基于锥形孔技术的MEMS电化学振动传感器的线性度改进 姜洪民， 张宏浩， 赵文朗， 卢玉兰， 陈德勇， 王俊波

《Micromachines》：Linearity Improvement of MEMS Electrochemical Vibration Sensors Based on Tapered-Hole Technology Hongmin Jiang, Honghao Zhang, Wenlang Zhao, Yulan Lu, Deyong Chen and Junbo Wang

　　摘要：虽然传统的2D体外模型已被广泛用于药物筛选，但由于3D组织培养系统在模拟体内肿瘤微环境方面的优越能力，它们正逐渐受到关注。在本研究中，我们使用了Microtissues?这一经过验证的、无支架的高通量3D组织培养平台，作为微尺度组织工程模型的基础，以研究药物吸收和转运动力学。尽管这些3D构建在生理学上具有相关性，但在分析上仍存在挑战，尤其是在量化微环境中的微量药物水平时。我们开发并验证了一种综合实验流程，结合了优化的液-液萃取和蛋白质沉淀技术以及LC-MS/MS分析方法，能够使用少量样本量准确测量Microtissues?模具中的紫杉醇吸收情况。该检测方法达到了0.03 μM的定量下限，具有稳健的线性（R2 ≥ 0.90；最佳运行性能 > 0.99）和精度（CV ≤ 10%）。这种微工程化的体外系统能够精确表征MCF7乳腺癌Microtissues?中的药物-组织相互作用，从而实现从体外到体内的外推（IVIVE），这对于治疗优化具有重要意义。该平台的可扩展性和模块化特性支持其在精准医疗中的应用，其中患者来源的微组织可以指导个性化治疗决策。

1. 引言
三维（3D）微组织和球形模型已成为研究癌症生物学、治疗反应和药物转运现象的强大微生理系统[1,2,3,4]。与传统的2D单层培养相比，3D微组织更好地再现了肿瘤微环境的结构和生化特征，包括细胞-细胞接触、细胞外基质（ECM）成分、氧梯度以及空间异质性代谢[5,6,7]。这些特征影响药物的渗透、保留和效力，使得微工程化平台在化疗药物的临床前评估中变得越来越重要[3,8]。
特别是乳腺癌，仍然是全球主要的健康问题，并且是女性癌症相关死亡的第二大原因[9]。它每年约占新诊断癌症病例的30%，这突显了需要更具有预测性的临床前测试模型[9,10]。虽然2D模型在癌症研究中发挥了基础性作用，但它们无法反映体内的肿瘤复杂性，因此人们转向了3D系统[1,11,12]。补充表S1概述了2D和3D培养平台之间的关键差异[12,13,14]。紫杉醇（PTX）是一种广泛使用的抗癌药物，由于其高疏水性、广泛的蛋白质结合能力、低水溶性和对细胞内结构的强亲和力，表现出复杂的转运行为[15,16,17]。因此，培养基中的名义药物浓度往往不能准确反映实际的细胞内暴露情况，尤其是在3D培养系统中，扩散屏障和隔离现象被放大[3,18,19]。因此，量化药物在3D结构中的分配、积累和扩散过程对于解释细胞毒性数据、制定基准剂量以及从体外到体内的外推（IVIVE）至关重要[6,20,21]。
Microtissues?是一种无支架的自组装3D培养系统，能够可重复地形成微生理组织结构，为研究药物转运、细胞活力以及从体外到体内的外推提供了工程化的环境。尽管3D培养模型已广泛用于药物筛选，但直接测量Microtissues?中药物吸收的标准化方法仍然缺乏[3,6,8,22,23]。大多数研究依赖于终点活力测定（例如ATP或活死染色），这些方法只能报告表型结果，而不能提供实际的药代动力学暴露数据[7,24,25]。这种脱节导致人们不确定观察到的生物学效应是由于药物效力的真实差异还是由于微环境依赖的转运限制[11,13,21,26]。补充表S2将Microtissues?与其他常用的3D培养平台进行了比较，强调了需要能够解决这些功能差异的分析工具。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）是一种灵敏且特异的技术，能够定量复杂生物基质中的低浓度药物[27,28,29,30,31,32,33,34]。尽管LC-MS/MS在临床药理学和血浆代谢物分析中得到广泛应用，但它与工程化3D体外平台的结合仍然有限[14,28]。将LC-MS/MS与计算建模相结合，为表征3D组织中的药物扩散、积累和空间梯度提供了强大的工具包[25]。这些综合方法对于开发预测性和可重复性的药物转运研究微工程化系统至关重要[5,10,35]。
在本研究中，我们提出了一个基于LC-MS/MS的分析框架，结合了工程化的3D Microtissues?和计算建模，以定量评估微尺度体外系统中的药物吸收、保留和时间依赖性转运。在0.05 μM至5 μM的浓度范围内，评估了PTX在24小时和延长至60小时暴露期间的吸收情况，细胞内药物水平通过优化的基于萃取的LC-MS/MS工作流程直接量化。此外，还采用了有限元扩散-反应模型来提供样本制备过程中的转运和分配行为的机制背景，以支持实验结果的解释。

