为确保多壁碳纳米管符合REACH法规而采用的实验性数据生成方法：其环境归趋研究

《Environmental Science: Nano》：Experimental approaches to data generation for REACH compliance of multi-walled carbon nanotubes: environmental fate

　　将监管机构认可的标准化测试指南应用于碳基纳米材料是一项具有挑战性的任务。主要困难在于如何从环境中高碳背景中分析区分这些纳米材料。多壁碳纳米管（MWCNTs）的物理化学特性进一步增加了挑战性，因为它们会形成纠缠且高度凝聚的束状结构，并迅速聚集。因此，许多分析方法并不适用。本研究评估了现有标准化分析方法的适用性，并探索了潜在的替代方案。我们重点关注了与环境归趋相关的EU-REACH数据要求，特别是纳米材料的溶解性、分散稳定性和吸附/解吸性质。此外，我们还根据OECD TG 303A标准，评估了污水处理厂（STP）模拟研究的可行性，考虑了包括同位素特征在内的各种分析方法。研究结果突出了在为REACH注册目的生成数据时所面临的挑战和新的分析方法，并指出了研究需求。

由于缺乏适用和标准化的分析方法，为碳基纳米材料（如多壁碳纳米管（MWCNTs）的环境归趋评估生成实验数据仍然具有挑战性。我们的研究重点在于应用现有和新的分析技术来生成MWCNTs的环境归趋数据。除了纳米材料的溶解性和分散稳定性外，我们还使用同位素特征和拉曼光谱等先进方法，评估了污水处理厂（STP）模拟研究的可行性。鉴于纳米材料在环境中的生产和释放量不断增加，我们的工作迫切需要能够进行可靠和稳健的化学风险评估的分析方法。

在欧盟，制造或进口的化学品必须根据REACH法规（关于化学品注册、评估、授权和限制的法规（EC）第1907/2006号）的规定进行注册。REACH的附件VI至X规定了注册所需的标准信息要求。2018年，针对这些附件发布了额外的纳米特定数据要求，并在委员会法规（EC）2018/1881中实施。自2020年1月起，纳米材料的注册者有义务为符合REACH要求的注册提供纳米特定信息。根据REACH法规第13(3)条，为满足这些信息要求而进行的测试“必须按照委员会法规中规定的测试方法或委员会或机构认可的其他适当国际测试方法进行”。基于这一规定，新生成的用于REACH注册目的的实验数据通常只有在遵循标准化和验证的测试指南时才会被接受，这些指南由欧盟测试方法法规（委员会法规（EC）第440/2008号）定义，该法规引用了经济合作与发展组织（OECD）为许多REACH要求的测试制定的测试指南（TGs）。到目前为止，纳米特定的测试指南往往缺失或适用性有限，从而阻碍了可靠数据的生成。对于纯碳纳米材料（如MWCNTs）来说，这种情况尤其具有挑战性。欧洲化学品管理局（ECHA）的相关指导文件仅有限地涉及碳纳米材料，并未提供如何考虑MWCNTs特定性质的指导，这在执行REACH要求的测试时造成了严重问题。这些性质包括广泛的聚集/团聚，导致在含碳介质中的分散高度不稳定。因此，当局最近发布呼吁识别与纳米材料相关的信息缺口并不令人惊讶。例如，在2024年和2025年，ECHA的欧盟纳米材料观察站（EUON）发布了“填补纳米材料信息缺口”的呼吁：“EUON欢迎新的研究提案”和“EUON呼吁研究提案以解决欧盟内的纳米材料知识缺口”。

由于缺乏标准化和验证的测试指南来生成强制性的纳米特定实验信息，注册者目前面临几个复杂的挑战。首先，测试必须在一定程度上适应特定纳米材料的性质（例如，较差的分散稳定性），但针对法律规定的特定TG的适应指导往往缺乏。其次，尽管有大量关于使用各种方法测试纳米材料的学术文献，但其监管接受度对注册者来说往往不清楚。例如，ECHA最近发布的一份关于在环境和生物基质中检测和量化碳基纳米材料的现有方法的报告列出了57种方法和分析技术。该报告还指出缺乏标准化协议，使得不确定“所得数据是否已经被当局，特别是ECHA，在REACH等立法下接受”。这一发现说明了注册者在选择REACH要求的研究所需的适当量化技术时面临的问题，以及他们对数据监管接受度的不确定性。第三，注册者通常会委托具有特定TG应用专长的合同研究组织（CROs）。然而，CRO在将该方法具体应用于纳米材料（本例中为MWCNTs）方面的经验可能有限。对于（生态）毒理学测试，REACH第13(4)条进一步规定，CRO必须根据良好实验室规范（GLP）的原则获得认证，这进一步限制了能够进行所需测试的CRO的数量。此外，CRO可能没有所有可以设想的分析技术。由于所有技术对碳基纳米材料都有其优缺点，因此“多技术方法通常是必要的”，这使得具有特定OECD TG专长的CRO配备所有可能的方法的可能性更加渺茫。最后，由于法律截止日期和预算限制，为REACH注册目的生成数据通常必须在一定的时间内完成，这限制了应用各种不同测试条件（例如，扩展OECD TGs中规定的条件）或分析技术的可能性。上述问题相互关联。例如，如果注册者对某些分析技术的监管接受度存疑，他们不太可能投入大量资源。本研究旨在分享通过实际应用TGs来满足REACH信息要求所获得的知识。它展示了为真实的REACH注册档案生成数据的技术和实践挑战，强调了我们在生成新数据时遇到的失败和成功，以及我们认为监管机构可接受的测试指南的可行调整。它提供了一个与研究机构或学术界进行的研究不同的现实监管视角。例如，遵循所需的TGs意味着在大多数情况下无法自由选择测试浓度。此外，应用不同的分析技术也受到可用性以及预算和时间限制的制约，如上所述。这些限制通常也阻止了在获得更多经验后重复在改进条件下的研究。虽然这些问题可能被视为限制，但本研究为参与REACH注册数据生成的利益相关者和对碳基纳米材料测试方法感兴趣的更广泛科学界提供了现实世界的见解。如上所述，本研究不是对测试特定终点的现有文献的综述，也不旨在验证MWCNTs的TGs或分析技术，也不旨在定义新的标准程序；相反，它引入了创新的实验方法来克服在REACH背景下生成MWCNTs特定、难以评估的终点的数据挑战。尽管在开发用于满足REACH要求的纳米材料环境归趋终点的标准化测试方法方面已经取得了一些进展，但对于某些终点，特别是MWCNTs，仍然存在挑战。本文重点关注REACH附件VII和VIII下的这些环境归趋终点，探索了新的分析方法以克服潜在的不合规问题。这些终点包括纳米材料的溶解性、分散稳定性和吸附/解吸性质。与物质识别和人类健康相关的数据要求挑战在配套文章中进行了讨论。

