通过整合孟德尔随机化方法、病理组学分析以及基于表达数量性状位点（eQTLs）和全基因组关联研究（GWAS）的数据，研究发现错配修复基因可作为胃腺癌的预后生物标志物

《International Journal of Genomics》：Integrative Mendelian Randomization and Pathomics Analysis Using Expression Quantitative Trait Loci and Genome-Wide Association Study Data Identifies Mismatch Repair Genes as Prognostic Biomarkers in Gastric Adenocarcinoma

　　摘要

背景
mismatch repair (MMR) 基因与胃腺癌 (STAD) 的发生有关。本研究评估了这些基因在 STAD 中的致病作用及其预后价值，并开发了一个基于组织病理学的模型来预测 MutS 同源物 2 (MSH2) 的表达水平。

方法
利用 IEU OpenGWAS 数据库中的数据，通过五种 Mendelian 随机化 (MR) 模型来评估 MMR 基因与胃癌 (GC) 之间的因果关系。通过生存分析来评估预后相关性。使用 TCGA 染色图像的随机森林模型来预测 MSH2 的表达水平。通过病理组学评分、基因集富集分析 (GSEA)、免疫浸润和肿瘤突变负担 (TMB) 来探索生物学机制。

结果
MR 分析确定 MLH1 和 PMS2 为风险基因，而 MSH2 具有保护作用。Cox 回归分析证实 MSH2 是一个独立的保护因素（HR = 0.690，95% CI: 0.487–0.977，p < 0.05）。该病理组学模型对 MSH2 表达的预测准确率为 0.811。高生存概率 (SP) 组和低生存概率组之间的比较显示了差异表达基因，包括 SFRP4。高 SP 组的 TMB 和 TP53 突变频率较高。

结论
MMR 基因，尤其是 MSH2，在 STAD 的发生和预后中起着关键作用。基于图像的模型能够有效预测 MSH2 的表达水平，支持将基因组学和组织病理学数据整合用于个性化胃癌护理。

1. 引言
胃癌 (GC) 是全球癌症相关死亡的主要原因 [1–4]。其主要组织学亚型——胃腺癌（也称为胃腺癌 STAD）占 GC 病例的 90% 以上。STAD 具有高度的生物学异质性，这意味着肿瘤在遗传、分子和细胞特征上可能存在很大差异。这种多样性增加了对其发病机制的理解难度，并在诊断和治疗方面带来了挑战 [5]。其侵袭性以及较低的早期检出率（约 20%）导致 5 年生存率低于 30% [6]。国际癌症研究机构报告称，2022 年全球新增 GC 病例超过 968,000 例，相关死亡人数接近 660,000 例 [7]。尽管治疗策略有所进步，但 STAD 的早期诊断和准确预后预测仍是一个主要的临床挑战 [8–11]。因此，迫切需要更有效地探索和整合现有的诊断和治疗方法。精确评估肿瘤的分子特征对于克服这些挑战至关重要。现代分子成像技术的进步使得能够对肿瘤特异性目标进行无创的体内可视化。例如，近红外荧光/切伦科夫发光双模成像可以动态评估肿瘤程序性死亡配体 1 的表达水平，为利用成像推断肿瘤的分子生物学状态提供了概念验证 [12]。在临床实践中，基于图像的评估已成为 GC 管理的基石。特别是，增强型计算机断层扫描与血清肿瘤标志物（如甲胎蛋白）的结合，在识别特定亚型（如胃肝样腺癌）方面证明了其价值，突显了整合多模态信息解决特定临床问题的实用性 [13]。然而，这些方法主要反映了肿瘤的宏观表型或间接指标，仍然缺乏与驱动肿瘤发展和进展的核心基因组功能的直接、稳定的联系。MMR 基因通过纠正 DNA 复制错误在维持基因组稳定性中起着关键作用。这些基因的缺陷可能导致突变积累，从而促进癌症的发展 [14, 15]。最近在分子生物学领域的进展阐明了 STAD 的遗传背景和分子机制，MMR 基因被认定为肿瘤发生的关键调节因子 [16–18]。由 MMR 缺失（如 MutS 同源物 1 (MLH1) 和 PMS1 同源物 2 (PMS2) 的缺失）引起的 MMR 缺陷 (MMRD) 与微卫星不稳定性 (MSI) 密切相关，后者会增加基因组不稳定性并可能推动 GC 的发展和进展 [19]。值得注意的是，MMRD 已被确定为晚期 GC 的一个独立且稳健的预后因素。然而，对于 MMRD 患者，辅助 5-氟尿嘧啶化疗的效果有限，这表明 MMR 状态影响化疗反应 [20]。此外，MMR 缺陷的胃食管腺癌患者似乎更受益于免疫疗法 [21]。尽管有这些重要发现，但关键 MMR 基因（包括 MLH1、MutS 同源物 2 (MSH2) 和 PMS2）的精确作用、它们与 STAD 的因果关系及其对患者预后的影响仍需进一步研究 [18, 22]。目前评估 MMR 状态的诊断方法（如免疫组化和基于聚合酶链反应的 MSI 测试）存在局限性，因此需要改进的方法。Mendelian 随机化 (MR) 是一种强大的分析方法，它使用遗传变异作为工具变量 (IVs) 来最小化观察性研究中的混杂和反向因果偏差 [23–25]。这种方法提高了目标暴露与临床结果之间因果推断的可靠性 [26]。尽管现代遗传诊断通常依赖于从外周血和体液中提取的液体活检 DNA 分析，但这些技术受到侵入性采样程序、高成本、漫长的周转时间和无法充分捕捉肿瘤内异质性的限制 [27]。病理组学将机器学习与组织病理学评估相结合，通过计算分析组织标本中的细胞形态和组织结构，系统地量化肿瘤生物学特征和免疫微环境的变化，提供了一种新的解决方案 [28–30]。这种方法在 GC 的预后评估中显示出有希望的应用前景 [31]。在本研究中，我们旨在阐明 MMR 在 STAD 中的生物学机制并评估其临床相关性。为此，我们将遗传因果推断与先进的计算病理学方法相结合，利用 MR 分析与基于病理组学的模型来推断因果关系，全面研究 MMR 在 STAD 中的生物学机制并定量描述肿瘤特征。这种综合策略解决了当前的知识空白，有潜力改进早期诊断、优化治疗策略并提高预后预测，最终有助于更精确和个性化的胃癌管理。

