减少耕作并间作冬百里香（Thymus hyemalis）能够重塑半干旱地区杏仁果园中稀有的土壤微生物群落及其共存网络

《Journal of Sustainable Agriculture and Environment》：Reduced Tillage Intercropping With Thymus hyemalis Reshapes the Rare Soil Microbiome and Co-Occurrence Networks in a Semi-Arid Almond Orchard

　　**摘要**

环保型农业实践正受到越来越多的关注，间作是一种保护土壤健康的有前景的选择，然而其对果园微生物群落和功能的影响仍研究不足。在这项研究中，我们评估了在半干旱的地中海气候果园中，将刺山柑（Capparis spinosa，D1）和冬百里香（Thymus hyemalis，D2）与杏仁同时种植，并结合减少耕作方式的3年试验效果。通过宏基因组测序（细菌/古菌使用16S rRNA基因，真菌使用ITS区域）分析了土壤中的细菌和真菌群落，利用基因丰度指标推断其功能潜力，并构建了共现网络以评估微生物连接性的变化。这两种间作方式以及减少耕作方式都改变了土壤微生物组成，丰富了促进植物生长的属（如Amycolatopsis、Bosea、Dyadobacter、Janthinobacterium、Leifsonia）和AMF（Glomeromycota），其中D2的效果更为显著。减少耕作和种植冬百里香还增加了较少见细菌的丰富度，增强了与氮固定、纤维素分解和发酵相关的功能潜力。同时，这些措施也使共现网络更加紧密，具有更多的模块枢纽——这些模式与更高的功能稳定性一致。总体而言，与减少耕作结合种植冬百里香的方案比种植刺山柑更能增强有益的土壤微生物群落并提升其功能潜力。长期监测对于确保间作的有益效果持续存在并转化为实际的农业收益至关重要。对于农民来说，与百里香间作不仅能够改善土壤健康和功能潜力，还能通过生产精油等产品获得额外收入，而不会影响杏仁果园的产量。这种双重效益支持了半干旱地区更可持续和更具盈利性的农业发展。

**1 引言**

集约化农业方式，其特征是单一作物种植、化学投入过度以及高频率的耕作，导致了土壤的严重退化。这些做法降低了土壤健康度，减少了土壤微生物的生物多样性，并增加了对病虫害的敏感性（Bedolla-Rivera等人2023年；Cuartero等人2025年；Gr?ini?等人2023年）。此外，这些集约化农业方式还改变了土壤的物理和化学性质（例如减少了有机质含量；Lal 2020年），并增加了温室气体排放（例如二氧化碳排放；Chataut等人2023年），从而加剧了气候变化。杏仁能够在多种土壤和环境中茁壮成长（De Boni等人2022年），包括那些其他作物可能表现不佳的雨养条件下，并因其耐旱性而在干旱地区广受欢迎。传统上，杏仁通常采用单一作物种植并配合耕作（Martínez-Mena等人2013年），这些做法会加速土壤退化并降低土壤的恢复力。这种恢复力的丧失尤其令人担忧，因为杏仁还容易受到极端天气、水资源短缺和偶发事件的影响，而随着气候变化，这些压力预计将在未来几年加剧（Freitas等人2023年）。因此，迫切需要开发能够增强作物恢复力、提高水资源利用效率并保护长期土壤健康的创新农业系统。间作是一种同时种植两种或更多作物的农业方式，是恢复土壤健康和提升农业可持续性的有希望的解决方案（Weih等人2022年）。通过增加植物多样性，间作可以显著改善土壤结构、抑制杂草生长、优化养分循环甚至提高作物产量（Cuartero等人2022年）。这些益处的关键机制是刺激和多样化土壤微生物群落（Dang等人2024年），这些微生物通过有机质分解驱动碳和氮的循环，释放可供植物利用的营养物质，最终改变化学物理性质（如酸杆菌门?zbolat等人2023年）。然而，在干旱土壤中实现这些积极变化更具挑战性，因为干旱土壤本身具有不稳定性——有机质含量低、持水能力差且易受侵蚀（Srinivasarao等人2023年）。因此，在干旱条件下选择替代作物并非易事；有限的水资源和养分供应加剧了物种间的竞争，可能会抑制主要作物的生长，加剧养分流失并增加病虫害压力（Stott等人2023年）。在这种情况下，百里香（Thymus hyemalis）和刺山柑（Capparis spinosa）是适合杏仁果园的理想间作作物，因为它们原生于地中海地区，能够适应半干旱条件下的低水分和养分供应，并能提供额外的产品——百里香的精油和刺山柑的可食用芽，从而增加农场收入（De Martino等人2015年）。土壤物理和化学性质的变化缓慢且变化很大，可能需要数月甚至数百年的时间。在这种情况下，微生物为观察土壤变化提供了快速的方法：它们的体积小、世代周期短，使它们对环境变化比大块土壤属性更为敏感。因此，微生物种群和活动的变化可以作为土壤健康变化的优秀指标（Joos等人2023年），在某些情况下，这些变化甚至可能早于土壤物理和化学性质的可见变化。尽管微生物群落通常作为一个整体进行研究，包括同一环境中的所有微生物，但一些研究表明特定微生物的丰度与其在土壤中的功能角色密切相关（Zhou等人2022年）。最丰富的微生物通常与生物量生产和能量流动相关，而较不丰富的微生物（常被称为“稀有微生物”）则有助于物种丰富度和提高生态系统恢复力（Zhou等人2022年）。此外，不同研究还表明，某些微生物成员可以在模块内部和整个群落中发挥关键作用，表明它们在维持生态系统稳定性方面的重要性（Coyte等人2015年；Cuartero等人2024年）。这些微生物 often 作为一个微生物网络中的枢纽，协调不同微生物群体之间的相互作用。这表明，要全面了解间作对土壤微生物群落的影响，需要深入研究它们。这不仅涉及研究不同物种丰度的显著变化，还包括考察它们在群落中的角色及其功能贡献。DNA宏基因组测序等分子技术的进步使我们能够全面分析微生物多样性、分类学和功能潜力，从而详细评估土壤微生物群落。在这项研究中，我们首次评估了在地中海气候条件下，将百里香和刺山柑与杏仁树间作的效果，分析了土壤微生物群落、它们的潜在功能角色以及微生物的共现情况。为此，我们设定了三个主要目标：（1）评估减少耕作和间作对土壤细菌和真菌群落多样性和相对丰度的影响；（2）评估土壤微生物组功能潜力的变化，并识别与每种处理相关的微生物指标；（3）分析微生物共现网络的变化，并识别每种处理的关键微生物物种。

