ABEL-FRET技术解决了在单分子水平上测量A2A腺苷受体结构动态时存在的时间尺度差异问题

《Communications Chemistry》：ABEL-FRET bridges the timescale gap in single-molecule measurements of the structural dynamics in the A2A adenosine receptor

　　摘要
G蛋白偶联受体（GPCRs）的功能复杂性源于其结构动态，这种动态涵盖了从纳秒到分钟的时间尺度。单分子F?rster共振能量转移（smFRET）技术能够直接观察这些动态，无论是自由扩散在溶液中的受体，还是固定在表面上的受体，前者使用共聚焦显微镜，后者使用基于总内反射荧光（TIRF）的相机显微镜。然而，这些方法仅适用于特定的时间尺度——前者快于毫秒，后者慢于数百毫秒。为了克服这些限制，我们结合了反布朗运动电泳（ABEL）捕获技术，将未固定的人类A2A腺苷受体（A2AAR）在脂质纳米盘中的观察时间从毫秒延长到秒。我们研究了apo状态和配体结合状态的A2AAR的构象异质性，并更新了之前对长寿命受体状态停留时间的估计，从毫秒延长到数百毫秒。我们的结果凸显了ABEL-FRET技术在探究GPCRs动态方面的强大能力，并为GPCRs的构象景观提供了宝贵的见解。

引言
G蛋白偶联受体（GPCRs）调控着诸如视觉、神经传递、炎症和血压调节等关键生理过程。GPCRs的特点是其七次跨膜螺旋结构，是人类基因组中最大的膜蛋白家族，包含超过800个成员1,2。它们在人体健康中的核心作用体现在超过30%的FDA批准药物将其作为主要作用机制3,4。许多内源性配体和药物结合到GPCRs的细胞外配体结合口袋上，触发跨膜和细胞内区域的构象变化，从而改变受体与其细胞内信号伴侣（如G蛋白和arrestins）之间的相互作用5,6。GPCRs的结构灵活性解释了配体调节受体活性的多种机制7,8,9。例如，一个GPCR在与不同效能的激动剂结合时可以表现出不同的活性水平10。通过结合到受体结构中其他进化保守程度较低的口袋上的变构调节剂，可以进一步调节激动剂结合GPCR的活性11,12。最后，有偏好的激动剂会改变同一GPCR引发的多种信号途径之间的平衡（例如，通过不同类型的G蛋白、arrestins或GRK激酶途径）13,14。GPCR配体的这种药理学多样性为在临床环境中更有效地使用GPCR靶向药物提供了机会。然而，GPCRs的结构灵活性也给基于结构的药物设计和理解GPCR激活的基本机制带来了严峻挑战。

尽管由于GPCRs的结构灵活性，通过X射线晶体学或冷冻电子显微镜获得高分辨率结构存在挑战，但这些技术仍显著提高了我们对GPCRs结构-功能关系的理解15,16。这些技术的一个显著缺点是它们只能提供稳定构象状态的静态快照，关于构象动态的信息非常有限8。包括核磁共振（NMR）、双电子-电子共振（DEER）、质谱和单分子荧光显微镜在内的多种互补方法揭示了GPCRs的构象异质性和复杂的构象动力学8,17。这些方法表明，受体在从纳秒到秒的时间尺度上会在多个稳定状态之间切换8,17。较快的运动对应于氨基酸侧链和受体非结构部分的近平衡振动和旋转，而较慢的运动涉及二级结构元素和环的高阶重排7。GPCR配体（从反向激动剂到完全激动剂，包括有偏好的激动剂和变构调节剂）会影响GPCRs的构象变化速率以及稳定构象的相对比例18。

单分子荧光显微镜是一种强大的方法，用于监测蛋白质的构象动态，特别是GPCRs19,20。荧光显微镜的单分子灵敏度无需进行群体平均，从而能够识别在平衡条件下共存的蛋白质不同状态。蛋白质的构象变化通常基于单个环境敏感荧光染料的构象依赖性荧光变化来监测（例如，单分子光异构化相关荧光增强（smPIFE21）、光诱导电子转移（PET22）或用于单分子F?rster共振能量转移（smFRET）的供体和受体染料对23,24）。在smFRET实验中，蛋白质的构象变化会影响附着在其移动结构元素上的荧光团的距离和相对取向，从而导致供体到受体染料之间的能量转移效率变化（图1a）。FRET对染料之间的相对位置变化极其敏感，包括原子尺度上的距离变化和染料取向的改变，这使得该技术非常适合观察构象动态。

图1：ABEL陷阱中单个A2AAR的smFRET动态。
a. A2AAR在跨膜螺旋TM6的细胞内末端和两亲性C端螺旋H8处用供体（Alexa488，蓝色圆圈）和受体（Atto643，红色圆圈）荧光染料标记，并在脂质纳米盘中重组（灰色带）。受体激活后，标记A2AAR的FRET效率增加。
b. ABEL陷阱设置的示意图，该陷阱具有四个电极，位于PDMS基微流控室中。FRET供体荧光团由快速切换的激光束图案激发，单个受体上的供体和受体荧光通过定制的共聚焦显微镜物镜收集。
c. 使用smFRET在ABEL陷阱中观察到的结构动态的时间尺度，以及最常见的smFRET实验模式，即自由扩散分子的共聚焦显微镜和固定分子的基于TIRF相机的显微镜。
d. 通过ABEL陷阱在溶液中固定的单个A2AAR的供体（蓝色）和受体（红色）通道的荧光迹线记录。经过背景校正的荧光迹线按1毫秒的时间区间分组（细半透明线），然后使用Chung-Kennedy滤波平滑（粗线）。带有供体和受体荧光的荧光爆发用星号表示。
e. 为apo A2AAR记录的单个荧光爆发持续时间的直方图。持续时间小于100毫秒的光子爆发被排除在分析之外（灰色区域）。在总共4080个apo A2AAR的爆发中，选择了1948个持续时间超过100毫秒的爆发，并根据荧光强度进一步过滤，得到1815个用于进一步分析的爆发（见补充图3，补充表1）。示例性apo A2AAR（f–h）和带有激动剂NECA的A2AAR（i–k）的荧光迹线。供体（蓝色）和受体（红色）荧光信号在用1毫秒时间窗口分组和背景减除后绘制（细半透明蓝线和红线）。选定荧光爆发之外的区域为灰色。对于爆发内的每个1毫秒时间区间，计算了接近比率（PR；公式1）（细半透明黑线），然后使用Chung-Kennedy滤波对其进行平滑（粗黑线）109。

全尺寸图像

smFRET实验通常有两种模式，取决于蛋白质是否在样品中自由扩散或固定在玻璃表面上24。在第一种模式中，自由扩散的分子短暂穿过共聚焦荧光显微镜的检测体积。观察时间由分子在检测体积内的扩散时间决定，通常在1到几毫秒内完成。在第二种模式中，目标分子固定在盖玻片上，并通过TIRF显微镜或扫描共聚焦显微镜成像，从而可以观察较慢的构象动态25。固定分子可以观察更长的时间，长达几分钟甚至几小时，主要受限于荧光染料的光漂白26,27,28。然而，通过固定分子及其与表面的相互作用可能会影响它们的结构动态，这对基于固定的实验提出了挑战24,29,30。观察未固定荧光标记分子的另一种方法包括在粘性介质（如甘油）或聚丙烯酰胺凝胶31,32,33中测量扩散，将分子偶联到大而慢速扩散的颗粒或脂质体34，将自由扩散的分子限制在微流控芯片内35,36，或者通过轨道跟踪37,38,39或在高度倾斜和层状光（HiLO）激发区域的基于相机的跟踪31来追踪它们。荧光标记分子在溶液中的扩散也可以通过反布朗运动电泳（ABEL）陷阱来主动对抗，在此陷阱中，未固定的分子可以在显微镜的视野内保持数分钟，从而能够监测缓慢的构象动态，同时分子没有物理固定40,41,42,43,44。