2. 材料与方法
2.1 MMR 相关基因与 GC 之间的关联
2.1.1 研究设计和数据来源
我们进行了一项 MR 研究，以调查 MMR 相关基因与 GC 风险之间的因果关系。MMR 基因的表达定量性状位点 (eQTLs) 作为暴露因素，与这些基因显著相关的单核苷酸多态性 (SNPs) 作为工具变量 (IVs)，全基因组关联研究 (GWAS) 的 GC 摘要统计结果作为结局变量。这两个数据集均来自欧洲血统的人群。总体设计如图 S1 所示，详细的数据集特征在支持信息的表 S5 中提供。
2.1.2 工具变量的选择
选择工具变量 (IVs) 时考虑了它们与基因表达的关联性和与混杂因素的独立性。具体来说，IVs 需满足 MR 的三个核心假设：
(1) 相关性：IVs 与暴露因素具有强相关性，使用显著性阈值 p < 1×10?5。虽然这个阈值比传统的全基因组显著性水平 (p < 5×10?8) 更宽松，但它平衡了工具变量的强度和可用性。
(2) 独立性：IVs 与影响暴露因素和结局因素的混杂因素无关。
(3) 排除限制：IVs 仅通过暴露因素影响结局，没有水平多效性。通过淘汰连锁不平衡 (LD) 的 SNP 并过滤掉与混杂因素或结局因素相关的变异来确保独立性。移除了回文和异常值的 SNP 以减少偏差。MMR 相关基因 (MSH2、MLH1、mutL 同源物 3 [MLH3]、MutS 同源物 3 [MSH3]、MutS 同源物 6 [MSH6]、PMS1 同源物 1 [PMS1] 的 eQTL 数据以及 GC 的 GWAS 摘要统计结果（633 例病例和 174,006 例对照；数据集：finn-b-C3_STOMACH_EXALLC）来源于 Integrative Epidemiology Unit Open Genome-Wide Association Studies (IEU OpenGWAS) 项目 (https://gwas.mrcieu.ac.uk/)，访问日期为 2024 年 10 月 29 日。这两个数据集均来自欧洲血统的人群，这可能限制了研究结果对其他种族群体的普遍适用性。数据集的详细特征在支持信息的表 S5 中总结。由于所有原始研究都获得了参与者的知情同意，因此这项 secondary 分析不需要伦理批准。IV 选择的详细标准，包括所有具体阈值和参数，在支持信息 S2.1.2 中描述。
2.1.3 MR 分析
使用五种回归方法进行 MR 分析，以逆方差加权 (IVW) 为主要方法。进行异质性和水平多效性测试以验证 IV 假设。敏感性分析（包括留一法测试）评估了模型的稳健性。支持信息 S2.1.3 中提供了软件工具和详细的统计阈值。使用的五种回归方法包括 MR-Egger 回归、IVW、加权中位数、加权模式和简单模式。由于在有效 IV 假设下的效率较高，IVW 是主要方法，其他方法提供了补充分析。Cochran 的 Q 法测试评估了 SNP 之间的异质性，p < 0.05 表示存在显著异质性。使用 MR-Egger 截距测试和 MR-PRESSO 全局测试评估水平多效性；MR-Egger 回归的截距项与 0 之间的非显著差异 (p > 0.05) 和 MR-PRESSO 中的 p > 0.05 表明没有水平多效性。通过依次移除每个 SNP 来进行留一法敏感性分析，以评估其对整体估计的影响。所有分析均使用 R 版本 4.1.0 的 TwoSample MR 包实现，显著性阈值为 α = 0.05。
2.2 MMR 相关基因的生存和预后分析
生存分析集中在通过 MR 识别出的对 GC 风险有显著因果效应的基因（“阳性基因”）。使用 Kaplan–Meier (KM) 曲线、对数秩检验和 Cox 比例风险回归模型（单变量和多变量）来评估总体生存 (OS) 和预后显著性。进行亚组和交互作用分析以探索临床异质性。详细的统计方法和软件实现可以在支持信息 S2.2 中找到。
2.3 病理组学模型的建立
2.3.1 图像获取、分割和特征提取
处理组织病理学图像以提取用于建模基因表达的定量特征。两名未了解所有分子亚型和患者结果的病理学家独立审查了整张切片图像。根据预定标准（例如，组织完整性、无伪影和足够的肿瘤细胞密度），他们选择了代表性高的肿瘤区域。然后从这些共识区域中提取固定数量的子图像以进行后续的特征提取。图像获取、分割和特征提取的详细协议在支持信息 S2.3.1 中描述。
2.3.2 随机森林模型的建立和评估
开发了一个随机森林分类器，使用选定的组织病理学特征来预测基因表达水平。将数据集分为训练集和验证集，并分两个阶段进行特征选择。使用准确性、敏感性、特异性、AUC、校准和决策曲线分析 (DCA) 来评估模型性能。随机森林模型的建立和评估的详细协议在支持信息 S2.3.2 中描述。
2.3.3 病理组学评分 (PS) 用于生存和预后分析
PS 是来自训练有素的病理组学模型的连续定量输出。对于每个患者的 H&E 图像，PS 表示模型计算出的样本属于“高风险”分子表型的概率或似然分数（例如，与低 MMR 基因表达相关）。较高的 PS 表示预测的该表型概率较大。为了评估 PS 的临床相关性，使用最大选择排序统计量（survminer R 包）确定了一个最佳截断值，将患者分为高 PS 组和低 PS 组。使用适当的统计测试（分类变量使用卡方检验；连续变量使用学生 t 检验或 Wilcoxon 秩和检验）总结了两组之间的基线临床特征并进行比较。通过 KM 生存分析、对数秩检验、单变量和多变量 Cox 比例风险回归以及亚组分析来评估 PS 组的预后价值。在 Cox 模型中，连续变量（例如年龄）被视为连续预测因子，而分类变量（例如肿瘤阶段、性别）作为因素纳入。使用 Schoenfeld 残差图验证了比例风险假设，未观察到主要变量的显著违反。统计方法和亚组分析的详细描述在支持信息 S2.3.3.I 中提供。
2.3.4 名义图模型的建立和评估
构建了一个包含 PS 和临床变量的 Cox 回归名义图，以预测多个时间点的生存概率 (SPs)。评估了模型的区分能力、校准和临床实用性。该名义图用于预测 36 个月、48 个月和 60 个月的 SPs，结合了基于单变量分析和临床判断选择的六个临床相关变量。使用 R 包 timeROC 生成的时间依赖性 ROC 曲线来评估每个时间节点（36 个月、48 个月和 60 个月）的模型区分能力。通过校准曲线图评估了名义图预测模型的校准效果。临床净益通过DCA进行了评估。PS-临床诺模图的时间AUC预测性能与基于单独临床变量构建的模型进行了比较，使用统计测试来评估AUC的差异。诺模图设计和验证方法的详细描述见支持信息S2.3.4。