**2 材料与方法**

**2.1 研究地点和实验设计**

实验在西班牙东南部穆尔西亚的一个商业杏仁果园（Prunus dulcis [Miller] D. A. Webb）进行，该果园面积为2.63公顷，共有540棵杏仁树，每棵树之间的间距为7米×7米。关于实验地点的详细信息由Sánchez-Navarro等人（2022年）提供。该地区的年平均气温为18摄氏度，年降水量为280毫米，属于半干旱的地中海气候。潜在的蒸散量为每年1300毫米。土壤被归类为钙质肥沃冲积土（IUSS工作组WRB 2014）。土壤的质地为粉壤土（含沙子9%、粉粒26%和黏粒25%），CaCO3含量为59%，pH值为8.4，容重为1.30克/立方厘米，总有机碳含量为3.86克/千克，0-30厘米耕作层（可耕地层）的阳离子交换 capacity 为14.5厘米摩尔/千克。实验采用随机区组设计，共有三种不同的处理方式，每种处理重复三次（n=3）。每个实验区的面积为210平方米，包含五棵树。处理方式如下：（1）传统耕作的杏仁单一种植（每年用锄头耕作两次，深度为20厘米，MC）；（2）减少耕作的杏仁种植（使用Lander 180旋耕机每年耕作两次，深度为20厘米，仅在每棵树周围1.5米范围内，其余区域不进行耕作，并种植刺山柑作为行间作物（D1）；（3）如D1所述的减少耕作方式，并种植芳香植物冬百里香作为行间作物（D2）。2018年1月10日，从附近的苗圃购买了刺山柑幼苗，并以3.5米×3.5米的间距手植；2018年5月11日，从附近苗圃购买了冬百里香幼苗，并在每棵树周围的行间区域手植，间距为1米×0.5米。需要注意的是，这两种植物在当地是自发生长的，属于本地植物群，表明它们很好地适应了当地条件。此外，选择这些植物是基于农民、合作社和科学家的参与式系统，旨在寻找能在杏仁果园中实现多样化的方法，从而降低投入，无论是有机物还是灌溉方面。所有处理区都采用雨养方式。在MC处理中未使用除草剂，杂草控制通过耕作实现。在D1和D2处理中，行间区域不进行耕作。因此，D1和D2处理区主要被Artemisia herba-alba Asso、Piptatherum miliaceum (L.) Coss、Dittrichia viscosa (L.) Greuter、Phagnalon saxatile (L.) Cass.、Sonchus tenerrimus L. 和 Diplotaxis erucoides DC等杂草占据。然而，由于杂草密度较低（见支持信息图S1–S3，杂草与刺山柑和百里香的比率为3:2），未观察到对行间作物的负面影响。

**2.2 土壤采样和土壤物理化学方法**

2021年3月，在实施间作三年后，使用钻探器在0-10厘米深度采集了土壤样本。这一深度是管理措施引起的变化最为明显的层次，之前的研究也指出了这一点（例如在 Mediterranean 和半干旱农业生态系统中的耕作、覆盖作物和绿肥的影响，?zbolat等人2023年）。为了减少田间变异性，从每个实验区的行间采集了三个复合土壤样本。每个复合样本由该区域内随机选取的五个子样本组成，每种处理共获得九个复合样本进行研究。批量土壤样本在树距2米的行间区域采集。在D1和D2处理中，土壤样本分别在两株冬百里香（每株植物之间0.30-0.50米）和两株刺山柑（每株植物之间1.00-1.50米）之间采集，以避免根际的直接影响。批量土壤样本分为两部分，一部分储存在冷藏箱中并加入冰块以用于生物分析（测定硝酸盐和铵含量），另一部分在室温下保存以用于物理化学分析。样本立即被送往实验室。对于物理化学分析，土壤首先风干一周。为了确定土壤颗粒大小分布，一部分干燥后的土壤被筛分为小于8毫米的颗粒，另一部分被筛分为小于2毫米的颗粒。土壤样品在实验室中被筛分用于微生物群落分析、硝酸盐和铵含量的测定，后者在-20°C下保存。土壤pH值在去离子水中以1:2.5（重量/体积）的比例测定。总氮（TN）和总有机碳（TOC）含量（克/千克）使用N/C元素分析仪（Flash 1112 EA，Thermo Finnigan，德国不来梅）测定，去除碳酸盐后使用1 M HCl。其余分析（包括电导率、有效磷、颗粒有机质、阳离子交换 capacity、水分含量以及微量和大量营养素浓度）按照既定协议进行（Almagro等人2023年；Sánchez-Navarro等人2025年；Sansupa等人2021年）。对于参与硝化和反硝化过程的基因，我们使用了以下引物组合：正向引物amoA1F、nirK876F、narG1960m2F；反向引物amoA2R、nirK1040R、narG250m2R。有关PCR细节和引物序列的详细信息，请参见Sánchez-Navarro等人（2025年）。关于间作和耕作对土壤性质及作物产量影响的详细信息，可以参考Almagro等人（2023年）和Sánchez-Navarro等人（2022年）的研究。

