存以供进一步分析。冷冻样品在Telstar lyoquest中冻干48小时并研磨。研磨后的干燥植物样本（0.4克）用HNO3/H2O2混合物（9:1，v/v）在微波炉（MARS 2，CEM，美国）中消化。消化滤液中的总硒浓度使用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS；Agilent 7900，美国）进行分析。2.5. 基于同步辐射的μ-X射线荧光分析（μ-XRF）提供了叶片和茎部中硒的元素分布和形态，与游离硒进行了比较。在分析中，Se-CK和Se–P90H处理在小麦生长第5周时通过叶片施用，目标是为倒数第二片完全展开的叶子（最新生长的叶子下面的一片叶子），如图1所示。植物的其余部分和水培盆被塑料覆盖，以防止喷剂颗粒沉积。施用后24小时，切下叶片及其对应的茎部进行短期吸收研究。组织按照先前描述的步骤清洗，用于分析的样本选自叶片后部区域，远离施用部位，如图1所示。

图1：Diamond同步辐射设施中进行μ-XRF分析的处理应用和样本选择方案。

为了获得用于μ-XRF测量的薄片，植物样本在切除后立即冷冻。样本被嵌入OCT化合物中，置于塑料冷冻模具（25毫米×20毫米×5毫米，Sakura，Finetek USA, Inc.）中，并通过浸入预冷却的异戊烷（用液氮冷却）迅速冷冻。使用冰切片机（Leica CM3050S，Leica Biosystems，西班牙）制备厚30微米的薄片，立即安装到蓝宝石盘上并储存在-80°C直至分析。

μ-XRF图谱和μ-XANES测量在Diamond Light Source（Didcot，英国）的I18光束线上进行，使用Si(111)双晶单色仪和一对Kirkpatrick-Baez聚焦镜，以调整光束大小以匹配实验要求。使用4元素硅漂移探测器（Vortex）收集样品的荧光信号。样品固定在蓝宝石盘上，并放置在液氦冷冻罐内的铝样本架上。测量在5 K下进行，以最小化辐射引起的损伤。从μ-XRF图谱中确定硒、钾、锰和锌在植物组织中的空间分布，激发能量为Se–K边的13,450 eV。光束大小聚焦至3 μm，图谱的采集步长为10 μm。采集时间设定为每点0.05秒。μ-XRF图谱使用DAWN软件处理，并使用RGB混合工具生成多色图谱，该工具允许合并不同元素的μ-XRF图谱。调整强度级别以优化元素可视化。

为了解释空间异质性，在植物组织（叶片和茎部）中检测到硒的三个不同位置（图3A）以荧光模式获取μ-XANES光谱，并将它们合并。光谱归一化和形态分析使用Demeter软件包中的Athena程序进行。2.6. 共聚焦显微镜研究

通过将荧光素（23）（以荧光素二乙酸酯形式；FDA；Sigma-Aldrich，德国）以最终浓度1 mM加入溶解在CHCl3中的脂质溶液来制备荧光标记的脂质体，在薄膜形成过程中。溶剂蒸发后，含有FDA的脂质膜用水缓冲液水化形成囊泡，随后通过超声波处理减小囊泡大小并均匀悬浮液。通过10 kDa MWCO离心机离心去除游离和非封装的荧光素，然后通过超声波处理重新悬浮至所需浓度，再悬浮在MES缓冲液中。纯化的荧光标记脂质体用于进一步分析。对于叶片施用，将五滴（每滴20 μL）荧光标记的脂质体悬浮液放置在最后一片完全展开叶子的上表面中心。施用后，植物在相同的控制生长条件下置于完全黑暗中24小时（三个重复实验加上一个未经处理的对照组）。这段时间后，切下处理过的叶子，并用50%（体积比）丙酮洗涤，然后用milli-Q水洗涤以去除任何残留的表面相关荧光。