2.4. 诺模图模型的生物学相关性探索

2.4.1. 不同SP组之间的差异基因表达和富集分析

差异表达分析在诺模图预测的高SP组和低SP组之间进行。基因集富集分析识别出与生存差异相关的生物学途径。根据PS-临床诺模图预测模型预测的时间AUC值，将时间点上时间AUC最高的SP组使用中位数方法分为高组和低组。来自癌症基因组图谱（TCGA-STAD）项目的STAD队列的RNAseq数据（HTSeq–PKM）进行了对数2转换。基于倍数变化>1.2和p < 0.05的阈值，识别出SP组之间的差异表达基因（DEGs），未应用多重检验校正，以避免潜在掩盖生物学相关信号[32]。差异表达分析作为探索性步骤进行，以指导后续的基因集富集分析（GSEA）。因此，使用了名义p值阈值（p < 0.05），但不进行多重检验校正，同时理解应谨慎解释单个基因水平的结果。主要的机制洞察来自更稳健的途径水平GSEA结果。使用R包ggplot2（v3.5.2）生成的热图可视化了20个最显著下调的基因[33]。GSEA使用R包clusterProfiler（v4.6.2）和分子标志数据库（MSigDB）中的京都基因与基因组百科全书（KEGG；c2.cp.kegg.v7.5.1.symbols.gmt）及Hallmark（h.all.v7.5.1.symbols.gmt）基因集来探索高SP组和低SP组之间SP表达的差异。

2.4.2. SP与免疫细胞丰度之间的相关性

免疫细胞浸润水平是根据基因表达数据估计的，并评估了其与SP的相关性。将GC样本的基因表达数据上传到ImmuCellAI数据库（https://guolab.wchscu.cn/ImmuCellAI/#!/）以估计免疫细胞浸润水平。使用Spearman等级相关性来评估SP与免疫细胞丰度之间的相关性。免疫细胞估算和统计分析的详细方法见支持信息S2.4.2。

2.4.3. 肿瘤突变负担（TMB）和体细胞突变分析

分析了TMB和体细胞突变谱，以探索生存组之间的基因组差异。下载了来自TCGA-STAD队列的突变注释格式（.MAF）文件。TMB通过已建立的流程和R包maftools计算每兆碱基的体细胞突变数量。使用Wilcoxon秩和检验评估高SP组和低SP组之间的TMB差异。体细胞变异存储在具有MAF扩展名的文件中，使用R包maftools分析和可视化STAD队列中突变频率最高的15个基因。突变数据处理的详细方法和统计比较见支持信息S2.4.3。

3. 结果

3.1. MMR相关基因与胃癌之间的因果关联

使用蛋白质编码MRM相关基因（MSH2、MLH1、MLH3、MSH6、PMS1和PMS2）的eQTL数据，筛选出474个与GC相关的SNP作为IVs（见支持信息中的表S1）。对这些SNP进行MR分析，以探索MRM相关基因与GC风险之间的因果关联（见图1）。图1显示了MMR相关基因与胃癌的因果关联。IVW分析显示，三个MMR相关基因（MLH1、MSH2和PMS2）与GC风险显著相关。MLH1（比值比[OR] = 1.201，95%置信区间[CI]：1.055–1.366，p = 0.005）和PMS2（OR = 1.213，95% CI：1.012–1.454，p = 0.036）与GC风险增加相关，而MSH2（OR = 0.907，95% CI：0.848–0.970，p = 0.005）与GC风险降低相关。异质性测试表明这三个MMR相关基因的SNP之间没有显著异质性（I2 < 50%，Cochran’s Q检验：p > 0.05）。MR-Egger截距测试显示截距项与0之间没有显著差异（p > 0.05），MR-PRESSO全局测试未显示水平多效性的证据（p > 0.05）（见支持信息中的表S2）。漏斗图分布均匀且对称，留一法分析未发现任何可能显著影响MR结果的有影响力的SNP（见支持信息中的图S2），这支持了MR结果的稳健性。