我们的研究结果表明：
- 3D微组织产生了由平台特异性吸收和扩散效应引起的微环境依赖性药物浓度梯度；
- 培养基中的名义剂量不能可靠地反映3D微组织系统中的真实细胞内药物暴露情况；
- 细胞内药物积累对暴露时间和应用浓度表现出非线性依赖性；
- 定量药物测量对于支持工程化微组织平台中的可靠从体外到体内的外推（IVIVE）至关重要。

综上所述，这些结果建立了一个稳健的定量框架，用于基于生物制造的微组织的药物转运分析，提高了3D癌症药物筛选测定的可解释性和预测能力。

2. 实验部分
2.1. 化学品和试剂
所有使用的溶剂均为LC-MS级，由Baker-Analyzed（Radnor, PA, USA）提供，纯度大于99.9%（从VWR, Radnor, PA, USA购买），包括用于制备校准品和操作LC-MS/MS的水、乙腈和DMSO。试剂级甲酸（96%纯度）由Fisher Scientific（Waltham, MA, USA）提供。紫杉醇（PTX）（10 mM溶于DMSO）由AdooQ Bioscience（Irvine, CA, USA）提供，多西他赛（DOC）（10 mM溶于DMSO）由MedChem Express（Monmouth Junction, NJ, USA）提供。Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、青霉素/链霉素、1× PBS和胎牛血清由Gibco-Manufactured（Waltham, MA, USA）生产，并从ThermoFisher Scientific（Waltham, MA, USA）购买。细胞培养级琼脂糖由Sigma Aldrich（St. Louis, MO, USA）提供，微组织模具由Microtissues Inc.（Providence, RI, USA）提供。

2.2. 细胞培养条件
Microtissues?使用2%琼脂糖溶液（在1× PBS中）在可重复使用的24–96个小球形微模具中制备，并在所有实验前至少用不含血清的DMEM（添加L-谷氨酰胺、酚红和丙酮酸钠）平衡24小时。人上皮MCF7乳腺癌细胞来自American Tissue Culture Collection（ATCC, Rockville, MD, USA），并在添加10% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM中培养，培养条件为5% CO2和37 °C。细胞使用标准Trypsin方案扩增（P8-10）：首先用Versene溶液洗涤一次，然后用1× PBS洗涤三次，再用含酚红的PBS中的0.05% trypsin处理5分钟；之后用含血清的培养基中和并在125 g下离心5分钟，再进行重悬和计数。每个孔中的细胞数量不超过120万个，每个球形模具中接种500个细胞，即每个孔4.8 ×10^4个细胞，PTX暴露前每天更换培养基。PTX溶液使用添加了10% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM（以下简称Complete Media）制备，浓度各不相同（如研究中所述）。所有对照样本的DMSO浓度均低于0.05%，以确保样本间的一致性。

