通过实时核酸酶消化技术对高通量适配体进行表征

《Journal of the American Chemical Society》：High-Throughput Aptamer Characterization via Real-Time Nuclease Digestion

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适配体是一种能够以高亲和力结合特定分子的寡核苷酸，已成为多种应用中流行的生物识别元件。虽然通过体外筛选发现适配体的方法已经变得更加简单，但仍然难以以准确和高通量的方式准确表征适配体的结合特性。在这里，我们介绍了一种改进版的新一代外切酶消化测定方法，用于并行且无标记地筛选适配体-配体相互作用。我们的新型实时外切酶（RT-Exo）测定方法的通量比上一代方法高出几个数量级，同时所需劳动力和资源消耗也大大减少。RT-Exo测定使用荧光适配体作为信号报告分子，实时监测适配体的外切酶消化过程。样品制备并加载到微孔板后，读取器可以自动监测消化过程，每个样品可生成数百个数据点。我们的荧光报告分子在多种缓冲液和盐条件下都能正常工作，并且我们已经使用多种结构不同、结合亲和力各异的适配体验证了RT-Exo的性能。最后，我们通过筛选突变体展示了RT-Exo的实用性——仅凭一名实验人员即可完成120种芬太尼类似物的适配体结合分析。随着RT-Exo测定方法通量、精度和简便性的显著提升，适配体表征过程应该会变得更加高效和便捷。

**引言**
适配体是一种能够以高亲和力和特异性结合离子、小分子和蛋白质等特定目标的寡核苷酸。(1,2) 它们通常被用作生物传感器中的特异性识别元件、功能性材料的设计以及治疗剂。(3,4) 每种应用都需要具有适当结合亲和力、特异性和动力学的适配体。适配体是通过诸如指数富集法（SELEX）等从随机寡核苷酸文库中筛选出来的。首先，一个包含10^12–10^15个独特序列的文库经过多轮体外筛选以结合目标分子，从而得到约10^2–10^5个适配体候选物。随后对这些候选物进行高通量DNA测序以确定每个适配体的序列；测序数据集可以通过生物信息学工具进一步分析以识别潜在的候选序列。然而，即使经过这样的分析，确定最适合特定应用的适配体通常仍需要测量众多候选序列的结合亲和力和特异性。传统的生物物理方法（如等温滴定量热法、表面等离子体共振、微尺度热泳和生物层干涉测量）可以提供定量且可靠的适配体-配体结合热力学和动力学数据。(5?9) 但这些方法的通量非常低。例如，确定30个适配体候选物与20种不同配体的结合相互作用——这是我们实验室常做的任务——可能需要数月的连续工作。虽然已经开发出一些更简单的方法来实现更高通量的筛选，但这些方法存在明显的缺点。例如，链置换测定需要荧光团/淬灭剂标记的寡核苷酸，这使得同时表征多个不同适配体的成本过高。(10) 染料置换测定可以在不标记适配体的情况下筛选其结合特性，(11) 但这些方法并不具有广泛的通用性，因为有些适配体无法结合染料探针并在配体结合后释放染料。

为了解决上述问题，我们最近开发了一种基于外切酶的无标记测定方法来筛选适配体-配体结合相互作用。(12,13) 在这种测定中，适配体在有无配体的情况下都会被外切酶消化。非结合序列容易被外切酶消化，而结合配体的适配体则表现出与其配体亲和力相关的抗消化能力。我们和其他研究者已经使用这种外切酶消化测定方法表征了数百种具有不同序列和二级结构的适配体与多种物理化学性质和不同结合亲和力的小分子及蛋白质配体的结合情况。(14) 然而，这种方法劳动强度大且资源消耗高，新手操作时的样本通量通常低于10个，而有经验的人员也只能达到30个左右。

在这里，我们介绍了该测定的第二代版本——实时外切酶（RT-Exo）测定方法，它在准确性、效率、精度和样本通量方面都有显著提升。我们的RT-Exo测定方法将目标适配体与荧光报告分子结合，后者能够以高时间分辨率、精度和准确性持续监测适配体的消化过程。在外切酶作用下，结合配体的适配体不会被消化，从而保持荧光报告分子的完整性和活性；而未结合的适配体及其相关荧光探针则会被完全消化，导致荧光消失。RT-Exo测定方法的通量高于第一代方法，并且操作简单，只需混合试剂并使用微孔板读取器进行读取。作为RT-Exo方法多功能性的初步证明，我们分析了8种不同适配体与数十种配体的结合情况。为了展示RT-Exo如何突破适配体表征的通量限制，我们进一步在单次实验中分析了结合芬太尼的适配体与120种芬太尼类似物的结合情况。最后，我们展示了RT-Exo可用于进行突变体研究，以确定结构-活性关系并识别具有不同结合特性的变体。我们的研究结果表明，RT-ExO是一种通用且强大的工具，能够灵敏高效地识别适用于多种应用的适配体。

**材料与方法**
所有寡核苷酸均购自Integrated DNA Technologies公司，经过标准脱盐纯化处理。本研究中使用的序列列在支持信息（SI）中的表S1中。外切酶I（大肠杆菌）（Exo I）（20 U/μL）和外切酶III（大肠杆菌）（Exo III）（100 U/μL）购自New England Biolabs公司。10X磷酸盐缓冲盐水（PBS）和分子生物学级水购自Corning公司。Trizma预配晶体（pH 7.4）、HEPES、牛血清白蛋白（BSA）、DFHBI-1T、5 M氯化钠溶液、1 M氯化镁溶液、氯化钾、十二烷基硫酸钠、3,3′-二乙基硫代氨基氰化物、腺苷、腺苷5′-一磷酸钠盐、腺苷5′-二磷酸钠盐、咖啡因、(1S, 2S)-(+)-伪麻黄碱、多巴胺HCl、布洛芬钠盐、普鲁卡因HCl、苯佐卡因、奎宁半硫酸盐一水合物、苯海拉明HCl、对乙酰氨基酚、血清素HCl、D-乳糖一水合物、D-甘露醇、纳洛酮HCl二水合物和纳曲酮HCl购自Sigma-Aldrich公司。二甲基亚砜（DMSO）、甲酰胺、0.5 M EDTA、SYBR Gold、腺苷5′-三磷酸钠盐三水合物、肌苷5′-三磷酸三钠盐水合物、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、鸟苷5′-三磷酸（GTP）、胞苷5′-三磷酸（CTP）、尿苷5′-三磷酸（UTP）和dATP购自Thermo Fisher Scientific公司。可卡因HCl、苯佐卡因、甲氧麻黄酮HCl、海洛因HCl、羟考酮HCl、(+)-甲基苯丙胺HCl、(±)-甲基苯丙胺HCl、(±)-3,4-亚甲基二氧吡咯戊酮（MDPV）HCl、3,4-MDMA HCl、(±)-美沙酮HCl、(±)-左旋甲基苯丙胺HCl、芬太尼HCl、甲卡西酮HCl、α-吡咯里啶戊酮（α-PVP）HCl、戊酮HCl、乙酮HCl多晶型B、顺式曲马多HCl、(-)-尼古丁、吗啡硫酸盐一水合物、可待因磷酸盐一水合物、Δ9-四氢大麻酚（THC）、(±)-11-诺-9-羧基-Δ9-THC（THC–COOH）、Δ9-THC羧酸A（THCA）、四氢大麻酚（THCV）、大麻二酚（CBD）、大麻二酚酸（CBDA）、大麻酚酸（CBGA）、UR-144、XLR-11、AB-FUBINACA、阿普唑仑、地西泮、氯硝西泮和芬太尼类似物筛选试剂盒购自Cayman Chemical Company。东莨菪碱氢溴酸盐三水合物和罂粟碱HCl购自Acros Organics公司。利多卡因HCl一水合物和氯米帕明购自Alfa Aesar公司。左旋咪唑HCl购自MP Biomedicals公司。氟西汀HCl、诺斯卡品HCl一水合物和阿莫沙平购自TCI America公司。去离子水（DI）来自Milli-Q EQ 7000超纯水净化系统，电导率为18.2 MΩ×cm。