2.3 DNA提取、PCR分析及病原体检测

土壤DNA的提取采用了DNeasy PowerSoil Kit（Qiagen，德国）。提取的DNA质量通过NanoDrop One（ThermoFisher Scientific，美国）仪器计算A260/A280和A260/A230比值来评估。DNA浓度使用Qubit荧光计（ThermoFisher Scientific，美国）进行测量，具体方法如Cuartero等人（2021年；Fritze等人（2024年）所述。细菌群落组成通过测序16S rRNA高变区进行研究，使用的是Ion Torrent Personal Genome Machine（PGM，英国伦敦）。测序所需最低DNA量为18 μL，浓度需≥1.5 ng/μL，符合光谱质量标准（A260/A280 = 1.8–1.9，A260/A230 ≥ 1.9）。16S rRNA基因高变区的扩增使用了Ion 16S Metagenomics Kit（Thermo Fisher Scientific），该试剂盒包含针对V2–4–8和V3–6,7–9区域的两个引物对。根据制造商说明，这两个引物对的组合能够识别出广泛的细菌种类。每个30 μL的PCR反应体系中包含15 μL的2X Environmental master mix、3 μL的引物池（10X浓度）和2–12 μL的DNA模板。热循环条件为：初始变性95°C 10分钟，随后是18–25个循环，每个循环中变性95°C 30秒、退火58°C 30秒、延伸72°C 20秒，最后延伸72°C 7分钟。扩增产物使用Ion Xpress Plus Fragment Library Kit处理，并通过Ion Xpress Barcode Adaptor 1–96 Kit（Thermo Fisher Scientific）进行条形码标记。在文库制备过程中，加热和扩增反应之间使用DynaMag磁性架（Thermo Fisher Scientific）和AMPure XP Purification Kit（Beckman Coulter）进行纯化处理。最终文库的大小和浓度通过Agilent 2100 Bioanalyzer系统及Agilent High Sensitivity DNA kit（Agilent，加州圣克拉拉）进行检测。测序模板使用Ion OneTouch System和Ion PGM Hi-Q View OT2 Kit（Thermo Fisher Scientific）制备。测序在Ion Torrent PGM平台上进行，遵循Cuartero等人（2021年；Fritze等人（2024年）建立的协议。对于真菌ITS1区域的测序文库制备，采用了Smith和Peay（2014年）提出的改良方法。PCR扩增使用针对ITS1区域的特异性引物（ITS1f–ITS2）和Illumina接头。用于真菌ITS区域扩增的引物如下：正向引物：5′ GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG，反向引物：5′ GCTGCGTTCTTCATCGATGC。反向引物通过12碱基的Golay条形码进行多重化标记（Caporaso等人，2012年）。PCR扩增反应最终体积为30 μL，包含3 μL的10X缓冲液、0.7 μL的每种引物（10 mM浓度）、0.9 μL的50 mM MgSO4、0.6 μL的10 mM dNTP和0.12 μL的Invitrogen Platinum Taq DNA聚合酶高保真酶（产品编号11,304–011）。热循环条件为：初始变性95°C 3分钟，随后是35个循环，每个循环中变性95°C 45秒、退火50°C 1分钟、延伸72°C 1分钟，最后在72°C下延伸7分钟。扩增产物使用Ion Xpress Plus Fragment Library Kit处理，并用Ion Xpress Barcode Adaptor 1–96 Kit进行条形码标记。文库制备过程中的纯化步骤结合使用了DynaMag磁性和AMPure XP Purification Kit。最终文库的尺寸和浓度通过Agilent 2100 Bioanalyzer系统及Agilent High Sensitivity DNA kit进行检测。测序模板使用Ion OneTouch System和Ion PGM Hi-Q View OT2 Kit制备。测序在Ion Torrent PGM平台上进行，遵循Cuartero等人（2021年；Fritze等人（2024年）制定的协议。真菌ITS1区域测序文库的制备采用了Smith和Peay（2014年）提出的改良方法。

2.4 生物信息学数据分析

对于细菌，使用BaseCaller软件从原始序列中去除条形码、接头和引物。BaseCaller处理所得的单端序列使用ACACIA（Bragg等人，2012年）进行去噪处理。对于真菌，原始读段使用Trimmomatic（Bolger等人，2014年）通过20 bp的滑动窗口和20的质量阈值去除接头和低质量读段。配对端读段使用Pear（Zhang等人，2014年）进行合并。随后将序列导入QIIME2 v2019.1.0（Bolyen等人，2019年）软件。应用DADA2算法对序列进行去噪处理，截断平均质量分数大于25的序列（Callahan等人，2016年）。使用VSEARCH（Rognes等人，2016年）将序列聚类为操作分类单元（OTUs），相似性阈值设为97%。排除低置信度的OTUs，剩余序列使用‘classify-consensus-vsearch’命令进行分类，细菌参考SILVA 132数据库，真菌参考UNITE数据库版本8.2动态版本（Nilsson等人，2019年）。为了标准化采样深度并使处理组间可比，我们对序列数据集进行了稀释处理，使细菌组的最低读段数量为19,093个，真菌组的最低读段数量为4,039个。采样深度信息见支持信息图S4。