根据REACH附件VII第7.7节，碳的溶解度和溶解速率

碳在环境中普遍存在。因此，测量来自碳基纳米材料（如石墨烯、单壁碳纳米管（SWCNTs）或MWCNTs）的碳释放到水介质中极其困难。此外，碳还可能从实验设备中释放出来，进一步复杂化了从碳基纳米材料中测量碳的溶解。由于碳的结构和化学键非常稳定，缺乏极性和官能团等原因，元素碳几乎不溶于任何溶剂。然而，根据REACH法规，研究纳米材料的水溶性和/或溶解性是一项数据要求。为了符合监管要求，我们在技术上可行的范围内研究了MWCNTs的碳水溶性——或者更准确地说，碳在水中的溶解。尽管注意到确定碳在含碳环境基质中的溶解问题，但OECD指导文件（GD）第318号（参考文献4）并未提供关于如何解决这一问题的具体建议。我们开发了一种新的方法，结合了OECD测试指南（TG）105（参考文献16）和OECD GD 318（参考文献4），通过传统的柱层析方法监测碳的溶解，同时排除了任何外部碳源。

根据REACH附件VII第7.8节，分配系数n-辛醇/水（Kow）通常用作物理化学参数，以提供有关化学物质亲脂性的信息，更广泛地说，是关于化学物质在生物体内积累和吸附到固体上的倾向。然而，Kow的概念不适用于无机物质和许多纳米材料。在log Kow不适用的情况下，REACH法规指示有机和无机纳米形式的注册者研究其在环境介质中的分散稳定性。相应的标准测试指南是OECD TG 318。我们使用MWCNTs进行了OECD TG 318测试，尽管预期MWCNTs几乎不可能分散。

根据REACH附件VIII第9.2节和9.3节，降解和吸附/解吸筛选

MWCNTs被定义为无机物质，并已被确定为既不溶于水也不溶于辛醇。对于无机物质，根据REACH附件VII，可以省略生物降解筛选测试。然而，对于无机（不溶性）纳米材料，在水、沉积物和土壤中的模拟测试没有豁免选项。相反，根据REACH附件IX，必须识别转化产物以及非生物和生物降解产物。此外，根据REACH附件VIII，对于不溶性纳米形式，必须特别考虑形态转化、化学转化和其他非生物降解。最后，不能仅基于物理化学性质就免除稳定纳米材料的数据要求，除非其吸附潜力的相关性能够得到充分证明。由于目前尚未确定单一物理化学性质与纳米材料吸附行为之间的简单关系，因此这种证明是不可能的，需要实验数据。根据MWCNTs已知的物理化学性质，预计它们会分布到污水污泥固体部分。因此，我们专注于生成关于MWCNTs在污水处理厂（STPs）中分布的可行数据。例如，关于降解的更高级别模拟测试，OECD TG 303A“模拟测试——好氧污水处理——活性污泥单元”在ECHA关于纳米材料的指南中被提及为“特别有助于评估污水处理厂中纳米颗粒的分布”。鉴于OECD TG 303A中应用的测试材料浓度显著高于其他降解模拟测试指南，这是唯一可能产生相关结果的测试指南：只有高测试材料浓度才能允许在环境介质的高碳背景下确定和量化MWCNTs。重要的是，OECD TG 303A研究不仅可以提供关于纳米材料通过污水处理系统时的任何形态变化的信息（通过显微镜图像的视觉调查），还可以从吸附到污水污泥固体的程度确定一个明显的吸附系数。这可以满足REACH附件VIII第9.2节对不溶性纳米形式进一步降解调查的要求，同时满足吸附/解吸的信息要求。在这里，我们报告了一项可行性研究，该研究根据OECD TG 303A标准评估了多壁碳纳米管（MWCNTs）在环境中的命运，并探讨了各种分析方法在追踪和量化环境中的碳基纳米材料方面的适用性。虽然OECD TG 303A最初是为评估水溶性有机物质的生物降解而开发的，但出于上述原因，我们认为它对于本研究也是有意义的。

多壁碳纳米管（MWCNTs）是一种长形、高纵横比的纳米材料，它们以束状碳聚集体的形式排列并相互缠结。K-Nanos MWCNTs包含三种纳米形态，这些形态根据REACH附件VI以及欧盟委员会法规（EC）2018/1881的修订被归类为“相似的纳米形态”：K-Nanos 100、K-Nanos 210和K-Nanos 300。K-Nanos的纯度超过91%（见补充信息表S1）。其组成颗粒的特性如下：单个碳纳米管的平均长度和直径分别为46.22–62.76微米和12.13–14.58纳米，因此其纵横比介于3789:1至4304:1之间。MWCNTs的平均束长为42.00–54.85微米，平均束径为2.46–3.21微米。在20°C下的比表面积为200.8–247.7平方米每克，密度为1.76克每立方厘米。具体纳米形态的数据详见补充信息表S1。

Jenotube MWCNTs也属于长形、高纵横比的纳米材料，同样以束状碳聚集体的形式存在。Jenotubes包含四种纳米形态：Jenotube 6、Jenotube 8、Jenotube 10A和Jenotube 10B。Jenotubes的纯度同样超过97%（见补充信息表S2）。其组成颗粒的特性为：单个纳米管的平均长度和直径分别为35.87–136.37微米和7.4–12.2纳米，由此计算出的纵横比介于3261:1至16961:1之间。MWCNTs的平均束长为35.6–129.8微米，平均束径为2.9–6.3微米。在20°C下的比表面积为217–644平方米每克，密度为2.29克每立方厘米。具体纳米形态的数据详见补充信息表S2。

