《Cancer Prevention Research》：Representative examples of p53 and p16 IHC patterns in nonprogressing and p...
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本研究评估了模式化p53/p16免疫组化(IHC)在预测口腔上皮不典型增生(OED)向口腔鳞状细胞癌(OSCC)恶性转化中的价值。研究发现，异常的p53（过表达、胞浆或缺失）和p16（胞浆或缺失）染色模式与显著降低的8年无进展生存期(PFS)相关。两者联合检测识别了95%的进展病变，其风险区分能力优于杂合性缺失(LOH)检测。该模式化IHC方法是一种可行、可扩展且临床易于获取的工具，有助于指导高危OED的监测强度和及时干预，从而降低进展风险。
文章内容总结
引言
口腔上皮不典型增生(Oral Epithelial Dysplasia, OED)是口腔鳞状细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma, OSCC)的癌前病变，但其临床病程多变，难以预测。目前的风险评估金标准是基于组织形态学的OED分级，但该标准存在观察者间和观察者内变异，缺乏稳定性和预测能力。因此，需要客观的生物标志物来分层风险并指导临床管理。
杂合性缺失(Loss of Heterozygosity, LOH)是一种经过验证的分子学方法，特别是9p21和17p13等位基因的缺失与OED的进展风险逐步增加相关。然而，LOH检测在技术上要求高、资源密集，尚未在口腔病变的常规诊断实践中普及。相比之下，免疫组化(Immunohistochemistry, IHC)提供了一种实用的替代方案。通过一种新颖的模式化判读框架，异常的p53（过表达、胞浆或完全缺失/阴性）和p16（胞浆或完全缺失/阴性）染色模式分别与TP53和CDKN2A的基因改变密切相关。p53和p16 IHC价格低廉、可重复性好，在大多数病理实验室均可开展。本研究旨在直接比较IHC结果与9p和17p LOH谱，确定双p53/p16 IHC评估是否能作为LOH检测的临床可及性替代方案，用于识别有进展风险的OED。
材料与方法
患者队列
本研究基于一个先前已发表的LOH队列中的患者子集，该队列包含102例低级别OED。最终纳入了来自64名患者的68份活检组织（其中4名患者有第二次活检）进行分析，这些组织有足够的石蜡包埋(FFPE)组织切片用于IHC。数据收集包括年龄、性别、吸烟史、解剖部位、组织学分级以及在初次活检后8年内进展为重度不典型增生/原位癌(HGL)或OSCC的临床结局。
免疫组化
对5 μm FFPE切片进行p53和p16 IHC染色。p53（克隆DO7）和p16（克隆JC2）一抗在室温下孵育，通过基于聚合物的辣根过氧化物酶系统检测并使用DAB显色。
染色表达和模式的评估
染色切片经全玻片扫描数字化后，由两位口腔颌面病理学家在盲法下独立评分。p53表达分为：野生型(WT，散在或片状基底/旁基底)和异常（过表达、完全缺失/阴性或胞浆）。p16表达分为：正常（非均质核和胞浆染色的镶嵌模式）和异常（完全缺失染色，即“阴性”模式，或至少累及下三分之一不典型增生上皮的均质胞浆染色，即“底部”浓染，伴有核染色缺失或微弱）。判读不一致的病例，经联合复核达成共识。
统计分析
基线特征以连续变量的中位数（四分位距，IQR）和分类变量的频数（百分比）总结。进展定义为在初次诊断低级别病变后8年内在同一部位发展为HGL或OSCC。使用Kaplan-Meier曲线估计无进展生存期(Progression-Free Survival, PFS)，并使用对数秩检验比较组间差异。使用Cox比例风险(Cox PH)回归模型评估自变量对PFS的影响。
结果
患者特征
在纳入的64名患者中，中位年龄为57岁，56%为男性，61%有吸烟史，67%的病变位于舌和口底。进展者在初次活检后中位2年内发展为HGL或OSCC，而非进展者至少8年无病。
p53 IHC结果
在每例患者的初始活检中，观察到12例(19%)存在异常p53染色，包括6例过表达和6例完全缺失（阴性模式）。在22名进展患者中，9名(41%)表现出异常p53染色，而非进展患者中仅有3名(7%)。p53异常IHC预测进展的性能为：敏感性44%，特异性93%，总准确率74%。与p53 WT患者相比，p53异常患者的PFS显著缩短（8年PFS，25% vs. 74%；对数秩检验P= 0.0011）。