2.5 统计分析

在统计分析和稀释处理之前，将细菌和真菌的OTU表格分别存储到两个不同的数据库中：一个包含最丰富的细菌（MAB），另一个包含最丰富的真菌（MAF）。根据先前研究（Pedrós-Alió，2012年）报告的稀有生物群落的相对丰度低于0.1%或0.01%的结论，以及Wu等人（2021年）在土壤样本中使用的相同阈值得到的相似结果和结论，我们决定使用0.1%的阈值来分类最丰富的分类单元（Carrascosa-Robles等人，2024年；Cuartero等人，2022年；Qiu等人，2024年），其余分类单元分别视为较少丰富的细菌（LAB）和较少丰富的真菌（LAF）。仅保留出现在40%样本中的OTUs，使用microeco包中的‘filter_taxa’函数实现。所有统计分析均使用R版本4.2.3（R Core Team，2023年）进行，大部分函数通过microeco v.0.16.0（Liu等人，2021年）包执行。由于田间重复实验次数较少（n = 3），我们采用非参数的Kruskal-Wallis检验来评估处理组间的显著差异，随后使用rstatix v0.7.2（Kassambara等人，2023年）包中的‘kruskal_test’和‘dunn_test’函数进行成对比较。这些非参数方法特别适用于小数据集，因为它们不依赖于正态性或方差同质性的假设，因此在样本量有限的情况下提供了统计上稳健的方法。为了确保研究结果的可靠性，使用Benjamini-Hochberg校正方法对p值进行了调整。使用microeco v.0.16.0包中的‘trans_alpha’和‘trans_beta’函数计算alpha和beta多样性。在检验方差同质性后，使用vegan v2.6.4（Oksanen等人，2022年）包中的‘adonis’函数和999次置换进行PERMANOVA，以评估beta多样性的统计差异。使用RDA（Redundancy Analysis）方法通过vegan包中的‘rda’函数评估最丰富和较少丰富微生物（包括细菌和真菌）与土壤物理化学性质之间的关系。土壤物理化学性质效应的显著性通过vegan包中的‘ordiR2step’函数进行前向和后向选择检验。RDA模型包括通过‘ordiR2step’获得的变量作为解释变量，Hellinger变换后的微生物群落矩阵作为响应变量。为了识别不同处理组间在属水平上分类的显著ASV，使用了Venn图，该图由ggVennDiagram包v1.5.2（Gao等人，2024年）的‘ggVennDiagram’函数生成。通过indicspecies包v1.7.15（Cáceres和Legendre，2009年）中的指示物种分析方法识别各处理组的微生物指标。为了评估间作对共现网络的影响，我们创建了三个微生物网络（包含细菌和真菌），并使用microeco包中的‘trans_network’函数分析差异（Cuartero等人，2024年）。Species间的相关性使用Pearson相关性系数计算。相关性阈值通过随机矩阵理论（RMT）优化。只有显著的相关性（p < 0.05，经FDR校正）被纳入网络，模块识别使用fast greedy clustering算法（meconetcomp v0.2.0，Liu等人，2021年）。为了识别连接器，我们遵循Olsen等人（2007年）描述的分类标准。然后，将微生物角色分为外围成员（Zi < 2.5；Pi < 0.62）、连接器（Zi < 2.5；Pi ≥ 0.62）、模块中心（Zi ≥ 2.5；Pi < 0.62）和网络中心（Zi ≥ 2.5；Pi ≥ 0.62）。真菌类群（共生菌、腐生菌和病原菌）的分类使用FUNGuild数据库（Nguyen等人，2016年，数据获取日期为2024年8月20日），细菌的潜在功能使用FAPROTAX v1.2.10（Louca等人，2016年）进行评估，该工具已被证实是快速功能筛选的可靠工具（Sansupa等人，2021年）。

3 结果

3.1 减少耕作和间作对杏仁产量、土壤物理化学性质及氮循环的影响

杏仁产量变化较大，各处理组间无显著差异（见支持信息表S1），范围从64 kg ha?1（D2，最低）到187 kg ha?1（MC，最高），同时两种间作系统还种植了刺山柑或精油作物。土壤物理化学性质（如pH值、电导率或颗粒有机碳）、水分状态（如田间湿度、田间持水量）、养分（如NH??、NO??）和质地（如沙粒、粉砂）的测量结果显示各处理组间无显著差异（见支持信息表S2）。然而，参与硝化的amoA基因在D2处理组的表达量显著高于MC处理组（χ2 = 6.5；p = 0.04；见支持信息表S3）。

3.2 间作和减少耕作对土壤微生物多样性、群落及组成的影响

16S和ITS序列的数量见支持信息表S4。稀释处理后，D2处理组的细菌丰富度显著高于MC处理组，而Shannon指数无显著差异。MAB、MAF和LAF处理组的丰富度及Shannon指数均无显著差异（见表1）。在beta多样性方面，D2处理组在细菌（MAB）和真菌（MAF）中与其他组明显分开（见图1），尽管这些差异不显著。在LAB（F = 1.36；p = 0.008）和LAF（F = 1.23；p = 0.049）处理组中发现了显著差异。去除预测变量间的共线性后，剩余变量——容重（BD）、凋萎点土壤含水量（SWW）、总氮（TN）、电导率（EC）、阳离子交换能力（CEC）、pH值、总有机碳（TOC）、有效钾（K）、沙粒含量（SA）和有效磷（Pav）表明，仅BD和SWW是影响最丰富微生物（MAB + MAF）的显著因素，而BD也是影响较少丰富微生物（LAB + LAF）的显著因素（见图2；支持信息表S5）。在细菌方面，优势分类单元的相对丰度在门或属水平上无显著差异（见图3A,C；支持信息表S6）。在真菌方面，门水平上（见图3B；支持信息表S7A），我们发现Glomeromycota在D1处理组中相对丰度显著增加。在属水平上（见图3D；支持信息表S7B），Tricharina在D1处理组中显著增加，而Humicola在D2处理组中显著增加，与MC处理组相比（见表1）。减少耕作和间作对（A）最丰富细菌（MAB）和较少丰富细菌（LAB）的细菌多样性指数（丰富度和Shannon指数）以及（B）最丰富真菌（MAF）和较少丰富真菌（LAF）的真菌多样性指数（丰富度和Shannon指数）的影响。数值代表平均值±标准差（n = 3）。统计检验使用非参数的Kruskal Wallis检验进行。事后比较使用Dunn's检验和Benjamini-Hochberg校正进行，不同字母表示组间显著差异（p < 0.05）。MC：杏仁单作；D1：杏仁与刺山柑间作；D2：杏仁与百里香间作。显著的p值以粗体显示。