关于纳米材料的水溶性或溶解度测定，我们采用了OECD TG 105（参考文献16）和OECD GD 318（参考文献4）中的柱层析法（第2.2节“溶解速率的动态测试”）对K-Nanos和Jenotube MWCNTs进行了研究。实验在含有<200微克碳每升的超纯水中进行，这些碳以不可挥发性有机碳（NPOC）的形式存在。所使用的玻璃柱和熔融玻璃填料（详见补充信息）以及所有辅助材料都经过精心选择，以尽可能减少外部碳污染的风险。例如，使用内径1.0毫米、外径2.84毫米的铂固化硅胶管将柱子与蠕动泵连接起来，再将泵与全玻璃收集瓶连接。柱子内部填充了约1厘米（约0.8毫升）的玻璃棉，随后加入约1.4克（约1.2毫升）经过酸处理和煅烧的纯化海沙。加入约105.3毫克（约2.8毫升；相当于一个样品床体积）的MWCNTs（见图1），并用玻璃棒轻轻压实。最后，在柱子顶部再填充一层相同厚度的海沙。柱子的总填充体积约为5–7毫升。接着，向柱子中加入约3–5毫升的MilliQ水并让其平衡90–120分钟。之后，用约14毫升的水冲洗柱子，冲洗时间约为柱子床体积的五倍。使用远大于柱子内部空间的水量以确保彻底清洗。同时，也进行了一组空白实验（不加入测试材料）。从连续流动的柱子中收集了5–7个连续样品（每个样品体积约为28毫升）。研究了两种流速：0.45毫升每分钟（收集时间约1小时）和0.25毫升每分钟（收集时间约2小时）。收集的样品直接使用总有机碳（TOC）分析仪进行NPOC方法分析。

MWCNTs在模拟环境介质中的分散稳定性研究采用了OECD TG 318（参考文献18）和OECD GD 318.4中描述的筛选测试方法。主要报告了K-Nanos的结果，因为Jenotubes在研究初期由于经验有限而未进行充分测试。这导致某些测试条件不太理想，尤其是对于Jenotube 8（作为该系列中的第一个测试纳米形态）。尽管如此，Jenotubes的结果也在相应部分进行了展示和简要讨论。根据K-Nanos MWCNT的形态，将52.6–93.22毫克的样品加入250毫升的Erlenmeyer烧瓶中，使用1毫升超纯水和1毫升乙醇（99.8%，Chemsolute）在25°C下预湿润24小时。加入乙醇是为了更好地润湿这些内径较小的纳米管。制备的储备溶液总量为125毫升超纯水，浓度为样品颗粒浓度的10倍。使用经过热量计校准的探针式超声波发生器（Bandelin SONOPLUS 2200.2系列，VS 70 T探头，直径13毫米），设置瞬时超声功率为0.16瓦特每毫升，相当于能量密度为0.16焦耳每毫升。超声处理在冰浴中进行，探头浸入液体的深度为2.5厘米，处理时间为600秒，向悬浮液中传递的总能量为96焦耳每毫升。模拟环境介质是在含有10毫克每升溶解有机碳（DOC）的超纯水中制备的，这些有机碳来自Suwannee河的天然有机物（NOM）。使用的电解质（Ca(NO3)2·4H2O）浓度分别为0毫摩尔、1毫摩尔和10毫摩尔，pH值分别为4、7和9。共设置了九种测试条件，每种条件重复三次，总共制备了27个50毫升的样品管。使用的颗粒数浓度约为5×10^12个MWCNT颗粒每升（详见补充信息表S3）。根据MWCNT的密度和单个样品管的体积计算出达到目标浓度（5×10^12颗粒每升）所需的质量浓度，这个计算值可能略微高估了实际颗粒浓度。在将样品加入每个试管的过程中持续搅拌，以防止样品材料过早聚集（详见补充信息图S2）。在0小时和6小时时分别测量了分散稳定性。在0小时时，从试管顶部0.5–1厘米的液体中小心取出0.25毫升样品并转移到96孔板上。这种偏离TG 318（0.5毫升样品体积）的做法是因为板读数器的每个孔最大容纳体积有限。我们选择这种方法是因为它可以在MWCNTs发生沉淀之前快速确定其分散稳定性。这种调整被认为对测量结果没有负面影响。6小时后（详见补充信息图S1和S3），将样品管以485克每分钟的离心速度离心10分钟，以沉淀较大的聚集体（大于1微米）。然后从上清液顶部小心取出0.25毫升样品。收集的样品立即使用UV-Vis分光光度计（Tecan, SPARK）分析MWCNT颗粒浓度，从而几乎可以同时和立即分析96孔板上的所有样品。MWCNTs在550纳米处有一个小的吸收峰，这个峰被用于定量分析。使用标准曲线（质量浓度与550纳米处吸光度的关系，其中NOM的DOC浓度为10毫克每升）将吸光度值转换为颗粒数浓度，并计算分散稳定性百分比。电解质的存在对550纳米处的吸光度没有影响。

在连续活性污泥测试中进行了预阶段研究，遵循了OECD TG 303A的方法。测试使用了Jenotube 8 MWCNTs。测试悬浮液在预湿润后，分别以3毫克、30毫克和300毫克每升的浓度制备，方法是将Jenotube 8 MWCNTs与去矿物质水混合，并加入非离子表面活性剂Tween 80（300毫克每升）。充分搅拌后，对悬浮液进行超声处理。超声处理可以使用超声波水浴（40瓦特）或探针式超声波发生器（40瓦特），探头尖端置于液面下2.5厘米处。二次活性污泥来自荷兰Duiven的Nieuwgraaf污水处理厂，该厂主要处理生活污水。实验使用的出水与OECD TG 303A中描述的出水相当。在模拟的污水处理厂（STP）系统中，通过注射泵将测试材料加入连续活性污泥（CAS）反应器中（详见补充信息图S4）。注射泵内的搅拌棒确保了添加过程中的持续混合。通过向活性污泥处理厂的出水中加入MWCNT储备悬浮液，评估了MWCNTs的光谱分析可行性。