**在不同缓冲液条件下荧光适配体的荧光测定**
通过记录含有5 μM DFHBI-1T的溶液以及每种适配体1 μM的溶液的荧光，确定了荧光适配体Lettuce-4bp、Lettuce-mini、R91和R91–4bp激活DFHBI-1T荧光的能力。所有实验中，首先在无盐缓冲液中制备2×适配体溶液，加热至90 °C 10分钟，然后立即在冰上冷却。随后向适配体溶液中加入盐和BSA。2× DFHBI-1T通过用1×缓冲液稀释储备溶液来制备。最后，将适配体与染料以1:1的比例混合，将75 μL该溶液加入384孔平底黑微孔板（Nunc）的孔中。所有荧光测量均使用Tecan Spark微孔板读取器进行，激发波长为460 nm，发射波长为505 nm，步长为5 nm。各实验使用的缓冲液列在SI中的表S2中。

**DFHBI-1T交叉反应性测试**
一组19种小分子结合适配体（最终浓度：1 μM）与DFHBI-1T（最终浓度：5 μM）在缓冲液中反应，以评估它们激活DFHBI-1T荧光的能力。每种适配体的缓冲液条件列在SI中的表S3中。首先将每种适配体在无盐缓冲液中以2×浓度溶解，加热至90 °C 10分钟，然后立即在冰上冷却。随后向适配体溶液中加入盐和BSA。然后将适配体与2× DFHBI-1T（用1×缓冲液稀释）以1:1的比例混合，将75 μL每种样品加入384孔微孔板的孔中。荧光测量方法如上所述。

**荧光亲和力测定**
进行荧光测定以确定R91–4bp及其相关衍生物与DFHBI-1T的结合亲和力。首先按照上述方法在缓冲液中制备1.01×浓度的适配体（条件列在SI中的表S4中）。然后，将99 μL适配体与1 μL 100× DFHBI-1T（溶于纯DMSO）混合（最终浓度：1 μM适配体和0–50 μM DFHBI-1T）。将75 μL每种样品加入微孔板的孔中，并按上述方法记录荧光。从含有DFHBI-1T的对照样品的荧光中减去背景荧光。通过绘制荧光强度与染料浓度的关系图，并使用2025 Origin PRO软件用Hill方程拟合数据集，确定染料-适配体复合物的解离常数（KD）。对于与R91–4bp结合的适配体，以类似方法确定其与DFHBI-1T的结合亲和力，但在此过程中，先在每种适配体存在的情况下与其目标分子孵育5分钟后再进行结合测定。

**等温滴定量热法（ITC）**
所有ITC实验均在MicroCal PEAQ-ITC仪器上进行，温度为23 °C，使用每种适配体的相应缓冲液。每次实验中，首先将母体适配体或适配体-R91–4bp衍生物在无盐缓冲液中制备，加热至90 °C 10分钟，然后迅速冷却至室温；随后向溶液中加入盐。将适配体加入细胞中，将配体加入注射器中。具体运行参数列在SI中的表S5中。每次运行包括一次0.4 μL的冲洗注射，随后进行19次连续的2-μL注射。对于某些衍生物，需要进行两次滴定，即在初次滴定后不排空样品细胞，重新加载注射器并开始另一次滴定。所有数据均使用MicroCal PEAQ-ITC分析软件进行分析（数据总结在SI中的表S6中）。

**R91–4bp的传统外切酶消化测定**
R91–4bp（最终浓度0.5 μM）在无盐缓冲液中制备，加热至90 °C 10分钟，然后立即在冰上冷却；冷却后加入盐和BSA。然后在1×缓冲液中制备DFHBI-1T（最终浓度：0–25 μM，反应混合物中占1% v/v），并将其加入反应混合物中。将25 μL该溶液在25 °C的干燥浴中孵育30分钟。之后，向适配体溶液中加入25 μL外切酶混合物（最终浓度：0.05 U/μL Exo I和0.025 U/μL Exo III）以启动消化。在预定义的时间点收集5 μL反应混合物样品，并与30 μL淬灭溶液（最终浓度：12.5%甲酰胺、21.4 mM EDTA、1× SYBR Gold，pH调节至7.4，使用Tris、磷酸盐缓冲盐水或HEPES）混合。使用Tecan M1000 PRO微孔板读取器进行荧光测量，激发波长为495 nm，发射波长为537 nm。消化过程的时间进程图是通过将每个时间点的荧光值归一化到其起始值来构建的，并确定了每个样本的曲线下面积（AUC）。(13) R91–4bp的抵抗值是使用公式(AUCT – AUC0)/(AUC0)计算得出的，其中AUCT和AUC0分别表示有和没有DFHBI-1T时的AUC。传统的Exonuclease消化测定使用SYBR Gold，第一代exonuclease测定的实验程序示意图见SI，图S1。适配体（最终浓度：200 nM）溶解在无盐缓冲液中，加热至90°C 10分钟，然后立即在冰上冷却；之后加入盐和BSA。接着，将1×缓冲液中的目标物与适配体混合。随后，向适配体溶液中加入1×缓冲液中的SYBR Gold（最终浓度1×）。以类似的方式制备了一系列不含SYBR Gold的对照样本。将30 μL的这种反应混合物加入384孔微孔板的孔中，并在22°C下孵育30分钟。之后，向反应混合物中加入30 μL的exonuclease混合物（最终浓度：0.05 U/μL Exo I和0.025 U/μL Exo III）以启动消化。在预定义的时间点，向孔中加入14 μL的淬灭溶液（最终浓度：14.5%甲酰胺和25 mM EDTA）以停止消化。消化期结束后，向每个样本中加入1.5 μL的SYBR Gold，使其最终浓度达到1×。按照上述方法收集并计算荧光测量值和消化抵抗值。

实时Exonuclease（RT-Exo）消化测定实验设置示意图见SI，图S2。适配体构建物在其相应的缓冲液中制备（最终浓度1 μM），加热至95°C 10分钟，然后在冰上冷却，之后加入盐和BSA。然后向适配体-配体混合物以及DFHBI-1T（最终浓度：5 μM）中加入不同浓度的配体。还制备了一个不含配体的对照溶液。对于每个适配体，准备了四个样本：(1) 仅含染料的样本，(2) 含酶的染料样本，(3) 不含酶的适配体和染料样本，(4) 含酶的适配体和染料样本（样本组成和设置见SI，图S3）。具体来说，将37.5 μL的染料-配体对照样本（对于样本1和2）和适配体-染料-配体混合物（对于样本3和4）分别两次加载到384孔微孔板的孔中。这些样本在22°C下孵育30分钟，在此期间在1×缓冲液中制备2× exonuclease混合物。之后，向包含样本1和3的孔中加入37.5 μL的1×缓冲液，向包含样本2和4的孔中加入37.5 μL的exonuclease混合物。将微孔板离心120秒（1,200 rcf）后，使用TECAN Spark微孔板读取器进行扫描，该读取器通过TECool模块保持仪器温度在22°C。每隔20–150秒（取决于样本数量）测量溶液的荧光，激发波长为460 nm（带宽：5 nm），发射波长为505 nm，持续6小时。最终酶浓度为0.1 U/μL Exo I和0.025 U/μL Exo III，有两个例外；对于PHEapt1构建物，酶浓度减少了75%，对于MNS4.1构建物，两种酶的浓度增加了3倍。数据分析如下进行（详见SI，图S4）。首先，我们从样本3和4（含适配体的样本）的荧光值中减去样本1和2（不含适配体的对照样本）的荧光值。然后，通过将每个时间点的荧光值除以实验开始时的初始荧光值来归一化这些荧光值。接下来，根据样本3的荧光值归一化样本4的荧光值，以考虑实验过程中DFHBI-1T荧光的漂移。在此归一化之后，使用之前描述的AUC计算抵抗值。由于RT-Exo测定的结果不仅取决于适配体-配体结合，还取决于exonuclease活性、探针稳定性和荧光团行为，因此抵抗值只能在相同的适配体之间进行比较。对于每个实验，都包括E1-R91–4bp作为对照样本，以评估不同试验之间酶浓度等因素的变化。