在ABEL陷阱中，分子在微流控装置的约1微米厚的平面内扩散，并短暂进入扫描共聚焦显微镜的检测区域（图1b）。当荧光标记分子进入该区域时，其位置基于其荧光发射实时估计。然后通过外部电场（由反馈回路控制并通过电极施加）来抵消分子的随机布朗运动，将其保持在其扫描区域的中心41。通过快速调整施加的电压，带电分子可以在显微镜视野内稳定保持数秒到数分钟的时间——比传统的扩散限制单分子实验长几个数量级。在这次延长的观察时间内，持续记录发射的光子，从而能够详细分析分子的构象动态。ABEL-FRET已经展示了在dsDNA样品中达到单个碱基对（0.34纳米）的分辨率42,45。ABEL捕获技术之前已被用于监测使用苯乙烯-马来酸共聚物（SMALPs）从膜中提取的GPCRs的单体-二聚体转换，以及在使用单荧光团标记策略在去垢剂胶束中重组的GPCRs单体的构象变化46,47。

在这里，我们将ABEL捕获与smFRET结合在一起，以研究典型的GPCR——人类A2A腺苷受体（A2AAR）的构象动态。A2AAR在调节心血管张力、睡眠、炎症以及多巴胺和谷氨酸的神经传递中起着重要作用48,49。它是治疗失眠、慢性疼痛、抑郁症、帕金森病和癌症等疾病的潜在靶点49,50,51。A2AAR是研究最多的GPCRs之一，具有两个单颗粒冷冻电子显微镜（cryoelectron microscopy）结构52,53、两个微晶体电子衍射结构54,55，以及超过75个X射线晶体结构，包括拮抗剂结合的52,56,57或激动剂结合的58,59受体，以及受体与激动剂和工程G蛋白的三元复合物53,60。NMR研究揭示了A2AAR在从纳秒61到毫秒62,63,64,65，再到秒64,66的广泛时间尺度上的构象动态。PET与荧光相关光谱（PET-FCS67）和smFRET68检测到自由扩散A2AAR的亚毫秒级构象动态，而使用固定A2AAR的单染料测量揭示了几秒钟内的缓慢构象变化69,70。在这项研究中，我们使用ABEL捕获技术在脂质纳米盘中观察了单个A2AAR分子长达2秒，无需固定，并使用smFRET监测它们的构象动态和配体诱导的构象变化。

结果
ABEL-FRET测量揭示了A2AAR的构象异质性和激动剂诱导的构象变化
为了使用smFRET观察A2AAR的构象动态，我们对重组的人类A2AAR进行了荧光标记和纯化（图1a）。为了荧光标记，引入了两个半胱氨酸突变：L225C6.27位于跨膜螺旋6（TM6）的细胞内侧，Q310C8.65位于细胞内C端螺旋8（H8，上标表示A类GPCRs中的Ballesteros-Weinstein残基编号71）。这些半胱氨酸像之前的研究一样，用供体（Alexa488-maleimide）和受体（Atto643-maleimide）荧光团标记，我们在之前的研究中使用相同的标记位置和荧光团通过爆发式smFRET测量了自由扩散A2AAR的亚毫秒级构象动态68。通过在脂质纳米盘中重组的荧光标记A2AAR的大小排阻色谱（SEC）和热位移测定（TSA）确认了其功能完整性和同质性（补充图1）。此前，使用同一表达批次的样本，我们证明了双标记A2AARL225C/Q310C在受体被激动剂激活后FRET效率的增加72。我们还表明，染料相对取向的变化有助于这种激动剂诱导的FRET效率增加；因此，我们不会将不同的FRET值解释为染料间距离的变化68。

现在，我们使用ABEL陷阱在2.34 × 2.34微米2的检测区域内观察单个A2AAR分子，持续时间通常为0.1-1秒，即比之前使用溶液中的自由扩散A2AAR分子的smFRET观察时间长约100倍（图1b–k）。我们用491纳米的连续波激光激发供体荧光团，并同时记录供体的直接发射和FRET诱导的受体发射。两个通道中的荧光急剧增加表明检测到了单个双标记受体，当受体从陷阱中逃逸或供体荧光团发生光漂白时，荧光又急剧下降回到背景水平。在没有或光漂白的受体中，由于供体荧光没有伴随FRET信号，因此这些受体被排除在分析之外。如果受体荧光团在观察期间被漂白，那么会分析直到光漂白发生前的所有荧光轨迹。由于技术原因，无法直接激发受体，因此我们无法区分那些不显示或仅显示低FRET的双标记分子和仅用供体标记的分子。这种测量中的偏差可能会导致在分析中对低FRET事件的低采样。然而，之前使用自由扩散的A2AAR分子和双色ALEX激发的smFRET实验表明，无论是游离状态还是与配体结合的受体，处于低FRET状态的比例都很小（<20%），这可能代表了非功能性或折叠不当的受体。我们按照“扩散分析”部分中描述的方法，对嵌入在MSP1D1纳米盘中的单个A2AAR分子进行了扩散分析，结果表明扩散系数的分布非常窄，平均值为36 μm2 s?1，标准差小于±5%（补充图2）。单个分子的荧光强度主要集中在一个峰值附近，没有明显的亚群体存在，平均强度为每毫秒20-30个光子计数（两个颜色通道的总和，平均在观察时间内；补充图3，补充表1）。为了排除少数潜在的寡聚体或聚集体，我们将总荧光强度超过每毫秒40个光子的受体从所有后续分析中移除。

为了量化单个A2AAR分子在观察时间内以及群体中各种分子之间的FRET效率变化，我们按照以下公式计算了邻近比率（PR）：$${{{\rm{PR}}}}={I}_{{{{\rm{A}}}}}/({I}_{{{{\rm{D}}}}}+{I}_{{{{\rm{A}}}}})$$ （1）其中ID和IA分别是校正了背景的供体和受体的荧光强度，平均值可以是在1毫秒时间区间内（区间内PR）或在单个受体的整个荧光事件期间（事件内PR）得到的。我们比较了不同样本中的事件内PR分布，包括A2AAR处于无配体（apo）状态以及与拮抗剂ZM241385或激动剂NECA（5’-N-乙基羧酰胺腺苷）或腺苷结合的状态（图2b）。与我们之前使用相同染料在同一标记位置标记A2AAR的研究结果一致（68,72），拮抗剂并没有改变PR，而激动剂与无配体状态相比增加了PR。在所有四种条件下，PR分布都比预期的由于随机噪声限制的情况更宽，这表明A2AAR状态在数百毫秒的观察时间内并没有完全转化（图2b）。这些长寿命的受体状态可以与在固定受体实验中观察到的A2AAR缓慢的构象动态相关。