UV-Vis分光光度分析的校准曲线是根据含有50毫克每升Jenotube 8 MWCNT和500毫克每升Tween 80的储备悬浮液制备的。首先将MWCNTs在少量去矿物质水中湿润24小时，然后将湿润后的MWCNTs稀释到目标浓度，混合2小时后在水中超声处理30分钟，随后再搅拌48小时。在校准曲线制备过程中，悬浮液在水中经过第二次30分钟的超声处理，并在搅拌板上持续搅拌。总共从两个不同的储备悬浮液中制备了两条校准曲线（详见补充信息图S5）。MWCNT悬浮液使用UV-Vis分光光度计（HACH, DR6000）在550纳米波长下进行分析，使用5厘米光程的比色皿。

Jenotube 8 MWCNT样品通过扫描电子显微镜（SEM）和光学显微镜进行了观察，既观察了“原始状态”也观察了制备成浆液后的状态。浆液是通过将少量样品材料分散在5毫升水中并使用超声波浴超声处理（5分钟）制备的。SEM图像是在Zeiss Crossbeam 540 FEG-SEM（场发射枪，1千伏，250皮安，工作距离3毫米）上获得的。未经处理的样品固定在带有碳涂层的铝制样品台上，而浆液样品滴则干燥在另一个铝制SEM样品台上。为了防止电子束充电，样品表面进行了碳涂层处理（12纳米）。浆液样品的光学图像使用Zeiss AxioImager（10倍和50倍物镜）获取。为了评估MWCNTs在活性污泥中的可检测性，使用Witec Alpha 300 RA显微镜分析了未经处理的Jenotube 8 MWCNTs和污泥滴。参数包括532纳米激光（1毫瓦功率，0.5秒曝光时间，单次光谱叠加128次扫描），放大倍数为50倍至100倍。

为了评估MWCNTs在污水处理厂（STP）系统中的命运，实验确定了K-Nanos和Jenotube MWCNTs的同位素特征。使用元素分析-同位素质谱法（EA-IRMS）分析了碳同位素比值（13C/12C，表示为δ13C-TC（总碳）），参考标准为Vienna Peedee Belemnite（VPDB），分析精度为1σ = ± 0.3‰。

在两种流动实验（0.45毫升每分钟和0.25毫升每分钟）中，样品和空白对照组之间的碳浓度差异在统计上并不显著（t检验，假设方差不等；p > 0.05）。新开发方法的检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为：K-Nanos MWCNTs实验的50.7 μg C L?1（LOD）和126.4 μg C L?1（LOQ），Jenotubes MWCNTs实验的57.4 μg C L?1（LOD）和141.2 μg C L?1（LOQ）。对于所有K-Nanos和Jenotubes形式，校正后的碳浓度测量结果均低于50.7 μg C L?1和57.4 μg C L?1。因此，与空白样品相比，未观察到MWCNT测试材料中有可检测到的碳溶解（见表1）。

表1：MWCNT样品和空白样品的平均碳浓度（n = 5–8）

样品 测试项目 空白样品
平均碳浓度 [μg L?1] 平均碳浓度 [μg L?1]
流速 [mL min?1]
0.45 0.25 0.45 0.25
K-Nanos 100 82.1 134.1a 107.2 ± 52 107.5 ± 89
K-Nanos 210 55.6 68.7
K-Nanos 300 63.2 106.9
Jenotube 6 112.7 70.6 108.6 ± 50 86.2 ± 31
Jenotube 8 123.5 53.8
Jenotube 10A 70.6 70.6
Jenotube 10B 49.7 62.2

K-Nanos：LOD：50.7 μg C L?1；LOQ：126.4 μg C L?1。Jenotubes：LOD：57.4 μg C L?1；LOQ：141.2 μg C L?1。值a表示平均浓度高于LOQ（n = 5），可能为实验误差。

K-Nanos MWCNT纳米形式的分散稳定性始终较低，在所有九种测试条件下（涉及不同的电解质浓度和pH值）测量结果均低于10%（范围为0–8.7%）。根据OECD TG 318标准，K-Nanos MWCNTs属于“分散稳定性低”的类别。Jenotube MWCNT纳米形式的分散稳定性也低于10%（范围为0–6.3%），但Jenotube 8的例外，其分散稳定性为14.2–17.2%。然而，Jenotube 8的较高值是由于测试浓度过低导致的，这导致对其稳定性的高估（参见补充信息表S3）。视觉观察显示，所研究的MWCNT样品迅速形成了不均匀的悬浮液，表现为松散的可见团聚体，并沉淀在测试试管底部（参见补充信息图S1和S3）。对原液的视觉观察还表明，K-Nanos和Jenotube MWCNTs在几分钟内就形成了均匀分布的团聚体，之后这一过程变慢（见图S3）。总之，无法获得稳定的分散状态，因此认为K-Nanos和Jenotube MWCNTs都是不可分散的。

**降解和吸附/解吸筛查**

**连续活性污泥测试**

当在去离子水中以3、30和300 mg L?1的浓度添加Jenotube 8 MWCNTs时，所有测试浓度下都迅速形成了较大的团聚体。即使搅拌混合物超过72小时，也无法分散这些团聚体（见图2）。即使在最低MWCNT浓度下也明显形成了团聚体。超声波分散和分散稳定性部分描述的方法最初减少了团聚体的数量；然而，它们很快又重新出现，且无法实现稳定的分散。此外，连续长时间的超声波处理也无法改善分散稳定性。添加Tween 80提高了测试悬浮液的均匀性，并减缓了超声波处理后的重新团聚现象。尽管如此，在含有300 mg L?1 Tween 80的混合物中添加MWCNTs仍然不切实际。虽然在用于加样的注射器中分散状态保持稳定，但在STP系统的注射器管中团聚体很快重新形成。由于泵送速度低（每天9.6 mL），这一问题更加严重，而这是测试指南所要求的。见图2。