Exonuclease消化测定的工作原理
Exonuclease消化测定能够以无标记和可并行化的方式测量适配体的相对亲和力和特异性。(15) 在这里，使用Exonuclease I（Exo I）和Exonuclease III（Exo III）的混合物在有无配体的情况下消化适配体，这两种酶分别消化单链和双链DNA。无配体的适配体消化相对不受阻碍（SI，图S5A），然而，有配体的适配体消化受到极大抑制（SI，图S5B），因为这些酶无法结合和消化其配体结合形式的适配体。到目前为止，我们通过使用核酸染色染料SYBR Gold在消化过程的不同时间点测量反应混合物中的适配体浓度来监测消化过程。适配体-配体结合的强度通过不同的指标进行测量，例如有无配体时的反应半衰期差异，(16) 或整个实验过程中对消化的累积抵抗差异。(13) Exonuclease测定的通用性相当广泛。我们和其他人已经使用这种测定来表征数百种具有不同结构的DNA适配体与不同化学性质的蛋白质和小分子配体在具有不同离子强度和温度的反应条件下的结合。(14) 尽管exonuclease测定具有优势，但它们也有一些缺点，限制了其更广泛的可用性和通量。首先，该测定繁琐、劳动密集且容易出错。这些问题源于在消化过程中必须频繁监测适配体浓度。这需要从反应混合物中取出多个等分样品，在预定义的时间点淬灭酶促反应，用SYBR Gold染色剩余的适配体，最后量化溶液的荧光。这些步骤中的任何错误都可能累积，从而降低收集数据的准确性和精确度。此外，测定的通量受到限制，因为每个适配体至少需要两个样本——一个无配体的样本和一个有配体的样本——并且至少需要收集8–10个时间点才能稳健地分析整个消化过程。虽然表征一个适配体-配体对是直接的，但使用这种测定同时筛选多个配体对在技术上具有挑战性且资源密集。例如，筛选六个适配体与一个配体需要一个12通道微量移液器和一个完整的96孔微孔板。然而，我们的适配体筛选是在体外选择后进行的，通常会识别出数百个适配体候选者，这通常比这更全面，涉及多达40–50个适配体和30–40种不同的配体。因此，简化这种exonuclease表征方法可以大大减少测定工作量和资源需求，并提高准确性、可重复性和通量。

确定连续监测Exonuclease消化的可行性
我们认为，实现exonuclease消化过程中适配体降解的连续实时监测可以避免上述许多挑战。为此，我们首先评估了SYBR Gold是否可以直接加入反应混合物中，并作为信号报告器在消化过程中连续监测适配体浓度。作为测试，我们使用了DNA适配体E1，它与芬太尼的解离常数（KD）为80 nM。(17) 我们首先以传统方式进行了exonuclease消化测定，在没有或存在100 μM芬太尼的情况下消化适配体，在预定义的时间点取样，并用SYBR Gold染色样品。在没有芬太尼的情况下，适配体在1小时内大部分（约90%）被消化，而在存在芬太尼的情况下，即使经过3小时，适配体消化也受到极大抑制（SI，图S6A）。接下来，我们在反应混合物中使用SYBR Gold进行了相同的测定，观察到无论是否有芬太尼，E1的消化都受到强烈抑制，即使经过3小时，适配体消化的程度也没有明显差异（SI，图S6B）。这很可能是因为SYBR Gold本身会与DNA结合，这可能会独立于E1是否与其目标结合而阻碍适配体的消化。我们还使用DNA适配体A23T进行了相同的实验，它与腺苷的解离常数为18 μM。(16) 与E1一样，我们观察到在没有和有目标的情况下适配体消化程度的明显差异（SI，图S6C），但当SYBR Gold包含在exonuclease反应混合物中时，再次观察到对消化的抵抗独立于目标（SI，图S6D）。这些结果表明SYBR Gold不适合连续监测exonuclease消化过程的进展。

将荧光适配体作为RT-Exo测定的信号报告器的实现
理想的用于连续实时监测适配体消化的探针必须能够报告适配体在消化过程中是否完整或降解，并且不应显著干扰适配体的功能/结构、改变exonucleases的活性或与配体相互作用。我们假设荧光DNA适配体Lettuce（18）适合这一目的，因为它可以与有机小分子染料DFHBI-1T结合。(18) DFHBI-1T本身荧光较弱，但当与Lettuce结合时，由于染料分子内旋转的限制，染料的荧光显著增强。我们设计了一种结构，其中感兴趣的适配体的5′末端通过poly (T)连接器与Lettuce适配体的3′末端连接，形成一个可以在exonuclease消化过程中实时监测其完整性的自信号适配体构建物（图1A）。最初，适配体-Lettuce复合物与DFHBI-1T结合，产生高荧光（图1B，中间）。在添加exonuclease且没有配体的情况下，整个构建物被完全消化；Lettuce逐渐耗尽导致未结合的DFHBI-1T水平增加，从而使溶液的荧光随着适配体消化的进行而降低（图1B，左侧）。然而，在有目标的情况下，适配体-配体结合阻止了适配体的消化，保持了Lettuce适配体，导致荧光持续较高（图1B，右侧）。

图1
图1. 使用荧光适配体R91–4bp作为实时exonuclease消化测定的通用信号报告器。(A) 自信号适配体构建物的工程，其中R91–4bp通过多聚胸苷连接器与任意适配体连接。(B) RT-Exo测定的工作原理。(C) R91–4bp的二级结构。检查R91–4bp在水缓冲液中的荧光特性，其中含有不同浓度的(D) DMSO、(E) KCl、(F) NaCl、(G) MgCl2（在低盐缓冲液中）和(H) MgCl2（在1X PBS中）。(I) BSA对R91–4bp荧光激活的影响。(J) 在不同缓冲条件下，R91–4bp和其他多种DNA适配体在DFHBI-1T存在下的荧光功能。

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Lettuce的一个主要缺点是适配体长度为99个核苷酸（nt）（SI，图S7A），这使得生产适配体-Lettuce复合物（对于典型的46–52 nt的适配体来说超过130 nt）在技术上具有挑战性，因为这种长寡核苷酸的合成产量很低。因此，我们评估了是否可以截短Lettuce以减小其大小而不影响其功能。我们设计了两种构建物，一种是将Lettuce的初始茎减少到4个碱基对（Lettuce-4bp，58 nt）（SI，图S7B），另一种是截短适配体中间的一个内部茎（Lettuce-mini，45 nt）（SI，图S7C）。我们测试了这两种Lettuce变体在其选择缓冲液中结合和激活DFHBI-1T的能力，并观察到Lettuce-4bp在4小时后仅使染料荧光增加了2.9倍。相比之下，Lettuce-mini使染料荧光增加了9倍，尽管这种适配体与染料的结合相对较慢，需要4小时才能完成（SI，图S8）。我们还研究了同一研究小组发现的另一种荧光适配体的适用性，该适配体被称为R-9-1（以下简称R91）。(18) 由于R91的长度为71个核苷酸（SI，图S7D），我们通过将其起始茎段缩短至4个碱基对（R91–4bp，38个核苷酸）来对其进行截短（图1C）。我们进一步评估了R91和R91–4bp结合并激活DFHBI-1T荧光的能力，并观察到这两种适配体都能使荧光强度相对于单独使用染料时增加8倍（SI，图S8）。鉴于其较短的长度以及能够快速激活DFHBI-1T荧光且信噪比高，我们选择了R91–4bp作为后续适配体表征实验的探针。