直接在切下的叶片组织的两个区域（切成1.5厘米×2厘米的矩形切片）上评估脂质体的渗透情况，分别用于对照组和处理组的样本（图4），这些区域包括边缘区和中心切割区。共聚焦激光扫描显微镜实验使用Axio Observer 7显微镜（Zeiss LSM 980 Airyscan 2）进行，方法按照Zhu等人的描述进行，并对成像条件进行了调整以适应当前样本。通过使用20倍物镜沿叶片表面顺序扫描获取Z-stack图像，光学切片之间的步长为1 μm。荧光素在495 nm处激发，发射光在491至562 nm之间收集，而叶绿素自荧光则在红色通道中检测。分析在切除后立即进行，以防止组织脱水。图像使用Zen软件处理。

3. 结果与讨论

3.1. 硒吸收的μ-XRF图谱和μ-XANES形态分析
μ-XRF测量允许对植物组织进行元素图谱分析，从而直接观察小麦植物不同部位的硒分布。图2所示的μ-XRF图谱显示，在施用后24小时，硒在叶片后方区域积累（见图1）。由于μ-XRF同时提供了植物中积累的多种元素的空间分布信息，在我们的研究中，使用不同分析元素的RGB图谱来帮助可视化分布模式并评估它们的共定位情况。如图2所示，钾分布在叶片整个区域，揭示了内部结构，而硒主要位于叶片的外边缘。所有获得的图谱见支持信息图S3。

图2：同步辐射μ-XRF图谱结果：小麦（Triticum）叶片横截面后部区域大致分析区域的示意图（A）。暴露于Se-CK（B）和Se–P90H（C）后24小时的小麦叶片横截面的元素图谱。底部面板（从左到右）显示了元素硒（红色）和钾（绿色）的两色合并图谱，随后是对应于白色高亮区域的硒的放大详细图谱。

X射线荧光图像也显示了小麦叶片中硒分布的不均匀性，从上表面延伸到下表面表皮。由于Se_K图谱被调整到相同的相对比例，Se-CK样本（图2A）中的硒分布看起来更广泛，并且荧光强度高于Se–P90H处理过的植物（图2B），这表明封装在P90H脂质体中的硒需要更多时间来吸收、释放并转运到植物细胞中。

根据ICP-MS分析，施用1周后，Se-CK处理的小麦茎中的总硒浓度为1.6 ± 0.2 μg Se·g–1 DW，Se–P90H处理的小麦茎中的总硒浓度为2.5 ± 0.4 μg Se·g–1 DW，表明脂质体封装增强了植物的总硒吸收。

与这些发现一致，一些研究表明，封装的化合物会逐渐从其载体中释放并被植物叶片吸收，持续时间较长，从而确保持续释放并提高吸收效率。例如，纳米生物肥料胶囊在30天内显示出持续的NPK释放，不同营养素的释放量分别达到33.2%、47.8%和68.3%，表明释放速度比游离营养素慢。在由植物来源的脂质组成的脂质体的情况下，活性成分的吸收和释放随时间显示，在施用后24小时，有7-19%的剂量被吸收，72小时后增加到27-33%。在这项研究中，装载了铕（一种示踪分子）的脂质体显示，随着距离施用点的距离增加，浓度逐渐下降，表明在24-72小时内逐渐分布在植物体内。

μ-XANES用于研究检测到硒的区域中硒的化学转化。图3B显示了Se-CK处理的比较，以Se–P90H样本作为代表案例进行研究，因为Se–P90H样本的光谱仅具有定性信息（见支持信息图S2）。

图3：结合了同步辐射μ-XRF和μ-XANES的结果：两种不同叶片暴露于Se-CK（A）的外表面区域的Se_K的μ-XRF图像，以及Se参考物质的标准化Se K-edge XANES图像和在A中标记为黄色的区域的μ-XANES合并图。

Se-CK的μ-XANES光谱谱型不同于用于生物强化的无机硒酸盐物种，而类似于有机硒物种的谱型，因为该谱线在12657 eV处有一条白线，类似于含有C–Se–C（例如SeMet和MetSeCys）或C–Se–Se-C（例如SeCys）键的有机参考物质。LCF分析的结果（表S2）确认硒以有机物种存在，根据参考物质，这些物种可能是SeMet（72.6%）、SeCys（20.6%）和MetSeCys（11.7%）。这些结果与当前的研究结果一致，强调SeMet通常是富硒主要作物中的主要有机形式。无机硒迅速高效地转化为有机物种是值得注意的，因为硒是通过叶面以硒酸盐（SeIV）形式施用的，它可以很容易地还原为硒化物，然后通过硫同化途径掺入硒氨基酸。然而，其他硒物种，如硒酸盐（SeVI），在吸收之前需要额外的酶促还原步骤，因此通常代谢较少。这一发现突显了小麦叶片在叶面施用后吸收硒的高代谢能力。