**紫外-可见光谱（UV-vis spectroscopy）**

为了分析废水样品中的MWCNT浓度，需要进行线性校准。成功建立了去离子水中悬浮的Jenotube 8 MWCNTs的线性校准曲线，覆盖了10–100 mg L?1的浓度范围。曲线的线性表明MWCNT原液悬浮液是均匀的，这意味着可以通过移液法可靠地制备校准标准品（参见补充信息图S5）。然而，从两种不同原液悬浮液（均使用50 mg L?1 MWCNTs和500 mg L?1 Tween 80制备）得到的校准曲线之间存在显著差异。尽管它们在视觉上相似，但这些差异挑战了悬浮液制备方法的可重复性。由于550 nm处的吸光度缺乏足够的特异性（与废水的固有吸光度重叠），因此无法对10–100 mg L?1范围内的MWCNTs进行有效分析。

**扫描电子显微镜（SEM）分析**

干燥的Jenotube 8 MWCNTs的SEM图像显示了MWCNT束的团聚体（见图3）。这些团聚体肉眼可见，长度可达数百微米（见图3a和b）。在更高放大倍数下，图像显示MWCNT束由细小的单个MWCNT组成（见图3c和d）。使用超声波分散在去离子水中制备的干燥水悬浮液的SEM图像显示了一层较大的团聚体，几乎看不到单个纳米管。虽然超声波分散减小了MWCNT团聚体的大小，但很可能没有破坏纳米管本身。然而，很难确定超声波分散对MWCNTs的全面影响。这是因为样品中的大部分物质仍然以小团聚体的形式存在，且没有未经处理的、未缠结的MWCNT材料可供比较。对水基MWCNT悬浮液的光学显微镜观察证实，即使在搅拌后，团聚体仍然存在（见图2）。

**拉曼光谱（Raman spectroscopy）**

Jenotube 8 MWCNTs和活性污泥的拉曼光谱如图4所示，显示出明显的不同信号。对于MWCNTs的拉曼位移，G带（约1580 cm?1）代表碳纳米管（CNTs）高度有序的晶体晶格中的sp2杂化碳原子，而D带（约1330 cm?1）与结构缺陷或无序碳（如非晶结构）相关。Jenotube 8 MWCNTs的G带位于1583 cm?1，D带位于1332 cm?1（见图4）。G带表明样品具有高度有序的多层晶体结构（具体结晶度见补充信息表S2）。然而，活性污泥中含有会干扰MWCNT特征拉曼带位置的成分（见图4）。这种光谱重叠，加上活性污泥的不一致背景信号，使得任何定量分析都无法进行。尽管如此，通过将光学图像中观察到的结构差异与其相应的拉曼光谱进行关联，仍可以定性检测到MWCNTs（见图5）。具体来说，黄色和蓝色斑点被鉴定为Jenotube 8 MWCNTs测试材料。因此，虽然拉曼显微镜是检测活性污泥中MWCNTs的可行工具，但在这些测试条件下进行定量分析似乎不可行。

**碳的稳定同位素（13C/12C）**

K-Nanos和Jenotube MWCNTs的δ13C值如下：K-Nanos 100：?29.0 ‰；K-Nanos 210：?29.2 ‰；K-Nanos 300：?29.4 ‰；Jenotube 6：?29.5 ‰；Jenotube 8：?30.6 ‰；Jenotube 10A：?27.4 ‰；Jenotube 10B：?27.9 ‰。

**根据REACH附件VII第7.7节的水溶性及溶解速率**

碳在环境中普遍存在，也可能从实验室设备中释放出来，这使得测量环境中碳基纳米材料溶解的碳变得具有挑战性。尽管已知MWCNTs是不溶的，但根据REACH法规，提供有关水溶性和纳米材料溶解的数据是一项强制性要求。对于“不溶于水”的物质，需要执行直至分析方法检测限的限值测试，如REACH附件VII第2列所规定。因此，我们开发了一种新的方法，结合了OECD TG 105（参考文献16）和OECD GD 318（参考文献4），使用无碳材料或那些可以基本排除含碳化合物释放的材料。这种方法基于初步研究的发现。例如，用于分离未溶解MWCNTs的纳米级过滤器（5 kDa分子量截止；聚醚砜）即使在超纯水中储存三周并经过15次离心处理后，仍会释放相当量的碳（约200 μg L?1）。对于MWCNTs，可以从实验设置中去除纳米过滤器。MWCNTs的高长度及其聚集状态阻止了它们通过标准玻璃滤膜（孔径160–250 μm），这一点得到了玻璃棉和海沙屏障的支持。我们能够有效消除实验室设备中的碳污染，如表1中的测量碳浓度所示；所有值均低于整个研究中使用的超纯水的背景碳水平（<200 μg L?1）。这种新方法的碳检测限较低，能够证明所有测试MWCNTs的（碳）不溶性。由于测试材料中的测量浓度与空白样品没有显著差异，因此测量到的碳浓度归因于超纯水中的背景碳。此外，还应用了非常灵敏的NPOC分析，其LOD和LOQ值分别为约50–55 μg C L?1和125–140 μg C L?1。这些值显著低于科学文献中报告的LOD和LOQ值（例如100 μg C L?1和800 μg C L?1；24；96 μg C L?1和480 μg C L?1；25；160 μg C L?1和800 μg C L?1，26,27）。因此，我们提出了一种适用于具有相似物理化学性质的某些碳基纳米材料的碳溶解到水中的新方法。