3.2. MLH1、MSH2和PMS2的预后意义

使用R包survminer确定了MLH1（2.045）、MSH2（1.744）和PMS2（1.702）的表达截止值。患者被分为高表达组和低表达组。MLH1、MSH2和PMS2的高表达组与低表达组的中位OS时间分别为26.0个月对比56.2个月、56.2个月对比26.7个月和34.8个月对比29.0个月。对数秩检验显示MLH1和MSH2高表达组与低表达组的OS有显著差异（p < 0.05），这与MR的方向一致。MLH2高表达组和低表达组之间没有观察到OS的显著差异（p = 0.165）。这些结果表明，高MLH1表达与较差的OS相关，而高MSH2表达与OS改善相关（见图2(a)、2(b)、2(c)）。图2(a–c)显示了MLH1、MSH2和PMS2的Kaplan–Meier（KM）总生存（OS）曲线；图2(d)显示了MSH2的亚组分析。

单变量Cox回归分析确定MSH2（HR = 0.691，95% CI：0.490–0.975，p < 0.05）和PMS2（HR = 0.780，95% CI：0.549–1.108，p > 0.05）是OS的保护因素，而高MLH1表达与OS增加的风险相关（HR = 1.553，95% CI：1.079–2.233，p < 0.05）。MSH2和MLH1的HR方向与其各自的KM生存曲线一致。尽管KM曲线表明PMS2具有保护作用，但与MR分析观察到的方向相反。值得注意的是，MLH1被广泛认为是MMR家族中的肿瘤抑制基因，是许多癌症的保护因素，大量研究表明肿瘤发展通常与MMR基因的丢失或表达下降有关[34–36]。多变量Cox回归分析调整显示，高MSH2表达是OS的独立保护因素（HR = 0.690，95% CI：0.487–0.977，p < 0.05）。基于这些发现，MSH2基因被选为STAD进一步分析的MMR基因家族的代表生物标志物。亚组分析显示，MSH2表达增加是≤65岁患者（HR = 0.522，95% CI：0.291–0.940，p < 0.05）和G3级肿瘤患者（HR = 0.640，95% CI：0.418–0.980，p < 0.05）OS的显著保护因素。虽然在统计学上不显著，但在>65岁的患者（HR = 0.726，95% CI：0.470–1.121，p > 0.05）和G1/G2级肿瘤患者中（HR = 0.831，95% CI：0.452–1.529，p > 0.05）观察到MSH2表达升高的保护趋势（见图2(d)）。年龄和组织学等级亚组的交互作用测试的p值分别为0.455和0.526（见支持信息中的表S3），表明MSH2与不同年龄亚组和不同组织学等级亚组之间没有显著交互作用。换句话说，MSH2对OS的保护效果在这些亚组中是相似的。其他临床协变量的类似趋势也被观察到，尽管没有统计显著性。TCGA数据库中包含的328名GC患者的基线特征总结在支持信息中的表S7中。

3.3. MSH2病理组学模型的构建和评估

我们之前的结果确定MSH2表达水平是GC的独立预后因素。因此，我们构建了一个病理组学模型，基于苏木精和伊红（H&E）染色的组织病理图像来预测GC患者的MSH2表达水平。TCGA数据集被随机分为训练集（n = 204）和验证集（n = 87）。这两组与验证集之间的基线特征没有显著差异（p > 0.05），证实了两组之间的可比性。使用mRMR结合递归特征消除（RFE）和RF算法进行了mRMR_RFE筛选。确定了九个最佳图像特征，并用它们来计算相应的PS（见图3(a)、3(b)）。图3(a–b)显示了用于基于组织病理图像特征预测MSH2表达水平的随机森林算法中选定的九个特征及其相对重要性；图3(c–d)显示了模型在训练集和验证集中对MSH2表达预测的接收者操作特征曲线（AUC）下面积；图3(e–f)比较了模型在训练集和验证集中预测的MSH2表达状态概率与真实值；图3(g–h)显示了模型在训练集和验证集中的决策曲线（DCA）曲线；图3(i–j)使用Wilcoxon检验比较了高基因组和低基因组之间的病理组学评分是否不同（ns，p ≥ 0.05；*p < 0.05；**p < 0.05；****p < 0.001）。图3 (e) 在PowerPoint的图形查看器中打开

(a–b) 根据组织病理学图像特征，用于预测MSH2表达水平的随机森林算法中选出的九个特征及其相对重要性。(c–d) 模型在训练集和验证集中预测MSH2表达的接收者操作特征曲线（AUC）下面积。(e–f) 校准曲线，比较训练集和验证集中模型对MSH2表达状态的预测概率与真实值。(g–h) 模型在训练集和验证集中的决策曲线分析（DCA）曲线。(i–j) 使用Wilcoxon检验比较高低基因组之间的病理组学评分是否存在差异。ns, p ≥ 0.05; ?p < 0.05; ??p < 0.01; ???p < 0.001。