（A）
MAB
LAB
处理方式
丰富度
香农指数
丰富度
香农指数

MC
193±3
5.04±0.01
864±17b
6.57±0.06

D1
195±3
5.03±0.02
1068±68ab
6.68±0.06

D2
198±3
5.00±0.02
1395±160a
6.75±0.20

Kruskal Wallis检验
χ2 = 1.77; p = 0.41
χ2 = 2.22; p = 0.33
χ2 = 7.20; P = 0.027
χ2 = 1.16; p = 0.56

（B）
MC
60±1
2.66±0.20
65±5
3.61±0.18

D1
57±3
2.95±0.18
66±1
3.32±0.26

D2
59±1
2.98±0.02
50±10
3.09±0.07

Kruskal Wallis检验
χ2 = 0.80; p = 0.67
χ2 = 2.40; p = 0.30
χ2 = 3.29; p = 0.19
χ2 = 3.20; p = 0.20

图1：在PowerPoint中打开
主坐标分析（PCO）显示了基于Bray-Curtis距离的最丰富细菌（MAB）、较少丰富的细菌（LAB）、最丰富的真菌（MAF）和较少丰富的真菌（LAF）的β多样性。使用排列多元方差分析（PERMANOVA）评估了统计显著性。MC为杏仁单一种植；D1为杏仁与Capparis spinosa间作；D2为杏仁与Thymus hyemalis间作。显著的p值以粗体显示。

图2：在PowerPoint中打开
冗余分析（RDA）双坐标图显示了（A）最丰富的微生物（细菌和真菌）和（B）较少丰富的微生物（细菌和真菌），以及土壤的物理化学性质：凋萎点水分含量（SWW）和容重（BD）。MC为杏仁单一种植；D1为杏仁与Capparis spinosa间作；D2为杏仁与Thymus hyemalis间作。显著的p值以粗体显示。

图3：在PowerPoint中打开
（A）细菌群落和（B）真菌群落中最丰富的门的相对丰度，以及（C）细菌群落和（D）真菌群落中最丰富的属的相对丰度。MC为杏仁单一种植；D1为杏仁与Capparis spinosa间作；D2为杏仁与Thymus hyemalis间作。显著的p值以粗体显示。P表示非植物病原体；S表示共生菌；Pl表示植物病原体；Ps表示植物腐生菌；Sa表示腐生菌。真菌类群（共生菌、腐生菌和病原体）使用FUNGuild进行分类。

3.3 减少耕作和间作改变了较少丰富的微生物类群的组成及其功能潜力
Venn图显示，MAB和MAF的处理方法共享超过90%的OTUs（支持信息图S5A和S6A），表明它们的组成几乎没有差异。然而，在LAB和LAF中，这种重叠显著减少到大约20%，表明大多数微生物是每种处理方法特有的（支持信息图S5B和S6B）。在D2中，我们识别出17个不同的LAB OTUs，包括Polycyclovorans、Arcticibacter、Amycolatopsis、Bosea、Dyadobacter、Janthinobacterium、Leifsonia和Cytophaga（图4；支持信息表S8A）。在D1中，我们发现了Tumebacillus、Glycomyces、Sorangium和Pantoea，而在MC中，识别出的属包括Xanthomonas、Nibribacter、Steroidobacter和Frankia（图4；支持信息表S8A）。在LAF中，我们识别出共生属Glomus和Rhizophagus，以及腐生属Dioszegia、Iodophanus和Wallemia，以及在D2中的潜在植物病原体Olpidium、Torula和Periconia（图4；支持信息表S8B）。在D1中，我们识别出共生属Pisolithus、Septoglomus和Suillus，以及腐生属Conocybe、Hamigera和Lophiostoma。此外，我们还发现了一些病原-腐生属，包括Ceratobasidium、Aplosporella、Coprinus和Peniophora（图4；支持信息表S8B）。最后，在MC中，我们识别出腐生属Peziza和Kamunsia，共生属Atla，以及病原属Chrysosporium和Macrophomina。处理方法之间的共享OTUs可以在支持信息表S9中找到。MAB的功能潜力没有显著差异（表2A）。在LAB中，我们观察到D1和D2在好氧氨氧化（AAO）、硝化作用和发酵功能潜力方面有更高的丰度（表2B）。

Venn图显示了较少丰富的细菌（LAB）和较少丰富的真菌（LAF）之间在属水平上共享的OTUs。数字代表处理方法之间共享的OTUs或每种处理方法特有的OTUs的比例。MC为杏仁单一种植；D1为杏仁与Capparis spinosa间作；D2为杏仁与Thymus hyemalis间作。显著的p值以粗体显示。频率代表Venn图中每个部分中存在的OTUs的数量。表2. 三年间耕作减少和间作对（A）最丰富细菌和（B）较少丰富细菌的潜在原核生物功能（FAPROTAX）的影响。数值表示平均值±标准差（n = 3）。使用非参数Kruskal Wallis进行了统计检验。事后比较使用Dunn's检验进行，不同的字母表示组间有显著差异（p < 0.05）。MC为杏仁单一种植；D1为杏仁与Capparis spinosa间作；D2为杏仁与Thymus hyemalis间作。AAO表示好氧氨氧化；AC表示好氧化能异养；ACD表示芳香化合物降解。显著的p值以粗体显示。