接下来，我们考察了R91–4bp在不同缓冲条件和离子强度下的功能表现，以确保它可以用于表征各种适配体。作为起点，我们使用了发现R91时的缓冲条件：40 mM HEPES缓冲至pH 7.4（pH调节使用的是约20 mM的NaOH），100 mM KCl，1 mM MgCl2，以及0.1%（v/v）DMSO。由于某些疏水分子需要更多的有机共溶剂，我们首先研究了不同浓度的DMSO对R91–4bp性能的影响。当DMSO浓度从0.1%增加到5.0%（v/v）时，R91–4bp结合的染料荧光强度增加了高达15%，而单独的DFHBI-1T荧光强度没有显著变化（图1D；SI，图S9）。这些结果表明，R91–4bp在0.1–5.0%的DMSO浓度下是兼容的，适合用于表征最疏水的配体。我们还观察到，当缓冲剂HEPES被Tris替换时，R91–4bp仍能保持其功能（SI，图S10）。

随后，我们研究了不同阳离子浓度对R91–4bp功能的影响。我们首先测试了含有不同浓度KCl（0–100 mM）的选择缓冲液，发现在没有K+的情况下，该适配体对DFHBI-1T的荧光激活作用很小，这证实了K+对其功能是必需的（图1E）。随着KCl浓度的增加，R91–4bp的荧光激活能力呈单调增加，在≥20 mM KCl时达到饱和。R91与Lettuce具有73%的序列同源性，这表明这两种适配体可能具有相似的结构。最近生成的Lettuce高分辨率晶体结构显示，该适配体通过结合两个K+离子形成双层G-四聚体（19），这也可能解释了这种阳离子对R91功能的重要性。在后续实验中，我们使用4 mM KCl以确保R91–4bp保持荧光功能。相比之下，Na+既不在选择缓冲液中也不在Lettuce的晶体结构中出现（18,19），因此我们假设这种阳离子对R91–4bp的功能也不是必需的。因此，我们接着研究了不同NaCl浓度对R91–4bp功能的影响。尽管适配体在没有Na+的情况下也能发挥作用，但在约50 mM NaCl的存在下其功能略有提升（图1F）。然而，当NaCl浓度增加到200 mM时，我们观察到荧光强度降至最大值的50%。这可能是由于在较高离子强度下适配体的灵活性增加（20），从而减弱了其与DFHBI-1T的相互作用。Lettuce的晶体结构表明，其磷酸二酯骨架上至少结合了三个Mg2+离子，使得适配体能够形成相对紧凑的结构（19）。这表明Mg2+也可能对R91–4bp的功能至关重要。因此，我们在低（20 mM）和高NaCl浓度（140 mM）范围内评估了Mg2+的影响。在这两种情况下，没有Mg2+时R91–4bp都无法发挥作用（图1G,H）。在低NaCl条件下，即使在低（0.5 mM）MgCl2浓度下，R91–4bp也能达到接近最大值的荧光强度（图1G）。相比之下，在高NaCl条件下，R91–4bp对MgCl2的需求更大，荧光强度在0–2 mM Mg2+之间稳步上升，并在5 mM时达到饱和（图1H）。因此，在涉及低NaCl的后续实验中，我们使用了0.5 mM MgCl2，而在高NaCl条件下使用了1 mM MgCl2。总体而言，这些实验表明R91–4bp能够在各种缓冲成分和离子强度下发挥作用，且需要低浓度的K+和Mg2+才能正常工作。

最后，我们评估了R91–4bp在BSA存在下的功能。BSA是一种常用的阻断剂，用于外切酶消化实验中，以防止生物分子与塑料器皿结合并保持外切酶的活性。我们测量了R91–4bp在含有1.5 μM BSA的四种不同缓冲液中的荧光强度（组成见SI，表S2）。总体而言，我们观察到BSA的存在使DFHBI-1T的荧光强度降低了10%，可能是由于BSA隔离并使部分染料分子失活（图1I）。

接下来，我们进行了一系列实验，以确定R91–4bp是否可以作为连续监测外切酶消化实验的可行探针。首先，我们评估了DFHBI-1T是否能够与其他适配体（而非R91–4bp）相互作用。我们测量了5 μM染料在有无1 μM 29种不同DNA适配体存在下的荧光强度，这些适配体之前已被报道能够在不同的缓冲条件下结合多种小分子配体。这些适配体的二级结构和核苷酸组成差异很大，G含量范围从46%到70%不等（SI，图S11，表S1）。没有任何一种适配体能使DFHBI-1T的荧光强度相对于单独使用染料时增加，表明它们不会激活染料（图1J）。相比之下，我们发现R91–4bp在七种不同缓冲液中显著增强了DFHBI-1T的荧光强度（组成见SI，表S3），荧光强度相对于背景水平增加了3倍到8倍不等（图1J）。这些结果表明，只有DFHBI-1T与R91–4bp的结合才能激活染料的荧光。

然后，我们研究了DFHBI-1T的荧光信号与R91–4bp浓度之间的相关性。为此，我们测量了在不同R91–4bp浓度（0至1 μM）下1、2或5 μM DFHBI-1T的荧光强度。无论染料浓度如何，适配体浓度与荧光强度之间的关系都是线性的（SI，图S12），这表明溶液中的荧光强度直接反映了R91–4bp的浓度。接下来，我们确定了DFHBI-1T的最佳浓度，在该浓度下染料的荧光强度足以提供高信噪比，并且R91–4bp可以被外切酶消化而不会受到显著抑制，从而实现对外切酶消化的连续监测。我们在两种不同的缓冲条件下，用Exo I和Exo III混合物消化了1 μM R91–4bp，其中含有或不含不同浓度的DFHBI-1T。在所有情况下，R91–4bp在没有染料的情况下20分钟内被完全消化。在DFHBI-1T浓度高达5 μM时，我们观察到对R91–4bp消化的抑制作用很小，但在≥10 μM染料时抑制作用明显（SI，图S13）。这些结果表明，使用5 μM DFHBI-1T和1 μM R91–4bp可以实现对外切酶消化的连续监测。

为了证明R91–4bp和DFHBI-1T作为外切酶消化检测探针的潜力，我们确定了是否可以使用该探针进行实时监测。作为演示，我们将fentanyl适配体E1（17）通过(T)3连接子连接到R91–4bp的5′端（图2A），并进行了一系列实验来评估E1与R91–4bp的连接是否会影响其与fentanyl或DFHBI-1T的结合。我们发现R91–4bp及其 conjugate（E1-R91–4bp）对DFHBI-1T的亲和力相似（KD分别为4.9 ± 0.3 μM和3.1 ± 0.2 μM），并且无论fentanyl是否存在，E1-R91–4bp对染料的亲和力基本保持不变（KD分别为3.1 ± 0.2 μM和2.5 ± 0.2 μM）（图2B）。这些结果表明，染料与conjugate的结合不受E1-fentanyl结合的影响。接下来，我们使用等温滴定量热法（ITC）确定了E1-R91–4bp和E1对fentanyl的亲和力，再次发现两者之间没有显著差异，KD分别为57 ± 8 nM和79 ± 7 nM（17）。这些数据表明，E1与R91–4bp的连接不会影响任一适配体的结合特性。