图2：A2AAR的结构异质性和动态性的事件内分析。a 对于在低FRET（LF）状态和高FRET（HF）状态之间切换的分子，预期的PR轨迹示意图。左侧是“表观静态异质性”情景：如果切换太慢，无法在单个分子的观察时间内完成，则数据与“静态异质性”情景无法区分，在这种情况下，低FRET和高FRET的物种不会相互转化。右侧是“表观静态同质性”情景：如果切换足够快，可以在实验的的时间分割时间内平均，那么数据与“静态同质性”情景无法区分，在这种情况下，所有分子具有随时间保持不变的相同PR。b 显示了未结合配体的A2AAR（APO，N=1815个事件）、与拮抗剂ZM241385结合（ZM，N=1436个事件）、与激动剂NECA结合（NECA，N=1741个事件）以及与激动剂腺苷结合（ADN，N=1271个事件）的事件内PR的实验分布（紫线）。同时给出了“静态同质性”情景的模拟分布（红线），以展示由于随机噪声导致PR分布的预期变宽。在“静态同质性”模拟中，真实的事件内PR与A2AAR数据中的群体平均事件内PR相匹配。c 在1毫秒时间区间内测量的PR的标准差在沿事件内PR轴线均匀分布的事件组中进行了平均，并为apo和与配体结合的A2AAR（紫线）以及模拟的“静态异质性”情景（橙线）绘制了图表。在“静态异质性”模拟中，PR的分布与A2AAR数据的分布相匹配。PR区间少于20个事件的没有进行分析。d 在1毫秒时间区间内计算的PR的自相关函数为apo和与配体结合的A2AAR（紫线）以及模拟的“静态异质性”（橙线）和“静态同质性”（绿色）情景绘制了图表。在模拟数据中，事件的数量、持续时间和随机噪声的水平与同一面板上显示的A2AAR的实验数据相匹配。95%置信区间是通过统计自举方法获得的（阴影彩色区域）。

方差分析揭示了A2AAR中等但显著的构象动态

在所有测量的条件下，无论是与配体结合还是游离状态（apo），单个受体在检测时间内的PR波动都显著高于随机噪声限制所预期的水平（图2c）。为了进行这一比较，我们采用了Burst Variance Analysis（73）方法来处理ABEL-FRET数据，并模拟了“静态异质性”情景下的数据，这些数据具有相同数量和长度的单分子荧光事件、相同的总荧光信号和背景水平以及相同的PR分布。在这种模拟中，每个分子都被赋予了一个独立的、恒定的PR，波动完全是由随机噪声引起的（图2a）。大于随机噪声限制的PR波动表明了A2AAR的构象动态以及荧光团的复杂光物理特性，或者是背景荧光的波动。

基于相关性的分析揭示了A2AAR的缓慢动态和长寿命构象状态

为了分析ABEL-FRET观察到的A2AAR构象动态的时间尺度，我们如下计算了PR波动的归一化自相关函数：$$G(\tau )=\frac{ < \delta {{{{\rm{PR}}}}}_{i}(t)\cdot \delta {{{{\rm{PR}}}}}_{i}(t+\tau ){ > }_{t,i}}{ < \delta {{{{\rm{PR}}}}}_{i}(t)\cdot \delta {{{{\rm{PR}}}}}_{i}(t){ > }_{t,i}}$$ （2）其中i和t指数分别对应于单个荧光事件及其内的时间区间，平均值是对所有事件中的时间区间t和t?+?τ的所有配对进行的。PR波动 $\delta {{{{\rm{PR}}}}}_{i}(t)$ 是以所有检测到的分子在所有1毫秒时间区间内的平均PR为参考计算的：$$\delta {{{{\rm{PR}}}}}_{i}(t)={{{{\rm{PR}}}}}_{i}(t)- < {{{{\rm{PR}}}}}_{i}(t){ > }_{i,t}$$ （3）归一化自相关函数在滞后时间 $\tau\)=0$ 时等于1（在对数刻度图中未显示），本质上代表了随着系统记忆随时间滞后 $\tau$ 而衰减时，总PR方差中保持相关的一部分。在apo和与配体结合的A2AAR中，自相关在整个 $\tau$ 范围内都是正的，从最短的时间分割时间 $\tau$?=?1?ms 到最长的 $\tau$?=?300?ms（图2d）。在所有apo或与配体结合的条件下，自相关几乎随 $\log (\tau )$ 线性减小。这种正自相关表明了不同受体状态下的A2AAR群体内的异质性，这些状态通过PR来区分。在一个假设的“静态同质性”情景中，所有分子具有相同的构象，PR波动是由荧光数据中的随机噪声引起的，这样的分析将导致所有 $\tau$?>?0时的自相关值为零。如果蛋白质的构象动态比分析中使用的1毫秒时间分割时间快得多（图2a, d），也会预期到零自相关。

在我们的基于自相关的分析中，自相关随时间的减少表明了A2AAR在这个时间尺度上的构象动态。在一个假设的蛋白质在两种状态之间以速率常数k12和k21切换的情景中，自相关曲线 expected 是S形的，在松弛时间 $\tau ={\left({k}_{12}+{k}_{21}\right)}^{-1}$ 时自相关减少50%，而在更长的时间则趋近于零。另一方面，在“静态异质性”情景中，如果分子具有不同的静态状态且没有状态间的切换，则预期自相关不会随 $\tau$ 减少（图2d）。根据我们的ABEL-FRET数据，“表观静态异质性”情景，即状态间切换发生在比分子在ABEL陷阱区域内的停留时间长得多的时间尺度上，与真正的“静态异质性”无法区分（图2a）。值得注意的是，在较大的时间滞后 τ?>?100?ms 时，基于相关性的分析越来越多地受到罕见的长寿命捕获事件的影响，导致相关曲线偏离模拟的“静态异质性”情景的预期水平趋势。这些人为现象标志着基于相关性的分析变得不可靠的 $\tau$ 范围。

我们分析中自相关曲线的低起始水平可能受到数据中的随机噪声或受体快速亚毫秒级动态的影响（图2d）。在apo和与配体结合的A2AAR中，这些水平约为20%，表明PR数据中的80%的方差在连续的1毫秒时间区间内是不相关的。为了测试快速构象动态的假设，我们进行了“静态异质性”情景的计算机模拟，在这些模拟中，随机噪声是单个捕获事件内PR波动的唯一来源（图2a, d）。在这些模拟中，我们获得了相似的自相关起始水平，这表明自相关的低起始值是由于随机噪声而不是快速构象动态造成的。

对于apo和与配体结合的A2AAR测量的PR自相关曲线显示，在数百毫秒的时间延迟后，PR之间仍然存在显著的残余相关性，表明了受体状态的长寿命（图2d）。这种高的残余自相关进一步支持了“静态异质性”情景，即分子在捕获时间内保持不同的构象，这是对A2AAR的一个良好近似。对于A2AAR，在1–300毫秒的时间尺度内，PR相关性的微妙但显著的减少并没有显示出明显的S形转变，这很可能表明在观察时间尺度上存在复杂的多态构象变异性，或者表明了更慢的动态，其交换松弛时间超过300毫秒。

通过PR分布的复发分析证实了A2AAR的长寿命状态

为了进一步研究长寿命的A2AAR状态，我们比较了在不同时间点表现出高于（“高FRET”）或低于（“低FRET”）群体平均中位数的A2AAR分子的PR分布随时间的变化（图3a, b）。在所有四种apo和与配体结合的条件下，1毫秒时间区间内PR高于平均值的A2AAR，在随后的1毫秒时间区间内通常也表现出高于平均值的PR。即使时间延迟为200毫秒，这一趋势仍然保持，PR分布几乎不会向群体的“平衡”分布偏移。一个在给定时间区间内显示出“高FRET”PR的apo A2AAR分子在初次观察后1毫秒和200毫秒时分别有65%和59%的概率再次显示出“高FRET”PR（图3c, d）。如果两个数据点之间的时间延迟远大于构象动态的典型时间尺度，这两个概率显著高于随机50%的值。