（A）
MC
D1
D2
Kruskal Wallis检验

AAO
1.69±0.71
2.37±0.52
2.40±1.06
χ2 = 1.69; p = 0.43

硝化作用
1.69±0.71
2.37±0.52
2.40±1.06
χ2 = 1.69; p = 0.43

固氮作用
1.45±0.07
1.42±0.17
1.32±0.62
χ2 = 1.83; p = 0.40

发酵
3.92±0.23
4.40±0.41
6.18±3.67
χ2 = 1.68; p = 0.43

AC
41.39±0.26
39.93±0.43
39.93±3.83
χ2 = 0.64; p = 0.72

ACD
2.03±0.33
1.67±0.09
2.15±0.09
χ2 = 3.47; p = 0.18

硝酸盐还原
5.90±0.56
7.38±1.42
5.36±0.85
χ2 = 2.76; p = 0.25

（B）
MC
D1
D2
Kruskal Wallis检验

AAO
2.25±0.34
1.55±0.76
1.53±0.48
χ2 = 2.98; p = 0.23

硝化作用
2.13±0.79
1.74±0.81
1.61±0.84
χ2 = 1.16; p = 0.56

固氮作用
0.94±0.03b
1.58±0.21ab
1.96±0.15a
χ2 = 6.88; p = 0.032

纤维素分解
0.09±0.02b
0.11±0.02ab
0.49±0.19a
χ2 = 6.31; p = 0.043

发酵
0.95±0.15b
1.53±0.37ab
2.36±0.17a
χ2 = 7.20; p = 0.027

AC
32.31±2.49
24.77±1.00
30.17±3.53
χ2 = 5.42; p = 0.06

ACD
1.23±0.53
1.23±0.45
1.77±0.53
χ2 = 1.69; p = 0.43

硝酸盐还原
2.74±0.19
2.94±0.51
2.63±0.28
χ2 = 0.62; p = 0.73

3.4 间作和减少耕作对共生微生物网络和关键微生物类群的影响
在共生网络的拓扑结构中观察到了显著差异（表3）。在D2中，我们观察到链接数量（代表微生物之间的相关性）显著增加，网络直径也更大。此外，在这些链接中，D2中的负链接数量显著高于MC，MC中的链接数量最低（表3）。在D1与MC或D2之间没有观察到显著差异。在网络表示中（图5），这些差异在MC（图5A）和D2（图5C）之间非常明显，但在D1（图5B）中不明显。三个网络共享相同的三个主要模块，尽管它们的节点（微生物成员）组成有所不同。此外，我们发现关键类群（模块枢纽；在其自身模块内连接许多成员的微生物）的数量在网络之间有所不同，D2中的数量最多（4：Craurococcus、Massillia、Microlunatus和Elsterales）。相比之下，D1和MC每个只有2个模块枢纽：D1中的Bradyrhizobium和Geodermatophilus，MC中的MND1和Xanthobacteraceae（图5）。土壤的物理化学性质对微生物模块有显著影响。仅关注D2和MC处理（由于与D1的差异很小），我们观察到pH值的变化与M25和M35有显著的负相关，而TOC与D2中的M23、M39、M45和M48有负相关。相反，M12和TN的相关性为正，而M6的相关性为负。在MC中，pH值与M49和M37、TOC与M1、M52和M44、TN与M1和M52之间的相关性均为正（支持信息表S10）。表3. 三年实验后，基于每种处理的三个不同重复实验，耕作减少和间作对网络属性的影响。数值表示平均值±标准差（n = 3）。使用非参数Kruskal Wallis进行统计检验。事后比较使用Dunn's检验进行，不同的字母表示组间有显著差异（p < 0.05）。MC：杏仁单一种植；D1：杏仁与Capparis spinosa间作；D2：杏仁与Thymus hyemalis间作。计算了外围节点、连接器、模块枢纽和网络枢纽的数量。显著的p值以粗体显示。

图5：在PowerPoint中打开
（A）杏仁单一种植，（B）杏仁与Capparis spinosa间作，以及（C）杏仁与Thymus hyemalis间作的细菌和真菌共生网络。网络中，节点用颜色编码：绿色代表细菌成员，紫色代表真菌成员。每个节点的大小反映了其度，最大的节点对应于网络中识别的模块枢纽。图中仅突出了前五个模块，标记为M1、M2、M3、M4和M5。