然后，我们展示了RT-Exo消化实验的性能。我们在384孔微孔板的孔中加载了1 μM E1-R91–4bp（缓冲液为1X PBS，1 mM MgCl2，1% DMSO）和5 μM DFHBI-1T以及不同浓度的fentanyl。在30分钟后让conjugate和目标结合后，我们使用微孔板读取器记录样品的荧光强度以获得稳定的基线读数。为了启动反应，我们接着向样品中加入外切酶III和外切酶I的混合物，并每隔约30秒读取一次荧光强度，持续6小时以监测整个消化过程。这样每个样品共获得了720个读数，而传统的外切酶实验无法实现这一点。我们观察到，在没有fentanyl的情况下，荧光强度迅速下降并在4小时后达到最低点，表明conjugate被完全消化（图2D）。然而，在fentanyl存在的情况下，conjugate的消化速度明显减慢，并且抑制程度与fentanyl浓度成正比，最高可达50 μM。值得注意的是，即使在150 nM fentanyl的浓度下，我们仍能区分出阳性信号和背景信号。这种更高的灵敏度得益于RT-Exo实验提供的更多数据点和更好的时间分辨率。相比之下，如果采用传统方法进行实验，由于短时间内无法获得足够多的样本以及多步骤程序带来的不精确性，我们将无法区分这种信号。为了量化目标物质对适配体消化的抑制作用，我们使用了抵抗值指标，该指标定义为存在目标物质与不存在目标物质时荧光时间曲线下的面积差异。将抵抗值作为fentanyl浓度的函数绘制后，我们观察到抵抗值与目标物质的浓度呈正相关，这可能反映了在较高目标浓度下适配体与fentanyl的结合更为紧密，从而导致消化抑制作用增强。

我们还展示了使用相同的实验方法来评估E1-R91–4bp对34种不同干扰分子的特异性，包括其他滥用药物、切割剂和药品。作为对比，我们将我们的结果与之前使用传统协议和E1适配体在相同条件下进行的外切酶消化实验的结果进行了比较（17）。正如预期的那样，两种实验的结果非常相似，表明E1与普鲁卡因、苯海拉明、可卡因、美沙酮、乙基酮、哌甲酯和甲基二氧甲基苯丙胺有中等程度的交叉反应（>25%的交叉反应性），与甲基苯丙胺、氯米帕明、罂粟碱和吗啡的交叉反应性较弱（10–25%）（图2F；SI，图S14–16）。这些结果表明，RT-Exo消化测定法能够准确分析适配体的目标亲和力和特异性，并且该方法显著更简单、更稳健，具有较高的样本通量以及现有的外切核酸酶测定法无法实现的时间分辨率。在成功使用E1-R91–4bp验证了RT-Exo测定法之后，我们接下来研究了改变E1与R91–4bp之间连接子长度对测定性能的影响。为此，我们设计了新的构建体，将E1与R91–4bp通过(T)1或(T)6连接子连接起来。首先，我们确认这些构建体对芬太尼（SI，图S17）和DFHBI-1T（SI，图S18）的亲和力与含有(T)3连接子的构建体及原始适配体相似。随后，我们在有无50 μM芬太尼的情况下进行了RT-Exo测定（SI，图S19）。所有构建体在无芬太尼的情况下消化速率相似。然而，虽然含有(T)3和(T)6连接子的构建体在芬太尼存在下表现出相似的消化抗性，但含有(T)1连接子的构建体的消化抗性明显较低。这表明这种特定构建体的主要消化产物的目标结合亲和力可能较差。因此，这些结果表明，在设计此类构建体时，连接子长度至少应为3个核苷酸。

接下来，我们旨在证明具有连续监测功能的RT-Exo消化测定法可以应用于其他适配体，首先选择了A23T，这是一种由Szostak团队首次报道的腺苷结合DNA适配体的工程变体。A23T以微摩尔亲和力结合两个腺苷分子，但对三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）和一磷酸腺苷（AMP）的亲和力较低。我们通过(T)3连接子将R91–4bp连接到A23T的5′末端（图3A），并观察到在相同的缓冲条件（10 mM Tris、20 mM NaCl、1.5 mM MgCl2、4 mM KCl、1% DMSO）下，这种A23T-R91–4bp构建体与DFHBI-1T的亲和力（KD = 0.9 ± 0.1 μM）（SI，图S20A）与R91–4bp（KD = 1.4 ± 0.2 μM）相当（SI，图S20B）。此外，该构建体对染料的亲和力不受腺苷存在与否的影响（KD = 0.9 ± 0.1 μM或1.1 ± 0.2 μM，SI，图S20C），证明两个适配体模块可以独立发挥作用。最后，我们确认A23T-R91–4bp构建体对腺苷的结合亲和力与原始A23T适配体相似（KD1 = 14.9 ± 0.9 μM，KD2 = 26.1 ± 0.4 μM，SI，图S21A vs KD1 = 14.8 ± 1.1 μM，KD2 = 28.6 ± 0.5 μM，SI，图S21B）。因此，将R91–4bp与A23T连接并不会干扰任一适配体对其相应配体的结合亲和力。值得注意的是，尽管A23T和R91–4bp都富含G碱基，且R91–4bp可能含有G四链结构，但该构建体似乎不会发生错误折叠。随后，我们在不同浓度的腺苷存在下进行了RT-Exo消化测定。在没有目标分子的情况下，A23T-R91–4bp在6小时后完全被消化；而在腺苷存在的情况下，消化受到浓度依赖性的抑制（图3B；SI，图S22）。与上述E1测定类似，我们能够在整个消化过程中为每个样本获得720个数据点——几乎是传统测定方法的100倍数据量，且无需实验者进行额外干预。最后，我们使用RT-Exo测定法评估了A23T的特异性，发现A23T-R91–4bp仅对腺苷有反应，而对ATP、ADP、AMP、三磷酸肌苷（ITP）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、三磷酸鸟苷（GTP）、三磷酸胞苷（CTP）、三磷酸尿苷（UTP）或脱氧腺苷三磷酸（dATP）无反应（图3C；SI，图S23）。这些结果与先前关于该适配体的特异性数据一致。

为了确定RT-Exo测定法是否适用于具有不同结构并结合多种目标的适配体，我们首先以A23T为例。A23T是一种工程化的腺苷结合DNA适配体。我们合成了一种将R91–4bp通过(T)3连接子连接到A23T 5′末端的构建体，并观察到其在相同缓冲条件下的亲和力与DFHBI-1T相当（KD = 0.9 ± 0.1 μM，SI，图S20A vs KD = 1.4 ± 0.2 μM，SI，图S20B）。此外，该构建体对染料的亲和力不受腺苷存在与否的影响（KD = 0.9 ± 0.1 μM vs KD = 1.1 ± 0.2 μM，SI，图S20C），证明两个适配体模块可以独立发挥作用。最后，我们确认A23T-R91–4bp构建体对腺苷的结合亲和力与原始A23T适配体相似（KD1 = 14.9 ± 0.9 μM，KD2 = 26.1 ± 0.4 μM，SI，图S21A vs KD1 = 14.8 ± 1.1 μM，KD2 = 28.6 ± 0.5 μM，SI，图S21B）。因此，将R91–4bp与A23T连接不会影响任一适配体对其相应配体的结合亲和力。考虑到A23T和R91–4bp都富含G碱基，且R91–4bp可能含有G四链结构，这一结果很有趣。随后，我们在不同浓度的腺苷存在下进行了RT-Exo消化测定。在没有目标分子的情况下，A23T-R91–4bp在6小时后完全被消化；而在腺苷存在的情况下，消化受到浓度依赖性的抑制（图3B；SI，图S22）。与上述E1测定类似，我们能够在整个消化过程中为每个样本获得720个数据点——几乎是传统测定方法的100倍数据量，且无需实验者进行额外操作。最后，我们使用RT-Exo测定法评估了A23T的特异性，发现A23T-R91–4bp仅对腺苷有反应，而对ATP、ADP、AMP、ITP、NAD、GTP、CTP、UTP或dATP无反应（图3C；SI，图S23）。这些结果与先前关于该适配体的特异性数据一致。