图3：PR分布的复发分析。a 在区间内PR的时间轨迹（粗线）中，正（红色区域，高于PR中位数）和负（蓝色区域，低于PR中位数）的波动分别被分配到高FRET（HF）和低FRET（LF）区域。对于给定的时间延迟τ，将各时间点之间的PR分布绘制出来，这些时间点是通过时间轴从HF区域（PR(t) | HF(t-τ)，虚线红线）或LF区域（PR(t) | LF(t-τ），虚线蓝线）偏移τ得到的。这些分布与一般的PR分布（黑线）相比的偏移表明，在时间点t-τ和t发现蛋白质处于相同状态的概率高于随机概率。b 出示了从LF区域（“从LF开始”）或HF区域（“从HF开始”）偏移时间延迟τ=1ms和τ=200ms后的各时间点PR分布，对于apo和配体结合的A2AAR进行了展示。一般的PR分布以黑色显示。c 在时间t观察到PR的正向波动的条件概率（红色区域），假设在之前时间t-τ也观察到了正向波动（虚线红色等高线），作为τ的函数p(HF(t) | HF(t-τ))计算（实线红线）。同样，如果在时间t-τ观察到负向波动，则在时间t观察到PR的正向波动的概率作为τ的函数p(HF(t) | LF(t-τ))计算（实线蓝线）。在右侧，两条曲线在远大于目标分子状态间交换松弛时间的情况下趋于相同值。d 对于apo和配体结合的A2AAR，绘制了两个PR正向波动的条件概率。两条橙色线显示了模拟的“静态异质性”场景下的相同曲线（p(HF(t) | HF(t-τ)) - 上线；p(HF(t) | LF(t-τ)) - 下线）。95%置信区间是通过统计自助法获得的（阴影彩色区域）。

对于apo和配体结合的A2AAR，在两次数据点之间的时间延迟较长的情况下，观察到“高FRET”PR的概率显著降低（图3d）。这种降低表明在1-200ms的时间范围内，A2AAR的构象动力学是中等但显著的。作为参考，我们还检查了“静态异质性”场景的模拟，其中分子的构象在捕获时间内保持不变，PR的变化是由于荧光数据中的散粒噪声。在“静态异质性”场景中，记录到“高FRET”PR的概率在记录一次后的1ms内与我们观察到的A2AAR相似，但在更长的时间延迟τ下，这一概率不会下降。值得注意的是，实验数据和模拟中相似的起始水平表明，数据中的散粒噪声使得亚毫秒级的快速受体动力学在我们的实验ABEL捕获设置中不可见。

总的来说，我们的发现表明A2AAR仅表现出与“静态异质性”场景的适度偏差，在捕获时间的开始和结束时都有很高的概率检测到受体处于相同的“状态”。通过ABEL-FRET技术，我们弥合了之前使用共聚焦smFRET研究自由扩散受体（研究亚毫秒级构象动力学）与基于TIRF的固定受体研究（研究秒级时间尺度动力学）之间的差距。在这项研究中，由于荧光数据中的散粒噪声和ABEL捕获中激光焦点的微秒级运动，A2AAR的快速动力学无法被分辨出来，并且在1ms的时间区间内被平均掉了。慢速动力学导致了我们数据中观察到的与“静态异质性”场景的微妙但统计上显著的偏差。我们没有在从毫秒到数百毫秒的时间尺度上观察到A2AAR的任何特征性动力学——无论是自相关函数还是检测到相同符号PR波动的概率都没有在观察的时间尺度内显示出S形下降。

讨论

使用ABEL-FRET方法，我们监测了在0.1-2秒捕获时间内重组在脂质纳米盘中的单个A2AAR的构象变化（图1）。在之前的ABEL捕获研究中，三种GPCR——β2-肾上腺素受体（β2AR46）、β1-肾上腺素受体（β1AR74）和神经紧张素受体1（NTSR147）分别重组在去垢剂胶束、脂质纳米盘和SMALPs中，并在溶液中捕获几秒钟。除了GPCRs之外，另一种膜蛋白FoF1-ATP合成酶也曾被FRET标记并重组在蛋白脂质体中用于ABEL-FRET研究，获得了10到100ms时间范围内的构象动力学的可比观察时间。在ABEL捕获中研究的其他膜蛋白的纳秒级光物理和能量转移包括在去垢剂胶束中的光捕获复合物LH2。具有可控直径和脂质组成的脂质纳米盘提供了类似天然环境的脂质双层，并维持了多种重组蛋白目标的功能性和高稳定性。脂质纳米盘已被广泛用于研究膜蛋白结构和功能（例如，通过NMR、DEER或冷冻EM），以及用于药物筛选；因此，它们通过ABEL捕获的临时固定为许多跨方法相关研究打开了大门。

最近使用ABEL捕获和DEER的研究表明，A类GPCRs可以在脂质纳米盘中二聚化。由于我们实验中的标记效率较低，我们无法根据光谱数据排除A2AAR二聚体的存在。几项独立的研究报告称，使用与我们类似的方法重组在MSP1D1纳米盘中的A2AAR是单体，这一点通过SDS–PAGE分析和分析超离心得到证实。此外，甚至更大的MSP1E3纳米盘也被证明只能容纳一个A2AAR分子。

A2AAR的快速亚毫秒级构象动力学之前已经通过smFRET、PET-FCS和NMR观察到，A2AAR被重组在脂质纳米盘或去垢剂胶束中。在这项研究中，我们无法观察到这一时间尺度上的A2AAR的构象动力学，因为在1ms内，只有少数荧光光子被从单个受体中检测到，即大约20到30个光子（补充图3，补充表1）。此外，在ABEL捕获中测量的荧光强度由于8kHz重复率下的快速激光扫描而在亚毫秒时间尺度上波动（补充图5）。为了抵消散粒噪声，我们在smFRET分析中使用了1ms的时间间隔，并在各个时间间隔内平均了亚毫秒级的动力学。

在之前的NMR和smFRET实验中观察到了A2AAR的长寿命结构状态，其停留时间超过毫秒。在基于smFRET的研究中，单个A2AAR被观察到几毫秒，直到自由扩散的受体离开显微镜的焦点。使用ABEL捕获，我们将单个受体的观察时间延长到了2秒（图1e）。在这个时间尺度上，我们只看到个别A2AAR分子的FRET效率有微小变化，每个分子在整个光子爆发期间保持相同状态的概率很高（图1f-k，图2c，d，3c，d）。因此，我们将之前通过smFRET观察到的长寿命A2AAR状态的停留时间估计提高了两个数量级，从毫秒到数百毫秒。最近基于NMR的研究也支持了存在停留时间超过100ms的长寿命状态。使用基于相关性的分析（图2d）和PR分布的重复分析（图3c，d）观察到的1到300ms时间尺度上的微小但显著的动力学可以与之前通过NMR测量的A2AAR的亚秒级动力学相关，或者是更慢动力学的开始。由于染料的光物理性质对smFRET分析具有固有的挑战性，我们不能完全排除染料的长寿命光物理状态对双标记A2AAR的FRET效率分布中的异质性的贡献。使用ABEL捕获的分子动力学模拟，我们之前已经表明，激活A2AARL225C/Q310C时观察到的FRET变化可能是由于TM6的细胞内端向外移动，随后是连接到L225C6的染料向G蛋白结合腔移动。使用ABEL捕获，我们观察到A2AAR的长寿命FRET状态，其停留时间超过200到300ms（图2d，图3d）。我们假设这些状态代表了受体细胞内部分围绕主要活性和非活性构象的缓慢结构重排。这些缓慢的重排可能对G蛋白的识别具有功能重要性，并且可以与之前通过HDX MS观察到的G蛋白与A2AAR结合结构的缓慢、几分钟长的重排相关联。