p16 IHC结果
观察到36例(56%)存在异常p16染色，最常见为完全缺失(32/36; 89%)，4例(11%)显示异常胞浆染色。在22名进展患者中，21名(95%)表现出异常p16染色模式，而非进展患者中为15名(36%)。p16异常IHC预测进展的性能为：敏感性95%，特异性64%，总准确率75%。与p16 WT患者相比，p16异常患者的PFS显著缩短（8年PFS，42% vs. 96%；对数秩检验P< 0.0001）。
p53/p16双重评估
值得注意的是，22名进展患者中的21名(95%)在至少一个标志物上表现出异常模式。当联合考虑p53和p16时，9名(41%)进展患者显示p53和p16均为异常，而非进展患者中仅有3名(7.1%)属于此类。联合p53/p16评估预测进展的敏感性为92.6%，特异性为63.3%，总准确率为75.4%。与p53和p16均为WT的患者相比，仅p16异常或p53和p16均异常的患者PFS显著缩短（8年PFS，42% vs. 96%）。p53/p16双重异常的患者预后最差（8年PFS，25%），比仅p16异常的患者（8年PFS，50%）更甚。
LOH结果
在64例患者中，30例(47%)在9p存在LOH，20例(31%)在17p存在LOH，13例(20%)存在双重缺失(9p/17p LOH)。比较进展和非进展病例，在9p、17p或两处同时存在LOH方面无显著差异。尽管在9p、17p或两处同时存在LOH的患者中PFS有缩短的趋势，但差异无统计学意义。
LOH与IHC的一致性
Cohen’s κ系数显示p53 IHC与17p状态之间存在轻度一致性（κ= 0.21），p16 IHC与9p状态之间存在中度一致性（κ= 0.39）。在多变量Cox PH分析中，p16异常IHC和p53异常IHC成为8年PFS的强独立预测因子，风险比(HR)分别为8.93和1.96。
连续活检的时间分析
对4名有二次活检的患者的分析为分子改变的序列提供了见解。在基线时，四分之三的病例表现出异常p16 IHC，其中三例也显示9p LOH。在后续活检中，三名患者获得了异常p53染色，其中两名还出现了17p LOH。一名患者在初始活检时p16为WT，但在随访中出现了完全的p16缺失。唯一保留p53 WT染色的患者在二次活检后到进展的间隔时间（3.2年）比那些出现p53异常的患者（1.0-2.4年）稍长。这些观察结果支持了一个模型，即p16缺失或9p LOH是早期事件，随后在进展过程中获得p53异常和17p LOH。
讨论
本研究评估了模式化p53和p16 IHC在OED风险分层中的潜力。与LOH检测相比，这种IHC方法需要的组织量更少，技术要求更低，为风险评估提供了一种经济有效且易于获取的替代方案。
p53异常模式显示出高特异性，是晚期进展的标志。p16异常模式则具有高敏感性，可用于早期风险检测。两者的生物学特性互补，确保高危OED不太可能被漏检。时间分析支持了OED恶性进展的序贯模型：p16/9p改变是早期事件，允许细胞周期失调和克隆扩增；而p53/17p改变是后期事件，促进基因组不稳定和侵袭性转化。值得注意的是，所有p53异常的OED也都显示出异常的p16染色模式，而一部分p16异常/p53 WT的病变也发生了进展，这表明p16失活可以驱动另一条转化途径。同时具有p16和p53异常模式的病变预后最差，46%在3年内进展。
LOH反映的是特定染色体位点的等位基因丢失，而IHC捕获的是这些基因功能改变（如蛋白质表达异常）的后果。两者之间存在中度至轻度的一致性，表明IHC和LOH检测了相关但不同的分子破坏。特别是p53 IHC模式与TP53突变高度相关，这突显了其作为预后生物标志物的实用性。同样，异常的p16染色模式（胞浆或阴性）与CDKN2A的遗传改变相关，在非HPV相关的口腔病变中具有预测价值。
本研究的优势在于对同一队列进行了配对的IHC和LOH分析。然而，其局限性在于回顾性设计以及来源于原始LOH研究的较小规模子集，这可能降低了统计效能。这些发现需要在更大规模的独立队列中进行验证。
结论
总之，本研究强调了基于模式的p53/p16 IHC作为预测OED恶性转化的强大、临床可及的工具的潜力。它能有效识别高危病变，特别是短期（如3年内）进展风险高的病变。这种方法可以作为技术更复杂、资源更密集的LOH检测的可行替代方案，有望改善OED的风险分层、监测策略和及时的临床干预，从而降低口腔癌的发病风险。未来的大规模前瞻性研究将有助于确定其临床实用性和推广价值。