**根据REACH附件VII第7.8节的分配系数n-辛醇/水（partition coefficient n-octanol/water）或分散稳定性**

由于MWCNTs被视为无机纳米材料，因此分配系数n-辛醇/水（log Kow）不适用。相反，分散稳定性成为相关的物理化学参数。测量MWCNT分散稳定性的主要挑战在于分析方法能否在介质中检测到测试材料。MWCNT浓度本身较低，且难以制备稳定的分散液，这使得总有机碳（TOC）分析不切实际。这是由于样品材料在分析测量过程中迅速沉淀，使得自动采样器和分析设备无法接触。此外，测试介质中存在的天然有机物（NOM）干扰了测量，导致背景值升高。因此，使用紫外-可见光谱法（UV-vis spectrophotometry）分析了测试材料浓度。测量使用的是光谱仪板读取器，可以在0小时或6小时孵育时间后，几乎同时立即分析27个样品的9个重复测量结果。这种方法目前是独一无二的，因为它能够立即分析多个样品的孵育结果，有效克服了样品快速沉淀和团聚的挑战。我们认为这种方法适当且足够灵敏，可以测量初始材料浓度的10%。例如，对于K-Nanos MWCNTs浓度为43.79 mg L?1（相当于每升5 × 10^12个颗粒），测得的LOD和LOQ分别为0.54 mg L?1和2.01 mg L?1。我们的方法对OECD TG 318的分析方法进行了重大实际调整，以适应MWCNTs带来的独特挑战，特别是它们快速沉淀和团聚的倾向。MWCNTs研究的另一个挑战是制备原液分散液。OECD TG 318提供了通过探针超声波处理制备原液分散液的建议，强调了对高长径比纳米材料需要谨慎的超声波处理程序，以避免其破坏。确实，正如Fuge等人28所确定的，仅向17.5毫升含有0.005%（w/w）未掺杂MWCNT的水分散液中输入1.2千焦（68.6焦耳/毫升）的能量，就显著降低了算术平均管长（通过扫描电子显微镜（SEM）测量，从接近1000微米降至17.1微米）。将能量输入增加到6千焦（342.9焦耳/毫升），并将超声处理时间延长至180秒后，平均长度进一步降至12.2微米。考虑到K-Nanos的原始管长约为50微米，因此认为向悬浮液中输入总共96焦耳/毫升的能量是一个可接受的折中方案，可以在最小化管子破坏/断裂的同时获得足够的分散效果。由于经合组织（OECD）TG 318推荐的分散时间为600秒，而时间积分总能量（焦耳/毫升）对分散结果至关重要，我们将瞬时超声功率降低到0.16瓦特/毫升。这样得到了目标的总能量96焦耳/毫升（介于Fuge等人28提到的条件之间）。相关的瞬时超声功率降低（0.16瓦特/毫升，相比之下Fuge等人使用的是约1.9瓦特/毫升）也可能降低了管子断裂的风险。我们的研究证实，使用适当的措施来控制施加到悬浮液中的超声能量（即瞬时超声功率（瓦特/毫升）和时间积分总能量（焦耳/毫升），以及使用经合组织TG 318推荐的体积（125毫升），对于获得可重复的结果非常重要。另一个重要方面是颗粒浓度。为了将储备悬浮液的质量浓度转换为颗粒浓度，可靠的密度和颗粒大小数据是决定性的。如补充信息（SI）中更详细说明的，动态光散射（DLS）——经合组织TG 318推荐用于确定储备分散液中颗粒大小的方法——不适用于MWCNTs。使用计算出的单个MWCNT体积来推导颗粒浓度——正如本研究所做的那样——是解决这个问题的一个可行方案。然而，这种方法可能会显著高估实际颗粒浓度，因为假设超声处理后分散液中只有单个MWCNTs是不现实的。由于颗粒浓度与分散稳定性之间存在反比关系，高估颗粒浓度等同于高估分散稳定性。总体而言，这些调整使我们能够在标准定量方法不可行的情况下，生成关于所研究MWCNTs分散稳定性的有意义且保守的数据。

实验结果一致表明，K-Nanos和Jenotube MWCNTs都是不可分散的。这一发现通过分散稳定性研究和标准测试程序（STP）可行性研究期间的光学显微镜观察得到了持续验证。无法制备稳定的分散液突显了测试这些材料的一个主要障碍。如果没有稳定的分散液或悬浮液，标准指南的适用性将受到严重限制，除非有特定的指导文件或测试协议关于如何制备纳米材料分散液或在测试过程中处理不稳定的测试悬浮液。最近发布的经合组织指导文件（GD）第420号（参考文献29）提供了关于如何准备和处理相关经合组织TGs（例如，OECD TG 201、TG 202或TG 203）中的纳米材料分散液的指导。对于体外/化学人类健康评估也是如此，例如遗传毒性或皮肤致敏性评估；如果没有特定的纳米材料分散液协议，大多数需要稳定分散液的评估都是不可行的。（关于标准化体外/化学人类健康评估是否适用于MWCNTs的评估是伴随文章15的主题）。根据REACH附件VIII的第9.2节和第9.3节进行降解和吸附/解吸筛选。

进行STP模拟测试以研究MWCNTs环境命运的可行性

进行STP模拟测试的可行性取决于是否有适合测试材料的分析方法。我们研究了各种分析方法（实际和理论方法），以确定在STP模拟研究中测量MWCNTs的可行性，遵循经合组织TG 303A“模拟测试——好氧污水处理——活性污泥单元”。19此外，我们为经合组织TG 303A开发了一个简化的理论质量平衡模型，该模型基于给定的实验数据和理论模型假设来模拟MWCNTs的潜在命运（补充信息图S6和S7）。分析挑战和替代方案