使用单分子荧光显微镜以高达0.1秒的时间分辨率监测了A2AAR的快速亚毫秒级构象变化，这些变化是在纳米盘中重组的A2AAR上观察到的。在我们之前的研究中，使用了与我们的协议相当的协议将A2AAR重组在脂质纳米盘中。由于我们实验中的标记效率较低，我们无法排除基于光谱数据存在A2AAR二聚体的可能性。几项独立的研究报告称，使用与我们的协议相似的协议将A2AAR纳入MSP1D1纳米盘中的是单体，这一点通过SDS–PAGE分析和分析超离心得到证实。此外，甚至更大的MSP1E3纳米盘也被证明只能容纳一个A2AAR分子。

在之前的研究中，通过smFRET、PET-FCS和NMR观察到了A2AAR的快速亚毫秒级构象动力学，A2AAR被重组在脂质纳米盘或去垢剂胶束中。在这项研究中，我们无法观察到这一时间尺度上的A2AAR的构象动力学，因为在1ms内，只有少数荧光光子从单个受体中被检测到，即大约20到30个光子（补充图3，补充表1）。此外，由于在捕获区域内以8kHz的重复率快速扫描整个32点图案，ABEL捕获中测量的荧光强度在亚毫秒时间尺度上波动（补充图5）。为了对抗散粒噪声，我们在smFRET分析中使用了1ms的时间间隔，并在各个时间间隔内平均了亚毫秒级的动力学。

在之前的NMR和smFRET实验中观察到了A2AAR的长寿命结构状态，其停留时间超过毫秒。在基于smFRET的研究中，单个A2AAR被观察到几毫秒，直到自由扩散的受体离开显微镜的焦点。使用ABEL捕获，我们将单个受体的观察时间延长到了2秒（图1e）。在这个时间尺度上，我们只看到个别A2AAR分子的FRET效率有微小变化，每个分子在整个光子爆发期间保持相同状态的概率很高（图1f–k，图2c，d，3c，d）。因此，我们可以将之前通过smFRET观察到的长寿命A2AAR状态的停留时间估计从毫秒更新到数百毫秒。最近基于NMR的研究也支持了存在停留时间超过100ms的长寿命状态。使用基于相关性的分析（图2d）和PR分布的重复分析（图3c，d）观察到的1到300ms时间尺度上的微小但显著的动力学可能与之前通过NMR测量的A2AAR的亚秒级动力学相关，或者是更慢动力学的开始。由于染料的光物理性质对smFRET分析具有固有的挑战性，我们不能完全排除染料的长寿命光物理状态对双标记A2AAR的FRET效率分布中观察到的异质性的贡献。使用ABEL捕获的商用染料已经展示了具有不同荧光寿命和发射光谱的长寿命光物理状态。

使用分子动力学模拟，我们之前已经表明，激活A2AARL225C/Q310C时观察到的FRET变化可能是由于TM6的细胞内端向外移动，随后是连接到L225C6.27的染料向G蛋白结合腔移动。使用ABEL捕获，我们观察到了A2AAR的长寿命FRET状态，其停留时间超过200到300ms（图2d，图3d）。我们假设这些状态代表了受体细胞内部分的缓慢结构重排，这些重排可能对G蛋白的识别具有功能重要性，并且可以与之前通过HDX MS观察到的G蛋白与A2AAR结合结构的缓慢、几分钟长的重排相关联。

在之前的研究中，使用了单分子荧光显微镜以高达0.1秒的时间分辨率监测了A2AAR构象之间的缓慢秒级切换，这些研究使用了固定在纳米盘中的A2AAR。我们实验中观察到的长寿命状态可以与这些之前报道的状态相关联。由于使用不同的策略来跟踪受体的构象动力学，两种单分子研究之间的直接比较是具有挑战性的。在Wei等人的研究中，使用对环境敏感的染料Cy3探测了TM7周围的结构变化，而在我们的研究中，通过TM6上的FRET染料对和C端螺旋H8的移动来探测TM6的移动（图1a）。我们假设A2AAR中的相同全局构象重排发生在几秒的时间尺度上，涉及TM6和TM7，影响了我们研究和Wei等人研究中的荧光读数。

利用我们的ABEL-FRET研究的见解，我们更新了我们在之前的smFRET研究中引入的A2AAR作用模型。与最初的三态模型一样，具有最高FRET效率的活性状态（HF）在激动剂结合的A2AAR中最常见，而具有中等FRET效率的非活性状态（MF）在apo和拮抗剂结合的A2AAR中最常见（图4）。之前观察到的FRET效率最低的A2AAR状态（LF）在所有apo或配体结合条件下都最少，被归类为非功能性或折叠不当的受体。在我们的ABEL-FRET测量中，我们只直接激发了供体荧光团，而没有激发受体荧光团。因此，FRET效率低的分子与没有活性受体染料的分子无法区分，因此没有被分析。由于LF状态是最少出现的状态，可能不代表功能性受体，并且在ABEL-FRET实验中未被观察到，我们没有将其包括在我们的更新模型中。我们展示了激动剂结合的A2AAR在MF和HF状态之间的切换时间约为0.4ms，而在apo和拮抗剂结合的A2AAR中，这种切换较慢（>100ms）。我们使用了一个二维能量景观图来说明这种快速的激动剂诱导的MF和HF之间的切换，以及通过ABEL-FRET揭示的各个状态内的长寿命异质性。在这个更新的A2AAR能量景观图中，激动剂结合的A2AAR中MF和HF之间的状态间能量障碍较低，而在apo和拮抗剂结合的A2AAR中较高，MF和HF亚状态之间的状态内能量障碍在所有apo和配体结合条件下都很高。

图4：更新的A2AAR作用模型。a 之前提出的A2AAR的三态作用模型以及apo和激动剂结合的A2AAR对应的能量景观。b 更新的二维能量景观图显示了具有中等FRET效率的非活性状态（MF）和具有高FRET效率的活性状态（HF）中的长寿命亚状态。我们没有在更新模型中包括FRET效率最低的状态（LF，灰色区域），因为它在之前的研究中最少出现，并且被归类为非功能性或折叠不当的受体，在当前研究中也没有观察到，因为它与没有活性受体染料的分子无法区分。我们将apo A2AAR中MF和HF之间的交换时间从之前提出的>2ms更新为>100ms。

我们的研究表明，ABEL-FRET方法可以用于研究重组在脂质纳米盘中的膜蛋白的构象动力学。ABEL-FRET测量技术填补了时间尺度的空白，此前A2AAR的构象动力学是通过单分子荧光显微镜监测的，即从1毫秒（在自由扩散分子的测量中观察到的接近最大时间67,68）到100毫秒（之前对固定化A2AAR的研究所达到的最短时间分辨率69,70）。我们的测量结果显示，在这一1-300毫秒的范围内没有明显的构象动力学变化，从而修正了之前对自由扩散受体中长寿命状态停留时间的估计，并将其与固定化受体中停留时间为几秒的状态联系起来。ABEL捕获的关键因素包括：（1）使用亮度高（即量子产率高）且光稳定性好的荧光染料（具有最小的闪烁、抗光漂白能力以及有限的光谱波动）；（2）尽量减少来自缓冲液和样品室的荧光背景，以确保良好的信噪比；（3）涂覆样品室表面以防止在捕获区域粘附；（4）将捕获区域扩大到4×4微米2的大小，以便捕获如单个荧光染料这样的小分子。关于ABEL捕获的分子局部加热或快速变化的电场对构象动力学潜在影响的任何担忧都必须通过实验来解决。例如，对不同FRET标记的FoF1-ATP合成酶突变体进行的六项独立smFRET研究发现，无论是自由扩散的酶还是ABEL捕获的酶，其平均ATP水解速率相似。平均反应时间每水解一个ATP分子需要6到19毫秒，并且所有测量中单个酶的动力学分布都非常广泛。比较表明，ABEL捕获条件对膜酶动力学的影响可以忽略不计，这验证了特定突变对单酶动力学的影响。