2.3. 药物处理方案和空微组织研究
与球形组织培养同时进行，Microtissues?也被制备并接种，并经过上述相同的平衡过程。平衡后，这些Microtissues?不接种细胞，而是暴露于PTX溶液中6小时、12小时、24小时和60小时。用于处理空Microtissues?的相同药物溶液也被放置在相同的培养孔中，并与空Microtissues?样本一起进行分析。此外，每次都用LC-MS/MS分析所有制备的药物溶液，以确定每次实验的真实起始浓度，以便后续数据标准化。

2.4. LC-MS/MS条件和参数
PTX和DOC（作为内标）在HPLC级乙腈中稀释250倍后直接注入MS，以量化母体质量和定量片段质量。注入过程使用Harvard装置，流速为30 μL/min。所有化合物的过渡数据以及入口电压（EV）、碰撞细胞能量（CC）和碰撞细胞透镜2（CCL2）值均通过多重反应监测（MRM）优化获得。完成MRM优化后，还优化了雾化器气体压力、源温度、HSID（热表面诱导脱溶）温度和干燥气体压力，以获得分析物和内标的最佳相对强度。在检测到Q1和Q3质量后，重新优化EV、CC和CCL2值，以获得分析物定量剂、定性和内标的最佳信号，如表1a,b所示。探头位置也进行了调整，以获得最佳信号强度和灵敏度。使用的系统是QSight 220 CR三重四极杆质谱仪，配备LX50 HPLC前端（Revvity Inc., Waltham, MA），采用正离子模式的电子喷雾注射（ESI）源。优化的MS参数包括雾化器压力80 psi、电喷雾电压5850伏特和源温度425 °C。干燥气体设置为60 °C，HSID设置为220 °C。使用的柱子是Agilent Zorbax RRHD C-18柱（1.8 μm，2.1 × 50 mm），流动相A为含0.1%甲酸的水，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈。最终的LC梯度设计旨在实现高灵敏度和低流速（0.4 mL/min线性流速），每个样本的运行时间为3分钟（表1a,b）。

表1. (a) QSight上PTX和DOC（IS）的优化MS参数；(b) PTX和DOC的LC梯度流动设计。样品托盘架保持在4 °C。自动进样针在每次注射之间进行弱-强-弱溶剂洗涤循环，弱溶剂为70:30 = 水:乙腈溶液，强溶剂为100% HPLC乙腈，体积均为250 μL。

2.5. 校准品、质量控制品和萃取溶剂的制备
储备PTX（10 mM）通过两步稀释过程制备成6点线性系列和质量控制品（QC—低；QC—高），在Complete Media中（如上所述）。简要来说，将15 mL Complete Media分装到单独的玻璃小瓶中，并向每个小瓶中加入稀释后的PTX溶液，在室温下搅拌约15分钟，然后在4 °C下过夜摇匀。所有工作体积均大于10 μL，以避免小体积移液误差，所有校准品、质量控制品和L0（仅含DMSO的Complete Media）的DMSO体积均进行标准化。萃取溶剂的设计旨在实现最佳的层分离和PTX吸附，并保持适合柱子的pH值。最终的萃取溶剂由酸化乙腈（冰冻使用）（0.1%甲酸）和稀释10,000倍的DOC组成，在室温下搅拌至少30分钟。

整个研究共进行了四次线性系列的制备，每个系列在使用前均单独进行批量量化。此外，所有批量生产的校准品均分装到2 mL微量离心管中（每次实验每个水平200 μL），并在?20 °C下储存。用于冻融分析的样品储存在较大体积（1600 μL）中，用于稳定性分析的样品在不同温度条件下单独储存。