4 讨论
4.1 减少耕作和间作对作物产量、土壤物理化学性质和微生物多样性的影响
我们的结果显示，不同处理方法之间的杏仁产量没有显著差异，尽管我们观察到D2的产量比MC低。鉴于杏仁树之间的自然变异性很大，需要继续随时间进行比较；然而，在之前的两年中，D1或D2与MC之间也没有显著差异（Almagro等人，2023年），这表明减少耕作和与T. hyemalis和C. spinosa间作不会对杏仁生产产生负面影响。土壤物理化学性质也没有显著差异。尽管如此，通过管理改变这些属性本质上很困难——特别是在以持续压力为特征的干旱系统中。我们的结果还显示，减少耕作和间作并没有显著影响MAB、MAF或LAF的α多样性指标；然而，它显著增加了D2中LAB的微生物丰富度。在半干旱土壤中，微生物群落往往对环境扰动具有抵抗力（Pérez-Guzmán等人，2020年），这通常会减弱多样性指标的短期变化。丰富细菌和较少丰富细菌之间的划分可能揭示了生态位创造过程。最丰富的细菌以其竞争优势和广泛的生态位为特征，不能轻易适应新创造的微生境。相反，较少丰富的细菌由于其狭窄的生态位特化——可以利用林间带增加的植被异质性来利用特定的生态位（He等人，2023年）。之前在雨养杏仁果园进行的长期研究（>10年）表明，减少耕作系统结合覆盖作物的初始产量下降趋势会随着土壤肥力的提高和微生物功能的完全发展而消失（Martínez-Mena等人，2021年；Almagro等人，2021年）。关于门水平上的微生物类群的相对丰度，我们观察到D1和D2中Glomeomycota的相对丰度增加。这一类群以促进植物生长的丛枝菌根真菌（AMF）而闻名（McConnaughey，2014年），这表明间作和减少耕作措施可以增加土壤中的AMF丰度（Wilkes等人，2021年）。AMF通过产生丛枝菌根素（一种糖蛋白）在维持土壤健康方面起着重要作用，该糖蛋白可以改善土壤结构，增加有机碳含量，并稳定土壤水分（Agnihotri等人，2022年）。因此，保护AMF种群有助于维持较高的丛枝菌根素水平，从而增强土壤聚集和水分保持能力，有助于间作系统的整体土壤稳定性和韧性（Almagro等人，2023年）。在属水平上，我们在处理D2中发现了促进植物生长的属Humicola的显著增加（Mahmoud和Narisawa，2013年）。这一属特别值得关注，因为它具有工业潜力，因为它产生高质量和丰富的次级代谢物（Ibrahim等人，2021年），包括抗真菌化合物，有助于抑制疾病和植物健康（Gomez等人，2023年）。然而，未来的研究（长期）应包括跨季节的多次采样和更深的采样深度（10厘米以下的额外层次），以便更好地捕捉减少耕作和间作系统中土壤微生物群落的时间动态和垂直分布。将植物功能特征（如特定根长（SRL）、根直径、凋落物碳氮比以及根分泌物谱）纳入考虑，将有助于加强植物策略、土壤性质与微生物群落响应之间的机制联系。此外，从DNA宏条形码技术转向鸟枪法宏基因组学和宏转录组学研究，对于区分土壤微生物组的潜在遗传能力与其实际代谢活性至关重要。

4.2 T. hyemalis与减少耕作改变了独特属的组成及土壤的功能潜力

在LAB实验组（D2）中，我们检测到了属于Amycolatopsis、Bosea、Dyadobacter、Janthinobacterium和Leifsonia等属的独特OTUs（操作分类单元），这些属均被描述为植物生长促进剂（Gandham等人2024年；Kang等人2017年；Kumar等人2018年），或具有抵御病原体的作用（Haack等人2016年；Khoury等人2021年）。在D1组中也观察到了类似的结果，例如Chryseobacterium和Pantoea等植物促进剂的增加（Mengstie等人2023年；Nascimento等人2020年），以及Glycomyces、Leptotrichia和Polyangium等植物保护剂的增加（Balode 2012年；Das和Dhal 2022年；Kim和Yun 2011年；Liao等人2018年）。而在D1组中，我们也发现了一些植物病原菌，如Stenotrophomonas和Xanthomonas（Abbott等人2011年；Timilsina等人2020年）。在LAF实验组（D1和D2）中，我们识别出了值得注意的OTUs，包括共生菌（如Glomus、Rhizophagus或Suillus）、腐生菌，以及植物病原菌（如Ceratobasidium、Peniophora或Olpidium）。尽管在土壤微生物组中检测到Olpidium和Periconia等潜在的植物病原菌，但它们对杏仁树并不构成重大威胁；而Torula物种则可能在易感宿主中引起树干溃疡、根腐病或冠部腐烂。然而，在所有采样的杏仁树中均未观察到此类病症，这表明尽管检测到了这些真菌类群，但在当前的土壤和宿主条件下它们处于代谢不活跃或非致病状态。为了确认地中海地区杏仁生产常见的主要检疫病原菌的缺失，我们使用了定量PCR技术检测Xanthomonas arboricola pv. pruni、Xylella fastidiosa和Monilinia laxa，但这些病原菌在任何样本中都没有被检测到，说明这种间作管理模式并未促进这些病原菌的建立或繁殖。就功能潜力而言，与MC组相比，D2组的固氮、纤维素分解和发酵功能潜力显著增强。这些发现表明，T. hyemalis显著提高了纤维素分解和发酵功能的相对丰度，这可能是由于植物生长及其后续分解导致有机物输入增加（Larionova等人2017年；Talbot等人2012年；Yarwood 2018年）。在我们的实验地块中，T. hyemalis的种植密度高于C. spinosa。此外，C. spinosa是一种落叶灌木，它在四月发芽并在十一月前失去所有地上生物量，秋季产生大量凋落物，但在冬季使土壤暴露在外。这种物候学和生物量覆盖度的差异可能解释了为什么与T. hyemalis间作能够比与C. spinosa间作更有效地增加总有机碳（Almagro等人2023年的报告），从而增强土壤功能。此外，T. hyemalis的常绿习性和持续的根系活动提供了连续的有机化合物供应，有利于有益微生物（如Humicola）的生长，而C. spinosa的季节性土壤暴露可能在休眠期间限制了这类微生物的富集。此外，有机物质的丰富化可以刺激参与分解复杂植物残余物的微生物过程，进一步提升土壤肥力和结构。D2组与MC组之间的最大差异可能与T. hyemalis是常绿物种有关，它全年都能保持土壤覆盖，而C. spinosa在冬季会失去所有枝条。另外，两种间作植物的凋落物质量不同，T. hyemalis的植物残余物由于较高的碳氮比，在短时间内更难以分解（Sánchez-Navarro等人2022年）。需要强调的是，尽管Faprotax是了解原核生物功能潜力的有用工具且可靠（Sansupa等人2021年），但它存在局限性，因为它依赖于经过整理的数据库和培养的菌种，可能无法完全反映未培养或研究不足的微生物的整体功能多样性。