几项技术进步有望提高未来ABEL-FRET研究的时间分辨率和最大捕获持续时间，从而扩大监测GPCR和其他膜蛋白、可溶性蛋白质、核酸以及无机纳米颗粒的结构动力学的可行时间尺度41,94,95,96。例如，使用全石英ABEL捕获微流控装置可以显著降低背景荧光97，而自愈型荧光染料98,99或DyeCycling方法28可以提高染料的光稳定性和有效亮度，从而延长观察时间。全石英微流控装置的特定涂层允许ABEL捕获带电和非带电分子，这些分子可以适应不同离子强度的缓冲液，通过切换电泳力和电渗力来实现41。使用脉冲激光在ABEL捕获装置中进行荧光寿命测量可以从由于激光快速扫描捕获区域而产生的仪器荧光波动中区分出亚毫秒级的动力学变化100,101。此外，多重读数功能——如荧光寿命和各向异性测量，或评估粒子扩散系数和电动力学迁移率——可以揭示使用传统FRET指标无法区分的受体状态42,102,103。总的来说，这些创新凸显了ABEL-FRET在全面、高分辨率研究膜蛋白和其他系统的构象动力学方面的巨大潜力。

**方法**

**A2AAR样品制备**
此处使用的双突变体A2AARL225C/Q310C样品是在我们之前的研究中制备并进行了功能表征的72。在那项研究中，编码A2AAR的human ADORA2A基因（2-316个氨基酸）包含N端血凝素信号肽（MKTIIALSYIFCLVFA）、FLAG标签（DYKDDDDK）和连接子（AMGQPVGAP），L225C6.27和Q310C8.65突变，以及C端的10个His标签，在Spodoptera frugiperda Sf9细胞（Novagen，美国，目录编号71104）中表达。该蛋白质用Atto643-maleimide和Alexa488-maleimide在粗制膜中标记，溶解在DDM/CHS（n-十二烷基-b-D-麦芽糖苷/胆固醇半琥珀酸）中，通过TALON树脂纯化，并在脂质纳米盘（MSP1D1，POPC:POPC 7:3）中复性。样品稀释在25 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl中，加入40%甘油，分装后用液氮快速冷冻，并储存在-80°C。样品的纯度和均匀性通过SDS-PAGE和分析SEC进行了验证（补充图1a，b）。Alexa488的标记效率为16%，Atto643为12%。通过TSA验证了配体诱导的受体热稳定性变化（补充图1c）。

**定制设计的共聚焦ABEL-FRET装置**
所有smFRET ABEL捕获实验均在之前描述过的模块化自制共聚焦显微镜系统上进行40,47,75,76,77。PDMS玻璃样品室安装在一个压电驱动的舞台上（P-527.3CD，Physik Instrumente，德国），该平台集成在一台倒置显微镜（IX71，Olympus）中。一个线偏振的连续波491纳米激光（Calypso，Cobolt，瑞典）通过两个电光光束偏转器（EOD，M310A，Conoptics，美国）设置成32点的Knight’s tour激光聚焦模式，扫描速度为每完整模式8 kHz。激光功率在焦平面上衰减到34微瓦。激光聚焦模式在焦平面上的大小为2.34×2.34微米2。激发光和检测光束都通过一个油浸物镜（60倍，PlanApo N，油，NA 1.42，Olympus，德国）。一个二向色镜（zt 488 RDC，AHF，德国）将检测到的荧光与激发光分离。管镜像平面上的一个小孔（200微米）优化了信噪比。一个二向色分光器（HC BS 580i，AHF）在光谱上分离了供体和受体荧光信号，然后通过两个单光子计数雪崩光电二极管（APD，SPCM-AQRH 14，Excelitas，美国）进行测量。带通（ET 535/70，AHF，德国）和长通（LP 594，AHF，德国）滤光片进一步确定了供体和受体通道的精确波长检测范围。所有滤光片的选择都旨在保持非偏振荧光检测条件。时间相关的单光子计数（TCSPC）模块（SPC-180NX，带有路由器HRT-82，Becker & Hickl，德国）以FIFO模式记录到达的光子，并使用SPCM软件（版本8.9）进行处理。

**ABEL-FRET测量**
ABEL捕获用的一次性微流控室是根据Heitkamp等人的描述75使用硼硅酸盐玻璃晶圆上的已发布设计76,104，用结构化的PDMS和玻璃制成的75。PDMS与硬化剂的比率为10:1，在50°C下固化48小时（Sylgard 184弹性体，Dow，Midland，MI，美国）。使用尖锐的针在PDMS部分打孔以制作电极孔。PDMS芯片在纯丙酮中超声处理，用去离子水冲洗并在氮气流中干燥。PDMS和32×24毫米的盖玻片（厚度为#1.5）经过90秒的等离子体蚀刻，然后粘合形成一个样品室。在25 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl的溶液中加入40%甘油，分装后用液氮快速冷冻，并储存在-80°C。样品的纯度和均匀性通过SDS-PAGE和分析SEC确认（补充图1a，b）。Alexa488的标记效率为16%，Atto643为12%。配体诱导的受体热稳定性变化通过TSA验证（补充图1c）。

**ABEL-FRET测量过程**
所有smFRET ABEL捕获实验均在之前描述过的模块化自制共聚焦显微镜系统上进行40,47,75,76,77。PDMS玻璃样品室安装在一个压电驱动的舞台上（P-527.3CD，Physik Instrumente，德国），该平台集成在一台倒置显微镜（IX71，Olympus）中。一个线偏振的连续波491纳米激光（Calypso，Cobolt，瑞典）通过两个电光光束偏转器（EOD，M310A，Conoptics，美国）设置成32点的Knight’s tour激光聚焦模式，扫描速度为每完整模式8 kHz。激光功率在焦平面上衰减到34微瓦。激光聚焦模式在焦平面上的大小为2.34×2.34微米2。激发光和检测光束都通过一个油浸物镜（60倍，PlanApo N，油，NA 1.42，Olympus，德国）。一个二向色镜（zt 488 RDC，AHF，德国）将检测到的荧光与激发光分离。管镜像平面上的一个小孔（200微米）优化了信噪比。一个二向色分光器（HC BS 580i，AHF）在光谱上分离了供体和受体荧光信号，然后通过两个单光子计数雪崩光电二极管（APD，SPCM-AQRH 14，Excelitas，美国）进行测量。一个带通（ET 535/70，AHF，德国）和长通（LP 594，AHF，德国）滤光片进一步确定了供体和受体通道的精确波长检测范围。所有滤光片的选择都旨在保持非偏振荧光检测条件。时间相关的单光子计数（TCSPC）模块（SPC-180NX，带有路由器HRT-82，Becker & Hickl，德国）以FIFO模式记录到达的光子，并使用SPCM软件（版本8.9）进行处理。一个现场可编程门阵列模块（FPGA，PCIe-7852R，80 MHz工作频率，National Instruments，美国）操作EOD的高电压控制器（7602M，Krohn-Hite Corporation，美国）和反馈电压放大器（自制，|VPP|= 20 V），通过四个铂电极施加电场以抵消分子的布朗运动。实现的Kalman滤波器将检测到的光子信号与扫描模式位置相关联并估计粒子轨迹。原始控制软件（Labview，National Instruments）由A. Fields和A. E. Cohen提供40，并进行了修改47,76，以匹配我们的硬件配置并实现Knight’s tour模式。