为了确定RT-Exo测定法是否适用于疏水性配体，我们评估了我们的DNA适配体THC1.2的结合特性。THC1.2能够以50 nM的KD结合高度疏水性的四氢大麻酚（THC）。这种适配体特别具有挑战性，因为它是我们研究中G含量最高的适配体之一（假定结合域中68%为G碱基），这增加了其错误折叠的可能性。合成THC1.2-R91–4bp构建体后，我们确认其在有无目标分子的情况下对DFHBI-1T的亲和力相似（KD = 2.4 ± 0.3 μM vs KD = 2.0 ± 0.3 μM，SI，图S24A,B vs KD = 2.3 ± 0.2 μM，SI，图S24C）。然后，我们进行了RT-Exo消化测定以评估该构建体对THC的相对结合亲和力。与其他适配体一样，该构建体在无THC的情况下6小时后被消化；而在THC存在的情况下，消化受到THC浓度的比例性抑制（图3E；SI，图S25）。我们还使用RT-Exo消化测定法评估了THC1.2构建体对20种不同滥用药物和药物的特异性，结果与先前报道的THC1.2特异性数据一致（图3F；SI，图S26, 27），从而验证了我们测定结果的有效性。因此，RT-Exo测定法似乎适用于广泛的适配体和配体。

接下来，我们探讨了该测定法是否可用于研究其他人报道的适配体的结合特性。首先，我们将该测定法应用于结合可卡因的DNA适配体MNS4.1，通过(T)3连接子将R91–4bp连接到MNS4.1的5′末端（图3G）。我们确认MNS4.1-R91–4bp构建体对DFHBI-1T的亲和力（有无可卡因目标时分别为KD = 4.4 ± 0.3 μM和4.0 ± 0.4 μM）与R91–4bp基本相同（KD = 4.9 ± 0.3 μM，SI，图S28），其对可卡因的亲和力（KD = 10.7 ± 0.6 μM）也与原始适配体相似（KD = 8.9 ± 0.8 μM，SI，图S29）。然后，我们进行了RT-Exo测定以表征该构建体对可卡因的相对结合亲和力，并观察到消化受到浓度依赖性的抑制，消化曲线清晰明确（图3H；SI，图S30）。我们还使用RT-Exo测定法评估了MNS4.1对34种不同配体的结合特异性，发现它与几种配体发生交叉反应，包括甲烯二氧吡罗瓦龙（MDPV）、美沙酮、苯佐卡因和奎宁（图3I；SI，图S31–33），这准确反映了先前报道的MNS4.1的结合特性。作为该方法通用性的进一步证明，我们使用RT-Exo测定法对血清素和苯丙氨酸DNA适配体进行了测定，这两种适配体分别与它们的目标分子的结合KD分别为30 nM和10 μM。我们将每种适配体通过(T)3连接子连接到R91–4bp的5′末端（图4A,D），并确认它们对DFHBI-1T的亲和力（分别为KD = 2.2 ± 0.2 μM和1.7 ± 0.4 μM）与R91–4bp相当（KD = 2.2 ± 0.2 μM，在相同的结合缓冲条件下，1X PBS、2 mM MgCl2、1% DMSO，SI，图S34）。同样，每种构建体对其目标分子的亲和力（分别为KD = 28 ± 5 nM和8.8 ± 0.3 μM）也与原始适配体相当（KD = 49 ± 5 nM和8.2 ± 0.3 μM，SI，图S35）。当我们在RT-Exo消化测定中使用这些构建体时，都观察到目标浓度依赖性的抑制作用，消化曲线清晰明确（图4B, C, E和F）。这些结果进一步证明了RT-Exo测定法适用于多种小分子结合适配体。

最后，我们评估了RT-Exo测定法是否适用于结合蛋白质的适配体。作为模型系统，我们使用了Tasset等人报道的结合凝血酶的DNA适配体，其KD为500 pM。我们将该适配体通过(T)3连接子连接到R91–4bp的5′末端（图4G）。有趣的是，我们观察到在没有凝血酶的情况下，该适配体对DFHBI-1T的亲和力降低了2倍（KD = 8.1 ± 0.7 μM vs 在有凝血酶的情况下KD = 3.5 ± 0.2 μM，SI，图S36A,B）。在这些条件下，R91–4bp本身对DFHBI-1T的亲和力为4.9 μM（SI，图S36C）。这表明将Tasset适配体连接到R91–4bp会降低荧光团结合域的亲和力（在没有凝血酶的情况下），可能是由于R91–4bp与Tasset之间的非特异性相互作用导致R91–4BP发生错误折叠。我们推测，当凝血酶与Tasset结合时，构建体对DFHBI-1T的亲和力提高，是因为R91–4bp在凝血酶存在下不再与Tasset发生这种不利相互作用。通过生物层干涉测量法，我们发现Tasset-R91–4bp构建体的凝血酶结合亲和力（KD = 1,770 ± 490 pM）低于原始适配体（KD = 467 ± 37 pM，SI，图S37）。最后，我们在不同浓度的凝血酶存在下进行了RT-Exo测定。随着凝血酶浓度的增加，连接体消化受到外切核酸酶的抑制也成比例增加（图4H,I），证实了我们的测定法也适用于结合蛋白质的适配体。

接下来，我们试图利用RT-Exo测定法评估最近发现的一种适配体F6的样本通量。F6是一种能够结合芬太尼类似物的适配体。我们的目标是在单次实验中同时评估F6对120种不同芬太尼类似物的交叉反应性。使用传统的外切核酸酶测定方法，需要通过100次精确计时的移液步骤收集约1,200个时间点样本，并使用数千个移液器和至少三个384孔微孔板。通过RT-Exo检测方法，这类实验变得更加可行和经济高效，只需将目标适配体、目标分子和外切核酸酶混合，并使用微孔板读数器记录荧光变化即可。为了进行这项实验，我们通过(T)3连接子将F6与R91–4bp偶联（图5A），然后确认了这种偶联物在无芬太尼（KD = 1.5 ± 0.1 μM）和有芬太尼（KD = 1.4 ± 0.4 μM）的情况下对DFHBI-1T的亲和力与R91–4bp（KD = 2.3 ± 0.2 μM）相似（补充信息，图S38）。我们还确定F6-R91–4bp偶联物与芬太尼的结合亲和力（KD = 76 ± 9 nM）与原始适配体相同（KD = 69 ± 8 nM）（补充信息，图S39）。与使用RT-Exo检测的其他适配体一样，我们能够在有或没有芬太尼的情况下实时高分辨率地监测F6-R91–4bp的消化过程（图5B）。接下来，我们使用RT-Exo检测方法检测了由疾病控制与预防中心提供的芬太尼类似物筛选试剂盒中的120种不同芬太尼类似物（补充信息，图S40–S43）。结果显示，F6能够识别107种不同的类似物，这些类似物包含多种功能基团取代基，其交叉反应性相对于芬太尼为20%（图5C；补充信息，图S44–53）。我们观察到，该适配体对氨基（R1）和苯基（R2 & R5）上的取代基具有较好的耐受性，并且对哌啶环（R3）上的变化也有一定耐受性（图5D）。然而，F6无法识别13种类似物，包括N-烷基链短一个碳原子的类似物（如苄基阿芬太尼、苄基芬太尼、苄基丙烯酰芬太尼和噻吩基芬太尼），以及在哌啶环第4位有额外非氢取代基的类似物（如阿芬太尼、瑞芬太尼和舒芬太尼）。此外，该适配体对所有芬太尼类似物的代谢物也没有反应，因为这些代谢物都缺乏N-苯基结构（包括诺芬太尼、乙酰诺芬太尼、N-甲基环丙基诺芬太尼、丁酰诺芬太尼和N-甲基诺芬太尼）。因此，我们得出结论，该适配体很可能通过它们共有的结构特征（如哌啶环、苯胺环、氨基和苯乙基）来识别这些类似物。这些结果展示了单次RT-Exo检测能够提供的大量关于适配体结合特性的信息，且通量非常高。