图3 (f) 在PowerPoint的图形查看器中打开

(a–b) 根据组织病理学图像特征，用于预测MSH2表达水平的随机森林算法中选出的九个特征及其相对重要性。(c–d) 模型在训练集和验证集中预测MSH2表达的接收者操作特征曲线（AUC）下面积。(e–f) 校准曲线，比较训练集和验证集中模型对MSH2表达状态的预测概率与真实值。(g–h) 模型在训练集和验证集中的决策曲线分析（DCA）曲线。(i–j) 使用Wilcoxon检验比较高低基因组之间的病理组学评分是否存在差异。ns, p ≥ 0.05; ?p < 0.05; ??p < 0.01; ???p < 0.001。

图3 (g) 在PowerPoint的图形查看器中打开

(a–b) 根据组织病理学图像特征，用于预测MSH2表达水平的随机森林算法中选出的九个特征及其相对重要性。(c–d) 模型在训练集和验证集中预测MSH2表达的接收者操作特征曲线（AUC）下面积。(e–f) 校准曲线，比较训练集和验证集中模型对MSH2表达状态的预测概率与真实值。(g–h) 模型在训练集和验证集中的决策曲线分析（DCA）曲线。(i–j) 使用Wilcoxon检验比较高低基因组之间的病理组学评分是否存在差异。ns, p ≥ 0.05; ?p < 0.05; ??p < 0.01; ???p < 0.001。

图3 (h) 在PowerPoint的图形查看器中打开

(a–b) 根据组织病理学图像特征，用于预测MSH2表达水平的随机森林算法中选出的九个特征及其相对重要性。(c–d) 模型在训练集和验证集中预测MSH2表达的接收者操作特征曲线（AUC）下面积。(e–f) 校准曲线，比较训练集和验证集中模型对MSH2表达状态的预测概率与真实值。(g–h) 模型在训练集和验证集中的决策曲线分析（DCA）曲线。(i–j) 使用Wilcoxon检验比较高低基因组之间的病理组学评分是否存在差异。ns, p ≥ 0.05; ?p < 0.05; ??p < 0.01; ???p < 0.001。

图3 (i) 在PowerPoint的图形查看器中打开

(a–b) 根据组织病理学图像特征，用于预测MSH2表达水平的随机森林算法中选出的九个特征及其相对重要性。(c–d) 模型在训练集和验证集中预测MSH2表达的接收者操作特征曲线（AUC）下面积。(e–f) 校准曲线，比较训练集和验证集中模型对MSH2表达状态的预测概率与真实值。(g–h) 模型在训练集和验证集中的决策曲线分析（DCA）曲线。(i–j) 使用Wilcoxon检验比较高低基因组之间的病理组学评分是否存在差异。ns, p ≥ 0.05; ?p < 0.05; ??p < 0.01; ???p < 0.001。

图3 (j) 在PowerPoint的图形查看器中打开

(a–b) 根据组织病理学图像特征，用于预测MSH2表达水平的随机森林算法中选出的九个特征及其相对重要性。(c–d) 模型在训练集和验证集中预测MSH2表达的接收者操作特征曲线（AUC）下面积。(e–f) 校准曲线，比较训练集和验证集中模型对MSH2表达状态的预测概率与真实值。(g–h) 模型在训练集和验证集中的决策曲线分析（DCA）曲线。(i–j) 使用Wilcoxon检验比较高低基因组之间的病理组学评分是否存在差异。ns, p ≥ 0.05; ?p < 0.05; ??p < 0.01; ???p < 0.001。模型性能稳健，在训练集的AUC为0.811，在验证集为0.786。校准曲线和Hosmer–Lemeshow拟合优度检验表明，病理组学预测模型在预测的基因表达升高概率与真实值之间达到了极好的一致性（p > 0.05）。DCA展示了模型的显著临床实用性（图3(c), 3(d), 3(e), 3(f), 3(g), 3(h)）。训练集的关键指标包括阈值为0.495，准确率为0.755，敏感度为0.815，特异性为0.688，Brier分数为0.194。验证集显示准确率为0.713，敏感度为0.565，特异性为0.878，Brier分数为0.205（支持信息中的表S8）。该模型表现出良好的特异性和合理的整体准确率，共同表明模型具有实现良好临床预测性能的潜力。此外，Wilcoxon秩和检验确认了高MSH2表达组与低MSH2表达组之间的病理组学评分存在显著差异（p < 0.05），表明了病理组学模型的良好区分能力（图3(i), 3(j)）。

3.4. PS的预后价值

使用0.540的截断值，患者被分为高PS组（n = 126）和低表达组（n = 165）（支持信息中的表S9）。除了组织类型（p = 0.002）外，高PS组和低PS组在年龄和其他临床因素的分布上没有观察到显著差异（p > 0.05）。高PS组的中位生存时间显著长于低PS组（56.2个月 vs 26.067个月）。高PS表达与改善的生存期（OS）显著相关（p = 0.02），并且在单变量和多变量Cox分析中均作为OS的保护因素（HR = 0.644，95% CI: 0.442–0.937，p = 0.021）和（HR = 0.671，95% CI: 0.455–0.991，p = 0.045）（图4(a), 4(b)）。

图4 (a) 在PowerPoint的图形查看器中打开

Cox单变量（a）、多变量分析（b）的病理组学评分（PS）及其亚组分析（c）。

Cox单变量（a）、多变量分析（b）的病理组学评分（PS）及其亚组分析（c）。

亚组分析显示，对于年龄≤65岁的患者（HR = 0.610，95% CI: 0.336–1.109，p = 0.11）和年龄>65岁的患者（HR = 0.641，95% CI: 0.396–1.039，p = 0.071），升高的PS是OS的保护因素，且PS与不同年龄亚组之间没有显著交互作用（p = 0.85）。在其他协变量中也观察到了类似的保护趋势，各亚组的效果一致（图4(c)；支持信息中的表S4）。这些结果支持PS（反映MSH2表达）作为GC的独立预后标志物。