**微流控装置的制备**
ABEL捕获用的一次性微流控室是根据Heitkamp等人的描述75使用硼硅酸盐玻璃晶圆上的已发布设计76,104制作的。PDMS与硬化剂的比为10:1，在50°C下固化48小时（Sylgard 184弹性体，Dow，Midland，MI，美国）。使用尖锐的针在PDMS部分打孔以制作电极孔。PDMS芯片在纯丙酮中超声处理，用去离子水冲洗并在氮气流中干燥。PDMS和32×24毫米的盖玻片经过等离子体蚀刻90秒，然后粘合3分钟形成一个样品室。在冰上解冻标记有A2AARL225C/Q310C的纳米盘复性溶液，将受体稀释在含有10 mM NaCl、20 mM HEPES pH 7.5的缓冲液中，最终浓度约为50 pM。选择较低的盐浓度（10 mM NaCl）以最小化静电屏蔽，从而提高ABEL捕获性能。对于配体结合，受体在冰上预孵育10微摩尔ZM24138、10微摩尔NECA或100微摩尔腺苷10分钟。我们将10微升的分析物溶液填充到ABEL捕获的PDMS/玻璃室中。每25分钟更换一次样品室。对于每种apo或配体结合状态，至少进行三次ABEL-FRET记录，每次使用新的一次性微流控室和来自同一纯化和标记批次的新的蛋白质样品。每种条件至少在不同的一天进行两次测量。

**数据分析和处理**
我们使用定制版本的“Burst Analyzer”软件105（版本3.4.1；Becker & Hickl）分析了供体和受体通道中的荧光强度时间迹线，时间分辨率为1毫秒。荧光爆发使用每毫秒25-40光子计数的逐步增加作为成功捕获事件的开始，以及逐步回归到背景荧光水平作为捕获事件的结束。供体通道的平均背景水平约为每毫秒10-15光子计数，受体通道为每毫秒20-25光子计数，这是由于PDMS和盖玻片的发光造成的。为了排除没有受体染料或具有光物理不活跃受体的受体，只选择在受体通道中显示出逐步上升和下降至背景水平的荧光爆发的事件。在爆发中的受体闪烁和漂白事件表现为受体通道中的荧光突然下降到背景水平——在这些情况下，爆发被分割成具有连续受体荧光的部分。由于两个通道的背景都以时间依赖的方式减少，因此必须对每个光子爆发分别减去背景。在手动选择爆发后，如果两个检测通道合并的荧光强度平均值超过每毫秒40光子计数，或者爆发持续时间少于100毫秒，则从后续分析中移除这些爆发。

**扩散分析**
扩散分析使用了ABEL捕获装置的Field-Programmable Gate Array（FPGA）的数据。共分析了64个捕获时间超过100毫秒的爆发（补充图2）。在ABEL捕获期间，FPGA以毫秒分辨率记录施加的电极电压和光子计数，以便后续进行扩散分析。这些电压脉冲抵消布朗运动并将分子的运动重新引导回中心。使用Kalman滤波器根据分子的位置概率重建了一个虚拟扩散路径，并对虚拟扩散轨迹进行了二维MSD（平均平方位移）分析，以获得捕获分子的扩散系数106,107。所需的平均横向束腰信息w0=0.6微米是通过在ABEL捕获记录当天使用罗丹明110在H2O中的FCS获得的，激光焦点位置固定。

**计算机模拟和统计自举**
我们使用计算机模拟在两种情景下对爆发数据进行重新着色：“静态均匀性”和“静态非均匀性”。在这两种情况下，每次爆发的PR随时间保持不变，爆发的数量、持续时间和散粒噪声水平与实验数据中观察到的相匹配。在“静态均匀性”情景下，所有爆发共享相同的爆发PR，该PR与实验数据中所有1毫秒时间bin的平均PR相匹配。在“静态非均匀性”情景下，爆发PR的分布与实验数据中的分布相匹配。对于每个实验爆发，我们模拟了其“静态均匀性”和“静态非均匀性”重新着色的版本，这些版本具有相同数量的1毫秒时间bin。在模拟爆发的每个第k个时间bin中，总光子数I(k)等于实验爆发中相应第k个时间bin的总未校正光子数。然后根据情景将光子分配到供体或受体通道。我们重新着色了背景光子计数，假设在爆发内的所有1毫秒时间bin中背景光子的总数是恒定的。对于背景光子计数，根据给定爆发中受体和供体通道的背景荧光强度比率，将光子数模拟为二项分布变量。对于背景校正后的光子计数，根据模拟爆发的真实PR，将供体和受体通道中的光子数模拟为二项分布变量。在“静态均匀性”情景下，每个模拟爆发的真实PR等于所有实验爆发中所有1毫秒时间bin的平均PR。在“静态非均匀性”情景下，它等于重新着色前的爆发测量值。重新着色后，模拟爆发的荧光强度根据恒定背景进行了校正，并与实验爆发一起进行分析。我们使用统计自举方法估计了爆发数据的95%置信区间。每组N个实验爆发数据重采样200次，每次重采样涉及随机抽取，允许某些爆发被多次选中，而其他爆发可能根本不会被选中。对于每种条件（apo和配体结合），我们分别分析了重新采样的数据集，并确定了每种分析方法确定的平均值和95%置信区间。

**方差分析**
我们的方差分析基于Burst Variance Analysis方法73，并对其进行了适应，以用于ABEL-FRET数据的分析。对于每次脉冲，计算了按区间划分的PR值的标准差（σ）。脉冲被分成N=51个等间隔的区间（PRi, PRi+1），这些区间的中心分别位于PR=0.00、0.02、0.04、…、0.98、1.00。只有包含超过20次脉冲的区间才被纳入分析。在每个区间内，确定了σ的平均值（<σ>），并将其与区间中心处的PR值进行绘图，区间长度为0.5*(PRi+ PRi+1)。该分析既适用于实验数据，也适用于“静态异质性”情景下的模拟数据。为了估计<σ>的95%置信区间，采用了统计自助法。

**ABEL-FRET数据的相关性分析**
我们计算了荧光强度（供体D、受体A或其总和）的相关函数GAxA(τ)、GDxD(τ)和Gsum×sum(τ)，所有这些函数都是在1毫秒的时间间隔内测量的（均在供体激发后）：
$$
{G}^{X\times Y}\left(\tau \right)=\frac{{\left\langle {X}_{k}\left(t\right)\cdot {Y}_{k}\left(t+\tau \right)\right\rangle }_{t,k}}{{\left\langle {X}_{k}\left(t\right)\right\rangle }_{t,k}\cdot {\left\langle {Y}_{k}\left(t+\tau \right)\right\rangle }_{t,k}}-1
$$
其中\(X_k\left(t\right)\)和\(Y_k\left(t+\tau \right)\)分别表示第k次脉冲中时间\(t\)和\(t+\tau\)时相关通道\(X\)和\(Y\)的荧光强度。平均值的计算方法如下：
$$
{G}^{X\times Y}\left(\tau \right)=\frac{\left({\sum }_{k:{T}_{k} > \tau }{\sum }_{t=0}^{{T}_{k}-\tau -1}{X}_{k}\left(t\right){Y}_{k}\left(t+\tau \right)\right)\cdot \left({\sum }_{k:{T}_{k} > \tau }\left({T}_{k}-\tau \right)\right)}{\left({\sum }_{k:{T}_{k} > \tau }{\sum }_{t=0}^{{T}_{k}-\tau -1}{X}_{k}\left(t\right)\right)\cdot \left({\sum }_{k:{T}_{k} > \tau }{\sum }_{t=0}^{{T}_{k}-\tau -1}{Y}_{k}\left(t+\tau \right)\right)}-1
$$
脉冲宽度用\({T}_{k}\)表示。为了估计{G}^{X\times Y}\left(\tau \right)\的95%置信区间，也采用了统计自助法。