区分和量化MWCNTs与高碳背景是一项挑战，因为碳在污水、污泥固体和出水中普遍存在。鉴于MWCNTs的不溶性、较差的水分散性和高密度，它们主要与活性污泥固体部分一起分布在STP系统中，这与TiO2纳米颗粒的情况类似。30此外，由于它们的疏水性，我们预计MWCNTs会与活性污泥固体中的有机碳部分有更明显的吸附作用，相比之下金属和金属氧化物纳米颗粒则不会。31,32经合组织TG 303A规定的评估测试浓度的标准方法是测量溶解有机碳和总有机碳。然而，由于MWCNTs是一种含碳物质，吸附在活性污泥上的总有机碳（TOC）无法与活性污泥本身的TOC区分开来。尽管可以使用Tween 80制备相对稳定和均匀的MWCNT悬浮液用于可行性研究的实验工作，但由于注射泵管内MWCNT团聚体的快速形成，将这些悬浮液注入CAS单元是不可能的。手动将MWCNT悬浮液注入CAS反应器可能是另一种选择；然而，由于新鲜制备的MWCNT储备悬浮液与其随时间聚集之间的差异，手动添加的MWCNT含量的重复性值得怀疑。这里评估的MWCNTs检测的替代分析方法包括UV-Vis光谱、SEM显微镜和拉曼光谱。不幸的是，这三种技术在用MWCNT悬浮液增强的出液样品进行研究时，对于从高碳背景中区分测试材料来说不够敏感。此外，测试基质中的杂质也复杂化了MWCNTs的识别和量化。显微镜技术本质上只能提供MWCNTs的定性分析。光学显微镜和SEM都缺乏特异性，而且出液基质中的成分会显著妨碍MWCNTs的识别。8鉴于CAS测试出液中预期的MWCNT浓度较低，使用这些方法进行定性评估需要浓缩。同时浓缩出液也会富集现有的固体和杂质，进一步复杂化显微镜分析。虽然拉曼光谱对MWCNTs的sp2碳晶格具有高度特异性，但在高碳背景（如活性污泥）中其灵敏度受到严重限制。生物基质，包括污水和污泥固体，含有许多荧光团，在拉曼激光激发下会发出宽而强烈的信号，常常掩盖较弱的拉曼散射。33,34活性污泥特别富含有机物质，如细胞外聚合物和腐殖质。后者以其能够吸附到碳纳米管（CNT）表面而闻名，这可能导致测量光谱响应的淬灭。35文献表明，这些生物成分表现出宽泛的荧光，可能会掩盖CNTs的特征性石墨峰，使得定量检测变得复杂。36来自生物来源的高背景降低了信噪比（SNR），使得在环境相关（低）浓度下难以检测到CNTs。8,33这与我们的发现一致：虽然光学图像中的结构差异允许进行定性关联，但污泥颗粒的不一致背景信号阻止了可靠的定量方法。我们得出结论，根据经合组织TG 303A，在STP模拟研究中使用UV-Vis光谱、SEM分析和拉曼光谱进行MWCNTs的环境命运测试是不可行的，即使适当的剂量是可行的。同位素比值（δ13C）代表了一种可行的替代方法，因为它们提供了一种质量平衡方法，而像拉曼这样的光学技术在非均匀的生物浆料背景下无法提供。

作为监测STP模拟中MWCNTs环境命运的潜在分析手段，研究了同位素特征。8该方法基于这样一个前提：MWCNTs和污水污泥之间稳定的碳同位素比值（12C和13C）的差异可以用来追踪MWCNTs的积累。我们通过实验确定测试MWCNT纳米形式的同位素比值，并从理论上考虑了随时间富集在MWCNTs中的出液，这取决于样品剂量和向STP系统供应的污泥（补充信息图S6和S7）。由于MWCNTs的生产主要基于化石原料，与环境生物基质相比，它们的δ13C含量可能会显著减少。因此，基于同位素特征来分析MWCNTs的可行性取决于MWCNTs和污水污泥之间δ13C值的显著差异。同位素特征δ13C由两种稳定碳同位素13C/12C的比值R决定，并以千分之一（‰）的形式相对于VPDB参考材料报告（方程（1）。

实验确定显示，K-Nanos和Jenotube的δ13C值范围从-30.6‰到-27.4‰。这个范围与活性污水污泥报告的δ13C值相似，后者通常在-24.0‰到-28.0‰之间（表2，补充信息表S4）。37基于可用的活性污泥和MWCNTs的实验δ13C值，我们简化假设δ13CMWCNTs = -30‰和δ13Csludge = -25‰，导致同位素特征差异（Δδ13C）为5‰。表2

STP污泥和K-Nanos及Jenotube MWCNTs的δ13C值

样本
δ13C [‰]
参考

STP污泥的δ13C值

来自20个STPs的活性污泥——德国来源
-24.0到-28.0
UBA37

测量的MWCNTs的δ13C值

K-Nanos 100
-29.2
本研究

K-Nanos 210
-29.0

K-Nanos 300
-29.4

Jenotube 6
-29.5

Jenotube 8
-30.6

Jenotube 10A
-27.4

Jenotube 10B
-27.9

a
测量标准偏差/标准误差（SEM），方法精度：1σ = ± 0.3‰。在STP模拟研究的理论质量平衡方法中，我们假设99%的吸附和随时间的连续剂量。我们通过应用双样本t检验原理来计算最小显著差异（LSD），以确定将基线污泥（-25‰）与富集MWCNTs的污泥在统计上区分所需的最小δ13C变化。根据给定的模型假设，CAS反应器中的活性污泥应包含约48%的MWCNTs，以确保同位素变化在统计上是显著的（补充信息图S7）。因此，只有当（1）能够实现高积累水平，或者（2）MWCNTs（或SWCNTs）和活性污泥的同位素特征之间存在较大差异时，对基于碳的纳米材料应用稳定同位素分析才可能是一种可行的分析方法来确定STP模拟研究中MWCNTs的分布。在其他地方也报告了MWCNTs和SWCNTs的显著更负的δ13C值38（补充信息表S4）。这种变化取决于纳米材料生产过程中使用的碳源。此外，还需要进一步细化和评估模型及其假设；具体来说，需要验证假设的99%吸附率以及在活性污泥中产生可检测到的δ13C变化所需的MWCNT高比例的合理性。δ14C的同位素特征是另一种选择，可以区分生物碳和化石碳。这将需要通过加速器质谱（AMS）在燃烧后确定14C/12C比值。使用这种方法，活性污泥的生物碳含量被确定为约80%。37相比之下，由化石碳原料生产的CNTs不应含有14C。使用同位素特征的另一个复杂性是预期的基线污泥在三周测试期间稳定同位素比值的变化，这是由于用合成碳源（蛋白胨、肉提取物和尿素）喂养活性污泥所致。因此，建立一个涵盖所有这些不同来源的全面碳质量平衡——活性污泥、剩余污泥和MWCNTs——被认为是复杂的，导致在监管背景下应用时的不确定性水平不可接受。最终，尽管δ13C或δ14C同位素分析似乎不适合作为区分K-Nanos或Jenotubes与污水污泥或废水的现实监测工具，但同位素特征可以作为一种方法来研究MWCNT的吸附/积累特性，通过统计上显著的δ13C变化来实现，这种变化可以通过质量平衡方法进行评估。这代表了研究碳基纳米材料环境命运的一种潜在途径。此外，由于MWCNT的δ13C值取决于其生产过程中的碳源，理论上的质量平衡方法（见补充信息图S7）证明了使用碳稳定同位素比率来量化碳基材料相对于标准温度（STP）背景的可行性，前提是纳米材料的δ13C值与STP碳源有显著差异。这一重要发现可能使该方法适用于其他碳基纳米材料。最后，考虑了在STP模拟系统中使用金属元素来追踪MWCNT的方法，利用已知的MWCNT金属杂质作为示踪剂。然而，这种方法被证明是不可行的，因为金属杂质从CNT基质中的溶解情况并不一致，现有金属溶解研究（未发表）也表明了这一点。因此，来自MWCNT杂质的金属元素不能作为在各种测试隔室/介质中定量平衡MWCNT浓度的可靠方法。