为了验证RT-Exo检测的结果，我们使用F6和花青素染料二乙基硫三羰花青素（Cy7）对120种芬太尼类似物进行了传统的染料置换检测（27,28）。在这种检测中，Cy7最初与单体F6形成非共价复合物，在此状态下它在770 nm处吸收最大光强。目标分子与F6结合后，会将Cy7从溶液中置换出来，导致染料形成H-聚集体，这些聚集体在595 nm处吸收光强（图5E）。Cy7置换检测的结果与RT-Exo检测的结果非常吻合。在RT-Exo检测中显示出≥20%交叉反应性的107种类似物在染料置换检测中也表现出交叉反应性，而F6适配体再次无法与这13种类似物结合（图5D；补充信息，图S54–63）。为了验证其中一些结果，我们使用了ITC（等温滴定量热法）。具体来说，我们研究了F6与那些在两种检测中都显示出相对较强结合力的类似物（如芬太尼、类似物13和环丙基芬太尼）或相对较弱结合力的类似物（如顺式-3-甲基硫芬太尼、类似物80），以及两种检测交叉反应性不同的类似物（如邻甲基苯基芬太尼、类似物93）的结合情况（补充信息，图S64）。ITC证实F6对芬太尼的亲和力很高（KD = 33 ± 5 nM）（补充信息，图S64A）和环丙基芬太尼（KD = 29 ± 2 nM）（补充信息，图S64B），但对顺式-3-甲基硫芬太尼的亲和力较低（KD = 3.0 ± 0.2 μM）（补充信息，图S64C）。因此，ITC证实了RT-Exo和Cy7置换检测对这些类似物的结果。对于邻甲基苯基芬太尼，ITC显示其亲和力为中等（KD = 452 ± 46 nM）（补充信息，图S64D）。据此，我们预期RT-Exo和Cy7置换检测都应该显示出约100%的交叉反应性值，因为使用了100 μM的配体，因此超过99%的适配体应该与配体结合。然而，虽然RT-Exo检测显示了预期的交叉反应性值（相对于芬太尼为102%），但Cy7置换检测显示的交叉反应性仅为33%（相对于芬太尼为33%）。我们推测Cy7置换检测的准确性可能受到染料本身与类似物非特异性相互作用的影响，这一点我们在之前的研究中也观察到（28）。进一步检查邻甲基苯基芬太尼的UV-Vis吸收光谱时，除了在595 nm和770 nm处分别观察到对应于Cy7 H-聚集体和单体的典型峰外，还在680 nm处发现了一个额外的峰（补充信息，图S61I），这可能是由于Cy7与邻甲基苯基芬太尼形成了二聚体。因此，在这种情况下，Cy7置换检测的结果不如RT-Exo检测的结果可靠。

RT-Exo检测的另一个实际应用是评估突变对适配体结合性能的影响。为了证明这一点，我们基于NC195家族的共识序列（图6A）生成了六个NC195突变体（补充信息，图S65A），这是一种46个核苷酸长的DNA适配体，具有纳摩尔级的可卡因结合亲和力（29）。我们首先进行了第一代外切核酸酶检测（补充信息，图S65B），并通过ITC确定了突变体的结合亲和力（补充信息，图S66）。然后，我们将R91–4bp偶联到这些突变体的5′末端（图6B），并进行了RT-Exo检测（图6C；补充信息，图S67）。我们首先将A9和T38分别突变为G和C（NC195-mut1），以确定加强茎部的末端是否能提高可卡因结合亲和力。两种消化检测都显示突变体的结合力略低于NC195，ITC也表明突变体（NC195-mut1）的可卡因亲和力降低了2倍（KD = 82 ± 9 nM），相对于亲本适配体（KD = 39 ± 8 nM）。这些结果否定了我们的假设。接下来，我们将T22（可能与G11形成摆动碱基对）突变为C，以在内部发夹结构中形成互补的GC碱基对（NC195-mut2），假设这样会提高亲和力。然而，两种消化检测都显示相反的结果，亲和力显著降低。ITC证实该突变体的可卡因亲和力降低了约200倍（KD = 8.6 ± 0.5 μM），相对于NC195。因此，这个位置的完美碱基配对对可卡因结合是有害的。接下来，为了研究缩短内部发夹长度的影响，我们去除了T13-A20碱基对（NC195-mut3）。两种消化检测都表明该突变体的可卡因亲和力极低，ITC也证实了这一点（KD = 79 ± 1 μM），证实了稳定性对于结合是必要的。最后，基于这些核苷酸在NC195家族中的高度保守性，我们将A24突变为T（NC195-mut4）、G27突变为C（NC195-mut5）和G33突变为T（NC195-mut6）。在这三种情况下，根据两种消化检测和ITC的结果，可卡因亲和力完全丧失。

为了进一步证明其通用性，我们将RT-Exo检测方法应用于Stojanovic团队报道的一种48个核苷酸长的DNA适配体TrpApt，该适配体对L-色氨酸具有亚微摩尔级的亲和力（11）。为了进行结构-活性研究，我们根据其结构生成了六个TrpApt突变体（补充信息，图S68A），NUPACK预测该适配体包含一个7个核苷酸长的茎部，通过一个单核苷酸突起与另一个4个核苷酸长的茎部相连，随后是一个10个核苷酸长的突起，最后是一个内部4个核苷酸长的发夹结构，再连接一个7个核苷酸长的环。我们首先进行了第一代外切核酸酶检测（补充信息，图S68B），并通过ITC确定了它们的目标结合亲和力（补充信息，图S69）。然后，我们将R91–4bp偶联到这些突变体的5′末端（图6D），并进行了RT-Exo检测（图6E；补充信息，图S70）。我们首先通过删除G8（TrpApt-mut1）来验证适配体茎部中的单个核苷酸突起是否对结合是必需的。两种消化检测都显示该突变体的结合力低于TrpApt，表明其对色氨酸的亲和力较弱。然而，ITC表明TrpApt-mut1（KD = 282 ± 28 nM）的亲和力与TrpApt（KD = 387 ± 15 nM）相似。由于外切核酸酶检测的阻力值通常与被检测适配体的主要消化产物的KD更相关（15），因此该突变体的较低阻力值表明其截短产物的目标亲和力低于亲本适配体。接下来，我们通过将这些碱基分别突变为T和A（TrpApt-mut2）来研究削弱C11-G39碱基对的影响。基于外切核酸酶的检测和ITC都显示该突变体的亲和力与TrpApt没有显著差异（KD = 210 ± 24 nM）。最后，我们创建了点突变体G17T（TrpApt-mut3）、T20A（TrpApt-mut4）、G27T（TrpApt-mut5）和G32T（TrpApt-mut6）。这些突变体都没有结合色氨酸，除了TrpApt-mut6，它在两种外切核酸酶检测中的结合力显著降低，并且ITC显示其亲和力降低了6倍（KD = 2.3 ± 0.2 μM）。这些结果共同表明，RT-Exo提供了一种通用且方便的方法，可以准确且高效地筛选适配体的结合特性。