我们还计算了在1毫秒时间间隔内测量的PR值的自相关函数\({g}^{{{{\rm{PR}}}}\times {{{\rm{PR}}}}}\left(\tau \right)\)。为了比较“静态异质性”和“静态同质性”情景下实验数据与模拟数据之间的相关性曲线，我们用PR的标准差对自相关函数进行了归一化：
$$
{g}^{{{{\rm{PR}}}}\times {{{\rm{PR}}}}}\left(\tau \right)=\frac{{\left\langle \delta {{{{\rm{PR}}}}}_{k}\left(t\right)\cdot \delta {{{{\rm{PR}}}}}_{k}\left(t+\tau \right)\right\rangle }_{t,k}}{{\sigma }_{{{{\rm{PR}}}}}^{(t)}\cdot {\sigma }_{{{{\rm{PR}}}}}^{(t+\tau )}
$$
其中\(\delta {{{{\rm{PR}}}}}_{k}\left(t\right)\)和\(\delta {{{{\rm{PR}}}}}_{k}\left(t+\tau \right)\)表示第k次脉冲中时间\(t\)和\(t+\tau\)时PR值相对于其集合平均值的偏差：
$$
{\mu }^{(t)}=\frac{{\sum }_{k:{T}_{k} > \tau }{\sum }_{t=0}^{{T}_{k}-\tau -1}{{{{\rm{PR}}}}}_{k}\left(t\right)}{{\sum }_{k:{T}_{k} > \tau }{T}_{k}-\tau }\,;\,{\mu }^{(t+\tau )}=\frac{{\sum }_{k:{T}_{k} > \tau }{\sum }_{t=0}^{{T}_{k}-\tau -1}{{{{\rm{PR}}}}}_{k}\left(t+\tau \right)}{{\sum }_{k:{T}_{k} > \tau }{T}_{k}-\tau }
$$
标准差的计算公式为：
$$
{\sigma }_{{{{\rm{PR}}}}}^{(t)} = {\left(\frac{{\sum }_{k:{T}_{k} > \tau }{\sum }_{t=0}^{{T}_{k}-\tau -1}{\left({{{\rm{PR}}}}}_{k}\left(t\right)-{\mu }^{\left(t\right)}\right)}^{2}}{{\sum }_{k:{T}_{k} > \tau }{T}_{k}-\tau }\right)}^{1/2}\,;\, \\
{\sigma }_{{{{\rm{PR}}}}}^{(t+\tau )} = {\left(\frac{{\sum }_{k:{T}_{k} > \tau }{\sum }_{t=0}^{{T}_{k}-\tau -1}{\left({{{{\rm{PR}}}}}_{k}\left(t+\tau \right)-{\mu }^{\left(t+\tau \right)}\right)}^{2}}{{\sum }_{k:{T}_{k} > \tau }{T}_{k}-\tau }\right)}^{1/2}
$$
方程式5中的分子计算公式为：
$$
{\left\langle \delta {{{{\rm{PR}}}}}_{k}\left(t\right)\cdot \delta {{{{\rm{PR}}}}}_{k}\left(t+\tau \right)\right\rangle }_{t,k}
$$
作为\({{{\rm{PR}}}}}_{k}\left(t\right)\)和\({{{\rm{PR}}}}}_{k}\left(t+\tau \right)\)的皮尔逊相关系数，归一化的自相关函数\({g}^{{{{\rm{PR}}}}\times {{{\rm{PR}}}}}\left(\tau \right)\)的值范围在-1到1之间，如果\({{{\rm{PR}}}}\left(t\right)\)和\({{{\rm{PR}}}}\left(t+\tau \right)\)不相关，则其值为零。对于“静态异质性”和“静态同质性”情景下的实验数据及模拟数据，都计算了\({g}^{{{{\rm{PR}}}}\times {{{\rm{PR}}}}}\left(\tau \right)\)。为了估计\({g}^{{{{\rm{PR}}}}\times {{{\rm{PR}}}}}\left(\tau \right)\的95%置信区间，也采用了统计自助法。

**PR分布的复发分析**
我们的复发分析基于单粒子复发分析的方法，并对其进行了调整以适应ABEL-FRET数据的分析。对于每个脉冲数据集，PR值是在1毫秒的时间间隔内计算的。在这里，PRi(t)表示从脉冲开始到时间t的第i次脉冲中的PR值。\(\widetilde{{{{\rm{PR}}}}}\)表示所有脉冲中所有时间间隔内PRi(t)的中值。那些\({{{\rm{P}}}}{{{{\rm{R}}}}}_{{{{\rm{i}}}}}(t) > \widetilde{{{{\rm{PR}}}}}\)的时间间隔被定义为“高FRET”区域（HF），而\({{{\rm{PR}}}}}_{i}(t) < \widetilde{{{{\rm{PR}}}}}\)的时间间隔被定义为“低FRET”区域（LF）。

对于时间滞后τ=1毫秒和τ=200毫秒的情况，我们对所有持续时间超过τ的脉冲（\(i:{\omega }_{i} > \tau\)）以及所有时间点t（\(t-\tau\)和t都在脉冲范围内，即\(0\le t-\tau ,t\le {\omega }_{i}\)）内的PRi(t)值进行了直方图分析，其中PRi(t-τ)属于LF区域（如果从LF开始：\(P{R}_{i}(t-\tau ) < \widetilde{{PR}}\)）或HF区域（如果从HF开始：\(P{R}_{i}(t-\tau ) > \widetilde{{PR}}\)）。作为参考，我们也对所有脉冲和所有时间点的PRi(t)值进行了直方图分析。

此外，对于不同的时间滞后τ，我们计算了在给定PRi(t-τ)属于LF区域（如果从LF开始：\({{{\rm{PR}}}_{i}(t-\tau ) < \widetilde{{{{\rm{PR}}}}}\)）或HF区域（如果从HF开始：\({{{\rm{PR}}}_{i}(t-\tau ) > \widetilde{{{{\rm{PR}}}}}\)的情况下观察到PRi(t)属于HF区域的条件概率。这两个概率作为τ的函数进行了绘制：
$$
{{\rm{Start}}}}\,{{{\rm{at}}}}\,{{{\rm{HF}}}}:\, p({{{\rm{HF}}}}(t)|{{{\rm{HF}}}}(t-\tau }}= \\ p \left({{{\rm{P}}}}{{{\rm{R}}}}}_{{{{\rm{i}}}}(t) > \widetilde{{{{\rm{PR}}}}}|{{{{\rm{PR}}}}}_{i}(t-\tau ) > \widetilde{{{{\rm{PR}}}}}{;i}:{\omega }_{i}\ge \tau {;t}:0\le t-\tau ,t\le {\omega }_{i}\right) \\
{{\rm{Start}}}}\,{{{\rm{at\,LF}}}}:\, p({{{\rm{HF}}}}(t)|{{{\rm{LF}}}}(t-\tau )) = \\ p\left({{{\rm{PR}}}}}_{i}(t) > \widetilde{{{{\rm{PR}}}}}|{{{{\rm{PR}}}}}_{i}(t-\tau ) < {{{{\rm{PR}}}}}{;i}:{\omega }_{i}\ge \tau {;t}:0\le t-\tau ,t\le {\omega }_{i}\right)
$$
该分析既适用于实验数据，也适用于“静态异质性”情景下的模拟数据。为了估计\(p({{{\rm{HF}}}}(t)|{{{\rm{HF}}}}(t-\tau ))\)和\(p({{{\rm{HF}}}}(t)|{{{\rm{LF}}}}(t-\tau ))\)的95%置信区间，也采用了统计自助法。