4.3 间作和减少耕作对微生物共现网络的影响

与MC组相比，D2组的微生物共现网络发生了显著变化。具体来说，我们发现D1组的网络直径显著增加。较大的网络直径结合较少的节点数量表明网络紧凑性较低（Yarwood 2018），这可能意味着节点（微生物）之间的通信效率较低。然而，从群落抗性的角度来看，这种节点间距离的增加也可以作为一种缓冲，减缓环境干扰在整个网络中的传播（Stouffer和Bascompte 2011）。尽管节点数量没有显著差异，但我们发现链接数量显著增加，尤其是负链接数量。这些发现表明，尽管整体网络可能不够紧凑，但D2组的微生物相互作用和复杂性更高。更高的连接性和更大的直径相结合，表明该系统具有模块化稳健性，其中相互作用强烈但具有分隔性，这一点在其他不同的间作系统中也已有报道（Jiang等人2024年；Zhang等人2023年）。此外，负相关性的显著增加可能表明网络成员间的调节和控制能力更强，有助于提高网络稳定性并防止特定类群在压力下的主导地位（Coyte等人2015年；Cuartero等人2022年）。支持这一观点的是，D2组的模块枢纽（在其自身群体内具有大量相关性的微生物）数量也高于D1组和MC组。这些通用型微生物可以帮助各自的群体更快地应对环境干扰，从而增强群落对环境扰动的抵抗力（Cuartero等人2022年）。事实上，研究强调了这些模块枢纽在微生物网络中的重要性，因为它们可能是未来针对植物控制策略的关键点（Agler等人2016年）。然而，尽管共现网络可以提供有价值的见解，但也需要认识到其潜在的局限性，因为它们基于的统计相关性可能包含间接或虚假的关系。为了解决这些问题，我们仔细调整了阈值以最小化噪声并增强结果的稳健性，并建议在解释这些网络时谨慎行事。

4.4 指示物种分析

通过识别不同处理组中的独特指示物种，我们可以了解植物种类和减少耕作如何塑造微生物群落。指示物种是那些丰度模式能反映特定管理条件的统计显著类群，可作为土壤健康和功能潜力的代理指标（Shen等人2022年）。D1组中以耐逆性和有机物降解能力著称的Parviterribacter丰富，而D2组中则以促进植物生长并具有抑制病原体能力的Flavobacterium丰富（Seo等人2024年）。氮固定蓝细菌Nodosilinea在两种间作处理中都出现，表明间作本身——独立于植物种类——选择了能够固定氮的微生物，反映出生态系统的增强功能。D2组和MC组中Pseudomonas、Friedmanniella、Pedobacter和Novosphingobium的丰度较高，而在D1组中则缺失，这表明即使管理方式发生了变化，D2组的间作仍保持了与基线土壤微生物组的生态和功能连续性。这些类群具有广泛的功能多样性和生态位，使其能够在不同管理强度下持续存在。它们的保留可能反映了其功能的重要性——木质纤维素分解（Pedobacter；Zhou等人2019年）和养分循环（Pseudomonas）——这些功能在D2组的土壤中仍然必要（Liu等人2021年）。这些发现提供了机制证据，表明管理措施以功能上有意义的方式重构了土壤微生物组，独特的指示物种验证了减少耕作间作在提高微生物多样性和土壤多功能性方面的作用。

5 结论

我们的结果表明，即使在半干旱条件下，减少耕作并与杏仁间作也能在相对较短的时间内改变土壤微生物组成。尽管T. hyemalis和C. spinosa都表现出某些益处，但T. hyemalis对群落的影响最为显著。具体来说，它增加了较少丰富细菌类群的丰度，并促进了Amycolatopsis、Bosea、Dyadobacter、Janthinobacterium和Leifsonia等促进植物生长的属的生长发育。此外，减少耕作与T. hyemalis间作改变了微生物群落的功能潜力，增强了固氮、纤维素分解和发酵等功能。然而，在与C. spinosa间作并减少耕作的土壤中，未观察到显著的功能变化。此外，微生物网络分析显示，与T. hyemalis间作并减少耕作形成的网络结构更为紧密，模块枢纽的数量更多，表明其对环境变化的适应能力更强。总体而言，这些发现突显了T. hyemalis作为减少耕作下杏仁果园中有前途的间作作物，具有改善土壤健康、惠及农民和提高土壤可持续性的潜力，同时不会影响杏仁产量。

作者贡献

Maria Almagro、Maria Martinez-Mena和Elvira Diaz-Pereira设计了实验并组织了野外工作。Marcos Egea-Cortines、Onurcan ?zbolat、Maria Almagro和Loredana Canfora进行了分子分析。Raul Zornoza和Virginia Sánchez-Navarro进行了物理化学分析。Jessica Cuartero和Maria Almagro进行了生物信息学分析。Jessica Cuartero进行了统计分析。Jessica Cuartero起草了文章的初稿，Margarita Ros、Beat Frey、Jose Antonio Pascual和Raul Zornoza参与了写作。所有作者都对最终文章进行了审阅。

致谢

Jessica Cuartero得到了WSL内部拨款（5231.00900.002.01）的支持。感谢Veronica Juarez的专业英语编辑工作。本工作得到了欧盟“Horizon 2020研究与创新计划”项目“欧洲作物多样化和低投入农业：从实践者参与和生态系统服务到增加收入和价值链组织”（Diverfarming）的资助，项目协议编号为728003。开放获取出版由ETH-Bereich Forschungsanstalten通过Swiss Academic Libraries联盟与Wiley的合作协议支持。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

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