3.5. 建立Nomogram的模型

基于Cox回归模型构建了一个整合了PS和六个临床变量的Nomogram（图5(a)）。时间依赖的ROC分析显示，预测36个月、48个月和60个月生存概率的AUC分别为0.684、0.736和0.719。校准曲线证明了预测的SP与观察到的SP之间有很好的一致性，DCA确认了模型的临床实用性（图5(b), 5(c), 5(d)）。

图5 (a) 通过Cox回归绘制的36个月、48个月和60个月生存概率的Nomogram，以及六个临床变量。

(a) 通过Cox回归绘制的36个月、48个月和60个月生存概率的Nomogram，以及六个临床变量。

(b–d) Nomogram模型的校准曲线和决策曲线分析（DCA）。

(c) 通过Cox回归绘制的36个月、48个月和60个月生存概率的Nomogram，以及六个临床变量。

(d) Nomogram模型的校准曲线和决策曲线分析（DCA）。

比较时间AUC值表明，基于PS和临床变量的联合预测模型优于其他基于单个临床变量（如性别和组织类型）的预测模型，在36个月、48个月和60个月的时间AUC值上有统计学上的显著差异（p < 0.05）。这表明了联合预测模型的优越预测效能（支持信息中的表S10）。

3.6. MSH2病理组学模型的生物学相关性

3.6.1. 差异基因表达和富集分析

使用PS-临床Nomogram的4年SP（最佳时间AUC = 0.736），根据中位数截断值（0.473）将患者分为高SP组和低SP组。差异表达分析识别出20个表达有显著差异的基因，包括分泌型卷曲相关蛋白4（SFRP4）、脂钙运载蛋白2（LCN2）、gremlin 1（GREM1）和防御素alpha 6（DEFA6）（图6(a)）。其中，SFRP4和GREM1在高SP组中下调，而DEFA6和LCN2在高SP组中上调。

(a) 高生存概率（SP）组和低生存概率（SP）组之间的差异基因分析。

(b–c) 高SP组和低SP组之间差异表达基因的富集分析。p值小于0.05被视为具有统计学意义。

(d) SP与免疫细胞丰度之间的相关性。

(e) 高SP组和低SP组之间的肿瘤突变负担。

(f–g) 高SP组和低SP组之间的基因突变：突变注释multi_Hit表示同一样本中的基因多次突变。

(a) 高生存概率（SP）组和低生存概率（SP）组之间的差异基因分析。

(b–c) 高SP组和低SP组之间差异表达基因的富集分析。p值小于0.05被视为具有统计学意义。

(d) SP与免疫细胞丰度之间的相关性。

(e) 高SP组和低SP组之间的肿瘤突变负担。

(f–g) 高SP组和低SP组之间的基因突变：突变注释multi_Hit表示同一样本中的基因多次突变。

(a) 高生存概率（SP）组和低生存概率（SP）组之间的差异基因分析。

(b–c) 高SP组和低SP组之间差异表达基因的富集分析。p值小于0.05被视为具有统计学意义。

(d) SP与免疫细胞丰度之间的相关性。

(e) 高SP组和低SP组之间的肿瘤突变负担。

(f–g) 高SP组和低SP组之间的基因突变：突变注释multi_Hit表示同一样本中的基因多次突变。

(a) 高生存概率（SP）组和低生存概率（SP）组之间的差异基因分析。

(b–c) 高SP组和低SP组之间差异表达基因的富集分析。p值小于0.05被认为是统计学上显著的。(d) SP与免疫细胞丰度之间的相关性。(e) 高SP组和低SP组之间的肿瘤突变负担。ns, p ≥ 0.05; ?p < 0.05; ??p < 0.01; ???p < 0.001。(f–g) 高SP组和低SP组之间的基因突变：突变注释multi_Hit表示基因在同一样本中多次发生突变。图6 (f)在图查看器中打开PowerPoint

(a) 高生存概率（SP）组和低生存概率（SP）组之间的差异基因分析。(b–c) 高SP组和低SP组之间差异表达基因的富集分析。p值小于0.05被认为是统计学上显著的。(d) SP与免疫细胞丰度之间的相关性。(e) 高SP组和低SP组之间的肿瘤突变负担。ns, p ≥ 0.05; ?p < 0.05; ??p < 0.01; ???p < 0.001。(f–g) 高SP组和低SP组之间的基因突变：突变注释multi_Hit表示基因在同一样本中多次发生突变。图6 (g)在图查看器中打开PowerPoint

(a) 高生存概率（SP）组和低生存概率（SP）组之间的差异基因分析。(b–c) 高SP组和低SP组之间差异表达基因的富集分析。p值小于0.05被认为是统计学上显著的。(d) SP与免疫细胞丰度之间的相关性。(e) 高SP组和低SP组之间的肿瘤突变负担。ns, p ≥ 0.05; ?p < 0.05; ??p < 0.01; ???p < 0.001。(f–g) 高SP组和低SP组之间的基因突变：突变注释multi_Hit表示基因在同一样本中多次发生突变。KEGG通路富集显示DEGs在五个信号通路中显著参与，如ECM_RECEPTORINTERACTION和FOCAL_ADHESION（图6(b)）。特征基因集分析显示EPITHELIAL_MESENCHYMAL_TRANSITION和APOPTOSIS通路富集（图6(c)）。