3.2. 小麦叶片的共聚焦荧光成像以研究脂质体的渗透情况
从处理过的小麦叶片的两个区域（近边缘区和切割区，见图4-方案）获得了共聚焦荧光图像，包括对照组和处理组样本。监测了两种不同的荧光信号：荧光素探针和叶绿素，以可视化叶片内部结构。图像从叶片的上表面相同深度获取。在对照组样本中，只观察到红色结构（图4a,b），对应于植物细胞内的叶绿体。在处理过的样本中（图4c,d），在叶片切片的外部和内部边缘都检测到绿色荧光，表明存在荧光素。更详细的3D图像（图5）显示了叶片内部围绕气孔的椭圆形荧光素结构。

图4：小麦叶片的共聚焦荧光显微镜图像：对照组植物（A）的外部和内部区域（B），以及用荧光素标记的脂质体处理的植物（D）的外部和内部区域（C）。脂质体以绿色显示，叶绿体以红色显示。

图5：暴露于荧光素标记的脂质体的小麦叶片的共聚焦荧光显微镜3D图像。分析区域对应于叶片的外部部分。

在小麦叶片中，叶绿体主要位于叶肉细胞内，靠近连接气孔的细胞间隙，确保有效的气体交换和光合作用。这些细胞分布在叶片组织中，负责捕获光能并通过光合作用将其转化为化学能。此外，叶绿体也可以在束鞘细胞中找到，特别是在C3植物（C3光合途径）中，它们在光合作用和代谢功能中起作用。当前的结果表明，荧光素标记的脂质体在处理后24小时内与叶片表面和表皮组织相关联，并到达了上表面表皮下的叶肉组织，可能涉及与气孔相关的途径；然而，根据目前的共聚焦数据，不能排除角质层运输的作用。Arsic等人（31）也报告了类似的发现，他们观察到大麦的维管束中51V和31P的强烈信号强度，表明施用的离子在24小时内从叶片表面快速移动到植物导管中，这是通过激光消融-电感耦合等离子体质谱法（LA-ICP-MS）检测到的。这两种元素也在表皮的多个部位以及气孔周围积累，这表明这些区域可能是离子进入的潜在途径。由于内在因素（如细胞质中的脂肪酶）和渗透不稳定性通常会导致脂质体膜破裂所需的时间较长（至少48小时）（参见Jahan等人的研究（46）），因此在我们的研究中脂质体结构可能尚未分解，从而形成了观察到的椭圆形。从脂质体中释放出来后，硒（Se）很可能被输送到位于叶肉组织中的维管系统中（47），在那里进行分布和代谢。对小麦叶片进行的共聚焦显微镜分析有助于研究脂质体进入植物组织的机制。结果表明，封装在脂质体内的荧光素主要积聚在气孔附近，这表明这些结构是主要的进入途径。一旦进入叶片组织，脂质体可以将其内容物释放到植物的维管系统中，促进其细胞内的分布。这项研究为利用纳米封装技术与叶面施用相结合的方法提高小麦的硒含量提供了新的见解。先进的成像技术（μ-XRF、μ-XANES和共聚焦显微镜）揭示了脂质体通过植物表面结构被吸收的情况，以及硒在叶片边缘的积累，并在24小时内转化为有机形式的过程。与游离硒相比，封装硒的吸收速度较慢，这突显了纳米载体在控制养分输送方面的潜力。这些结果有助于更深入地了解硒的运输机制，并为未来的研究奠定了基础。进一步的研究应侧重于长期释放型研究，以更好地观察硒向其他植物组织和可食用部分的迁移过程。在植物生物强化研究中使用先进的科研工具（如基于同步辐射的μ-XRF和共聚焦显微镜）可以显著改进养分输送系统的设计及其应用，从而推动农业实践的发展，使其比传统的施肥方法更加高效且环保。