在这里，我们介绍了RT-Exo，这是一种新的方法，它允许通过外切核酸酶消化检测无标记、高通量、实时地表征适配体的结合特性。这种方法只需将感兴趣的适配体与荧光适配体R91–4bp连接起来，用外切核酸酶消化所得的构建体，并使用微孔板读数器监测消化过程中的荧光变化。我们已经证明RT-Exo适用于具有多种序列和结构特征（如茎-环、三向连接、G-四聚体）的适配体，目标分子的亲和力范围广泛（如皮摩尔到微摩尔级KD），以及电荷和疏水性不同的配体。与传统的基于外切核酸酶的消化检测类似，RT-Exo可以筛选适配体结合配体的能力，并报告这些相互作用的相对结合强度。然而，RT-Exo对第一代检测方法进行了重大改进，因为它可以实时连续高分辨率地监测适配体的消化过程，消除了在精确时间点收集大量样本的需要。这在检测的便利性、准确性、精确性和通量方面带来了多项改进。首先，RT-Exo显著更简单、更高效，因为它只需要混合试剂（即适配体、配体和外切核酸酶），然后由微孔板读数器自动记录反应进度，而不需要实验者的持续关注和干预。对于RT-Exo检测方法而言，这不仅意味着荧光测量的准确性更高，还因为在前一代检测方法中，样本的荧光是在孔内直接测量的，而前一代方法中额外的采样、转移和混合步骤可能会导致不准确性。其次，由于RT-Exo检测方法中的消化反应被高频（约30秒）连续监测，因此可以收集到数百甚至数千个数据点，这比前一代检测方法通常获得的数据点数量（≤10个）要多几个数量级。在检测误差方面，由于数据密度更高，RT-Exo检测方法对荧光测量时间过程的拟合不确定性明显更低，从而提高了消化反应建模的准确性——进而提高了所得抗性值的准确性。尽管我们在这里没有利用这一点，但该方法提供的高时间分辨率可以为适配体-配体结合和消化的动力学提供新的见解，而传统检测方法由于时间分辨率较低，无法实现这一点。第三，RT-Exo检测方法的通量明显高于传统方法，能够在单次实验中同时表征至少120对适配体-配体。由于涉及的移液步骤较多以及样本数量庞大，传统方法无法做到这一点。最后，RT-Exo检测方法所需的资源消耗远低于传统方法，至少使用的移液头和微孔板数量减少了10倍。

为了使RT-Exo检测方法具有实用性，它应该适用于具有不同序列、结构、目标结合亲和力和缓冲液组成的多种适配体。关于通用性，一个重要的因素是反应条件。在这里，22种适配体中有20种可以使用相同的核酸酶浓度并获得满意的结果，这表明RT-Exo具有足够的通用性，可以在不进行个别检测条件精细优化的情况下并行大规模筛选多种适配体。然而，在我们默认的酶浓度（Exo III 0.025 U/μL和Exo I 0.1 U/μL）下，某些适配体可能会被过快或过慢地消化。在这些默认条件下未达到理想消化速率的适配体可以在不同的酶浓度下（即相对于默认酶浓度的3倍、1倍和0.25倍）进行重新测试。关于适配体序列和结构的检测通用性，虽然R91–4bp可能形成G四链结构，但我们已经证明它也与富含G的适配体（G含量为30-51%）兼容。然而，在一个案例（Tasset-R91–4bp）中，我们观察到目标蛋白和DFHBI-1T的亲和力相对于母适配体和单独的R91–4bp略有变化。我们假设在我们的研究中，这种构件的错误折叠或聚集并不常见，因为R91–4bp部分总是与DFHBI-1T结合，而DFHBI-1T在混合物中的含量远高于R91–4bp。染料结合可能有助于R91–4bp的折叠，从而防止其与相邻适配体域的相互作用，从而避免错误折叠。尽管如此，其他构件也可能发生错误折叠或聚集。由于仅凭序列无法预测哪些适配体与R91–4bp不兼容，我们建议对构件进行实际测试。在配体方面，RT-Exo检测方法与多种极性不同的小分子（例如从高度疏水的THC到高度亲水的苯丙氨酸）以及蛋白质目标兼容。我们预测，只要目标不干扰核酸酶本身的消化活性（例如通过竞争性结合或结合酶辅因子如Mg2+、使核酸酶变性或影响R91–4bp与DFHBI-1T的结合），RT-Exo应该可以推广到其他目标。

自动化RT-Exo检测方法可以进一步提高通量几个数量级。例如，现在合成寡核苷酸的公司通常会提供微孔板中的偶联物，这些偶联物可以先使用液体处理系统用反应缓冲液重新配制，然后与DFHBI-1T和配体一起孵育。随后，核酸酶混合物可以自动分配到每个样本中以启动反应，并立即将微孔板转移到读板仪上进行连续监测。数据处理也可以通过电子表格软件中的宏命令自动化，使整个适配体筛选过程几乎变得毫不费力。由于液体处理系统可以提前准备多个微孔板，唯一的限制因素将是用于监测消化进度的读板仪的可用性。还有其他几种策略可以进一步改进检测方法，以提高其性能或获得关于适配体-配体相互作用的新见解。首先，可以使用其他核酸酶（如T5 Exonuclease），它可以在5′到3′方向上消化单链和双链DNA，代替Exo III和Exo I。我们发现T5 Exo对适配体-配体结合的敏感性略高于Exo III；在Exo III和Exo I未能检测到任何结合的情况下，可以使用T5 Exo来排除假阴性结果。然而，这需要修改当前的偶联物设计，使适配体在其3′端而不是5′端与R91–4bp连接。其次，可以使用Exo-RT来评估目标结合后截短结构转换适配体的构象变化程度。这只需将截短的适配体与R91–4bp连接，并在有无配体的情况下仅使用Exo I进行消化即可。在无配体情况下主要处于展开状态的适配体会被Exo I快速消化，而与配体结合的折叠适配体则抵抗消化。自由状态和配体结合状态下的适配体消化速率之间的显著差异表明适配体在目标结合时发生了较大的构象变化。第三，可以通过将Lettuce替换为荧光RNA适配体（如Spinach）并使用RNA核酸酶（如Exonuclease T）来将RNA适配体适应到RT-Exo平台上。第四，肯定还有改进检测方法的信噪比的空间。在我们测试的最不敏感系统中，起始荧光信号仅比背景高3倍。通过使用替代的信号报告分子（如Ferré-D’Amaré和Jaffrey小组设计的Bibb-Lettuce适配体，其荧光特性可能比R91–4bp更稳健），可以改善这一情况。最后，如果荧光适配体模块能够结合先前报道的DFHBI-1T衍生物（其激发和发射波长大于500 nm），则可以在复杂样本（如生物流体）中进行RT-Exo检测。随着方法的进一步改进和扩展，我们预计RT-Exo的简单性、可靠性、多功能性和高通量特性将使其成为筛选适配体-配体相互作用的首选方法，并加速适用于各种实际应用的适配体的发现和开发。