3.6.2. 免疫细胞浸润、TMB和遗传变异

相关性分析表明，SP与CD4+ T细胞（ρ = ?0.212，p < 0.01）、Tr1细胞（ρ = ?0.237，p < 0.01）、nTreg细胞（ρ = ?0.242，p < 0.01）、iTreg细胞（ρ = ?0.231，p < 0.01）和天真CD4+ T细胞（ρ = ?0.145，p < 0.05）的浸润程度呈负相关（图6(d)）。差异分析显示，高SP组的TMB值显著高于低SP组（p < 0.05）（图6(e)）。错义突变是最常见的突变类型，其次是移码缺失和无义突变。在高SP组和低SP组中，titin（TTN）和肿瘤蛋白p53（TP53）的突变率超过30%，其中TTN、TP53、黏蛋白16（MUC16）、含spectrin重复的核 envelope蛋白1（SYNE1）、AT-rich interaction domain 1A（ARID1A）、FAT非典型cadherin 4（FAT4）和spectrin alpha，erythrocytic 1（SPTA1）的突变率在高SP组中更高（图6(f)，6(g)）。

4. 讨论

MMR缺陷与多种癌症 [37, 38] 相关，但其在STAD中的作用尚未完全了解 [39]。在这项研究中，我们整合了MR和病理组学来研究MMR基因。MR分析显示MLH1和PMS2与食管癌（GC）风险增加有关，而MSH2与风险降低有关。生存分析确认MSH2是一个独立的预后因素。我们开发了一个基于MSH2的预后评分（PS）来预测STAD的预后。基于H&E的病理组学模型准确地预测了MSH2的表达（AUC = 0.811），并且该PS独立地作为一个独立的预后因素。机制分析表明，与MSH2表达相关的遗传因素与SFRP4、CD4+调节性T细胞浸润、TP53突变和TMB有关。MSH2编码一个核心MMR复合体成分，与MSH6或MSH3形成异二聚体以启动DNA MMR [40]。升高的MSH2表达抑制基因组不稳定性、肿瘤异质性和转移。先前的研究已经显示MSH2表达与GC之间存在一致的阳性关联 [41, 42]。此外，高MSH2表达与GC患者的生存期改善有关 [43]，这支持了其在预后和治疗中的相关性。我们的发现进一步强化了MSH2在GC发病机制中的因果作用，并确定了其作为患者预后的独立保护因素。对于PMS2，注意到一个有趣的分歧：MR表明其具有风险效应，而观察性生存分析显示其具有非显著的保护趋势。这可能源于两种方法之间的根本差异：MR推断出生遗传倾向对疾病发生的影响，而生存分析反映了特定临床背景下的体细胞肿瘤生物学和进展。PMS2的非显著生存趋势及其与MR信号的不一致表明，其在确定GC预后中的作用可能是复杂的或复杂的，需要在更大规模的队列中进行进一步研究。组织病理学图像捕捉了预测生存的肿瘤形态和微环境特征 [44]。我们的病理组学模型识别了定量特征（例如，wavelet_HL_glcm_Correlation和wavelet_HL_firstorder_Mean），反映了多个尺度上的肿瘤质地和结构，有助于生存预测。该模型的高准确性验证了AI驱动的组织病理学作为个性化治疗的临床工具。总之，我们的H&E病理组学模型准确预测了MSH2的表达（AUC = 0.811，0.786），这验证了AI驱动的组织病理学分析在临床应用中的有效性，并为制定个性化治疗策略提供了新的视角和重要基础。近年来，放射组学在GC的精确诊断领域取得了显著进展，提供了理解肿瘤异质性的强大宏观尺度工具。例如，Gu等人开发了一个基于CT的放射组学Nomogram，在区分胃黏膜腺癌和传统胃癌方面表现优异（AUC > 0.9）[45]。这项杰出工作展示了从医学图像中提取的高维特征在解决肿瘤亚型分类这一重要临床问题上的价值。我们的研究可以有意义地补充这种前沿的放射组学研究。虽然Gu等人的模型主要解决“什么”的问题——即基于影像特征的肿瘤亚型精确分类——但我们的病理组学模型更深入地探索“为什么”和“它是如何工作的”。具体来说，它试图揭示哪些核心生物功能（MSH2介导的DNA MMR）与特定的组织形态学特征相关，并阐明这种功能状态如何影响肿瘤免疫微环境和基因组稳定性，从而最终决定患者的预后。我们的病理组学模型源自常规的H&E切片，为无缝集成到数字病理工作流程提供了一个潜在的工具。该PS可以作为病理学家的定量辅助工具，可能标记需要更详细分子检测的病例或提供额外的预后信息。然而，在临床应用之前，需要在不同的患者队列、扫描仪平台和病理实验室中进行严格的外部验证，以评估其普遍性和稳健性。未来的前瞻性研究需要评估其在指导临床决策中的实用性。先前的研究表明，MSH2的丢失可能会激活DNA甲基化酶（例如，DNA甲基转移酶1 [DNMT1]），导致SFRP家族成员的高甲基化并形成甲基化反馈环路 [46]。SFRP4在GC中低甲基化且过表达，与肿瘤侵袭性增强 [47, 48] 和患者生存率差 [49] 相关。肿瘤免疫微环境在肿瘤发展中起着关键作用 [50]。MSH2表达与免疫评分呈负相关，并与TMB和MSI相关 [42]。我们的结果表明，高MSH2表达抑制免疫抑制性Treg的浸润，增强抗肿瘤免疫并改善预后。相反，低MSH2促进Treg的浸润和Pd-1/PD-L1通路的激活，促进免疫逃逸和肿瘤进展 [51]。相反，低MSH2表达可能促进CD4+调节性T细胞（Tregs）的浸润，包括天然（nTreg）和诱导（iTreg）亚群，从而激活肿瘤微环境中的PD-1/PD-L1免疫检查点通路。这种免疫抑制环境促进了肿瘤免疫逃逸并促进癌症进展 [52]。作为DNA MMR过程的核心组成部分，MSH2的功能丢失与肿瘤中的高TMB（TMB-H）有关 [53, 54]。研究表明，高MSH2基因表达与GC中的TMB显著正相关 [41]。与此一致，我们的结果显示，在高SP组中观察到高TMB，这反映了MSH2表达的升高。虽然高TMB是免疫检查点阻断反应的公认生物标志物，但其与自然史预后的关联并不一致，可能因癌症类型和基因组背景而异。在我们的队列中，高SP与高TMB之间的关联可能反映了潜在的基因组不稳定，这是MMRD的一个标志。这种状态可能生成新抗原，但也可能与侵袭性肿瘤生物学共存。因此，高TMB在这种特定的分子亚组中的预后影响可能取决于免疫原潜力与其他改变的致癌途径之间的平衡。先前的研究已经表明，微卫星不稳定-高（MSI-H）状态与TP53突变率之间存在负相关，这可能是由DNA甲基化模式和MMR通路内的基因活性介导的 [55]。总体而言，这些发现表明MSH2表达影响基因组稳定性，调节肿瘤免疫微环境，并影响关键基因的突变谱型，共同塑造GC的临床结果。这些发现为GC的诊断和治疗提供了新的见解。尽管计算机化的H&E染色组织病理学图像在减少数据冗余和提取关键形态学特征方面显示出前景 [56]，并支持了我们模型的临床适用性，但仍存在一些限制。首先，MR发现需要进一步的临床评估。其次，整合多个数据集可能会引入批次效应，影响结果的一致性。最重要的是，相对较小的样本量和有限的种族多样性（主要是TCGA-欧洲队列）限制了病理组学数据集的可访问性和我们独特发现的普遍性。我们承认，我们的发现主要基于来自GWAS和TCGA数据的欧洲血统人群。不同种族之间的遗传结构、等位基因频率和LD模式的差异可能会影响我们MR衍生因果估计和病理组学模型的效应大小和普遍性。因此，需要在大型、多种族的队列中进行验证，以确认其更广泛的适用性。第三，我们的MR分析的统计功效受到GC GWAS样本量（633例）的限制。尽管我们采用了严格的仪器选择标准和敏感性分析以确保稳健性，但这种有限的样本量可能降低了我们检测具有适度效应大小的因果关联的能力。需要在更大的GWAS联盟中进行验证。