关于OECD TG 303研究的可行性

在现有的分析方法中，没有一种方法能够轻松适用于测量OECD TG 303A研究中评估的MWCNTs。因此，从技术上讲，这项指导性研究在本研究的实验设置下是不可行的。虽然应用质量平衡模型和同位素特征仍然是研究STP模拟中MWCNTs环境命运的一种有前景的方法，但需要对模型的假设进行深入调查（例如，吸附速率）。由于引言中讨论的原因，无法测试额外的实验条件，同时考虑到也没有合适的分析技术。总体而言，由于缺乏能够可靠分析和监测环境介质中MWCNTs的定量分析方法，目前无法进行全面的环境命运研究。这一发现与ECHA发布的报告一致，该报告指出“当前的分析方法在满足碳基纳米材料监管要求方面存在显著差距”。除了普遍存在的碳背景外，复杂环境基质中的其他成分——如不同类型的溶解有机物、无机盐或悬浮颗粒物——也增加了分析的复杂性。这些成分的干扰可能导致假阳性结果、信号减弱或掩盖MWCNT特有的信号（例如，紫外-可见光或拉曼光谱），从而增加了在环境相关样本中准确检测和量化MWCNTs的难度。因此，必须开发标准化的量化方法，作为进一步改进MWCNTs测试指南的先决条件。

结论

我们提供了关于标准测试指南和分析方法在满足碳基纳米材料监管要求方面的适用性、可行性和适宜性的全面、先进的评估，这些评估基于实际操作和材料特定的经验。我们的工作：（i）探讨了克服与MWCNTs碳基性质相关的分析挑战的各种方法；（ii）承认了所应用分析方法的进步和局限性；（iii）概述了未来研究的潜在新方法；（iv）为更广泛的科学界提供了来自碳基纳米材料实际REACH注册过程的见解。本研究表明，在复杂环境介质中可靠量化MWCNTs目前的技术不可行性，这对根据REACH等法规进行稳健的环境风险评估构成了根本性挑战。没有可靠的命运数据，暴露建模和随后的风险特征描述就变得非常不确定。这需要监管机构和行业利益相关者讨论替代的评估策略，例如依赖现实的暴露情景、从具有更好分析方法的类似材料中进行类比，或开发新的非分析评估方法。未来的研究工作应集中在高度敏感、选择性和定量的分析技术上，这些技术能够克服高碳背景和基质干扰。这可能包括探索具有特定标记策略的先进质谱技术，用于MWCNTs，或开发能够选择性地结合到复杂基质中的新型光学探针。此外，研究能够将高度聚集的纳米材料可靠地输送到动态环境模拟系统中的定制给药系统仍然至关重要。最后，我们考虑改进和进一步发展所提出的质量平衡模型，并结合使用同位素特征，作为一种有前景的环境命运评估工具。总体而言，这项研究支持合规专业人士、监管机构和研究人员填补与碳基纳米材料环境命运评估相关的信息空白。

作者贡献

Marie-Léonie Bohlen负责概念化、撰写——原始草稿准备、正式分析、验证、可视化和监督。她在撰写——审阅与编辑以及方法论方面做出了重要贡献，特别关注OECD TG 303A适应和拉曼光谱的正式分析方面。Markus Schwarz在概念化、方法论和验证方面做出了重要贡献，他的主要工作集中在分散稳定性、纳米材料溶解、STP模拟的可行性研究以及使用同位素特征对OECD TG 303A的适应上。他还参与了撰写——审阅与编辑。Stefan Gartiser在OECD TG 303A适应的概念化和方法论（研究设计）中发挥了重要作用，并协助撰写——审阅与编辑。Jan Oltmanns在方法论（分散稳定性、纳米材料溶解和OECD TG 303A适应）和撰写——审阅与编辑方面做出了贡献。Hana Jo和Yeojin Lee参与了撰写——审阅和项目管理。Hyun Pyo Jeon负责资金获取。

利益冲突

没有需要声明的利益冲突。

数据可用性

支持本文的数据已作为补充信息（SI）的一部分包含在内。补充信息可获取。详见DOI: https://doi.org/10.1039/d5en01018g。

致谢

本工作得到了韩国环境部（MOE）作为化学物质安全管理研究生院的支持。此外，还得到了JEIO有限公司和韩国Kumho Petrochemical有限公司（KKPC）的支持。作者感谢外部合作伙伴提供的技术和概念贡献：Rikki Rosenfeldt，nEcotox GmbH（OECD TG 105, 318；OECD GD 318）；Brenda Rossenaar和Roy Geerts，Nouryon Specialty Chemicals B.V.（OECD TG 303A的设计可行性研究）；Siegmund Ertl，Hydroisotop GmbH（同位素分析和STP模拟研究设计）。

注释和参考文献
脚注

Nouryon Specialty Chemicals B.V.（2022年），受TSafeE GmbH委托代表JEIO有限公司进行。