5. 结论

总之，这项研究是首次使用综合的MR-病理组学框架建立MSH2在STAD中的双重作用，即作为基因组稳定性的关键调节器和肿瘤免疫微环境的调节器。我们已经证明MSH2表达是一个稳健且独立的生物标志物。我们的基于H&E的病理组学模型准确量化了MSH2表达，有助于精确的预后分层，并支持为STAD患者开发个性化治疗策略。

作者贡献

（I）构思和设计：Yingqiao Zhang、Dan Li、Xiushi Zhang 和 Yang Liu。

（II）行政支持：Xiushi Zhang 和 Yang Liu。

（III）研究材料或病人的提供：Yingqiao Zhang、Dan Li、Wenjuan Zhao 和 Pengyu Guo。

（IV）数据收集和组装：Yanmeng Liang、Lin Sui 和 Yuyao Jin。

（V）数据分析和解释：Ziqi Wang、Xinyu Zhu、Zhenqi Ma、Yanmeng Liang 和 Lin Sui。

（VI）手稿撰写：所有作者。

致谢

作者衷心感谢在整个研究过程中提供宝贵见解和指导的所有专家，以及那些提供建设性反馈的人。此外，还要向所有公开其宝贵测序数据的研究人员表示衷心的感谢，这些数据促进了该领域的进展。最后，作者对所有投入时间参与这项工作的机构和个人表示深深的感谢。

资助

这项工作得到了哈尔滨医科大学癌症医院Petrel研究计划（编号JJZD2024-14，资助对象为Yang Liu）和黑龙江省博士后科学研究发展基金（编号LBH-Q20144，资助对象为Yang Liu）的支持。

披露

所有作者均对最终手稿内容进行了最终批准。作者对确保工作的任何部分准确性和完整性相关问题的适当调查和解决负有责任。

伦理声明

所有原始研究均获得了参与者的知情同意；因此，这部分研究不需要伦理委员会的额外批准。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

本研究分析的所有数据集均可从可靠的存储库中公开获取。MMR相关基因的eQTL数据和胃癌的GWAS数据来自IEU OpenGWAS项目网站（https://gwas.mrcieu.ac.uk/）。STAD的病理图像从TCGA数据库（https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）下载。

支持信息详细方法：表S1. 单核苷酸多态性（SNP）信息；表S2. 基因组相关（MR）分析结果；表S3. MSH2基因的亚组分析；表S4. PS（病理分期）的亚组分析；表S5. MR研究中全基因组关联分析（GWAS）数据库的简要信息；表S6. 纳入和排除标准；表S7. TCGA数据库中胃癌患者的基线数据表；表S8. MSH2病理组学模型的评估指标；表S9. 按低/高PS分组的每个临床变量的基线数据表；表S10. PS-临床预测模型与其他预测模型在个别临床变量上的timeAUC值比较；图S1. MR分析框架的流程图；图S2. 用于分析MMR相关基因与胃癌之间因果关联的敏感性分析的留一法图表（A1–A3）、漏斗图（B1–B3）和散点图（C1–C3）。