2.6. 样品制备
样品制备分为几个阶段进行。最终方案使用了液-液分离技术，将Complete Media和萃取溶剂按1:2的比例混合，涡旋混合后，在0 °C下以4600 rpm离心10分钟。最终收集的上清液来自顶层，小心避免DMSO的微分配，该DMSO将酚红和FBS血清蛋白与PTX和有机溶剂分离。最终提取物被放置到Thermo Fisher公司的2毫升螺旋盖自动采样小瓶中，以供分析使用。2.7. COMSOL Multiphysics建模在COMSOL Multiphysics?（版本6.0）中开发了一个时变有限元模型，使用“稀释物种传输”物理接口来模拟PTX在三相液-液萃取系统中的分配过程。目的是评估PTX从完整介质（水相，底层介质）通过中间DMSO界面进入有机萃取溶剂（上层）的传输行为，整个过程持续10分钟，包括混合和相分离阶段，这对于优化样品制备工作流程至关重要。2.7.1. 模型几何结构和相结构模拟域被构建为一个三层垂直堆叠结构，代表：底层：含有初始PTX（10 μM）的完整介质；中间层：DMSO界面区域（厚度约为1毫米）；上层：有机萃取溶剂。每个相都被建模为一个独立的域，并根据实验测量结果定义了相应的厚度，除了DMSO层。在实验过程中，DMSO层被视作无限薄。模拟域是三维的，采用轴对称几何形状以提高计算效率，网格尺寸设置为“细”。2.7.2. 初始条件和边界条件初始条件：PTX最初仅限于完整介质层，浓度为10 μM；在t = 0时，假设DMSO和溶剂层中不含药物。界面条件：通过通量的连续性来模拟PTX在DMSO层中的分配过程，界面处不施加任何阻力。外部边界：顶部和侧壁被设定为绝缘状态（无通量），而重力驱动的分离过程没有在模型中明确体现（仅考虑静态层）。2.7.3. 时变模拟模型运行时间为10分钟（600秒），使用自适应时间步进的隐式求解器。在特定时间点（t = 0、1和10分钟）生成输出结果，以匹配实验中的混合和分离时间尺度。结果展示了PTX从水相通过DMSO界面区域逐渐迁移到有机溶剂中的过程。该模型直观地展示了浓度梯度变化和传输通量，支持了界面介导的PTX在萃取相中富集的机制假设。2.8. 与免疫测定的验证为了评估细胞活力，使用了Thermo Fisher公司的哺乳动物细胞活死细胞毒性试剂盒。该试剂盒包含4 mM的Calcein-AM（用于检测细胞活力）和2 mM的ethidium homodimer-1（用于检测细胞死亡）。含有MCF7球体的组织在无血清培养基中清洗三次，每次清洗之间间隔十分钟。清洗完成后，根据3D球体的特性调整并优化了制造商的实验方案，用于后续的检测。使用Zeiss Axio Observer Z1（ZEISS，德国奥伯科亨）显微镜连接Xcite（美国匹兹堡）荧光灯（系列120 Q）对样品进行成像。对照组使用完整介质进行活细胞染色，使用70%乙醇进行死细胞染色，实验组的EGFP（绿色）和dsRed（死细胞）通道信号强度均以对照组为基准进行归一化。2.9. 实验设计（DoE）和数据分析在整个研究中，使用JMP Pro 16软件进行了实验设计（DoE），以优化在不同条件下需要测试的样本数量（α = 0.05），包括每轮药物暴露的样本数量、用于检测验证的样本数量等。所有LC-MS/MS数据均使用Simplicity 3Q（版本3.0）软件进行收集和分析。数据进一步使用Microsoft Excel（2024）、JMP Pro 16和GraphPad Prism（版本9.0.2）进行可视化和统计分析。3. 结果与讨论3.1. 检测方法的开发与微尺度药物传输量化在开始细胞培养实验之前，需要开发并优化一种液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测方法，以实现从细胞培养上清液中准确且可重复地定量PTX。方法开发首先从评估流动相组成开始。在两次独立试验中，使用含0.1%甲酸的HPLC级水作为流动相A，同时测试了两种候选流动相B：含0.1%甲酸的乙腈和含0.1%甲酸的甲醇。乙腈始终产生更强的信号强度和更清晰的色谱峰，因此被选为后续所有分析的有机改性剂。进一步研究了不同比例的有机溶剂（5%至95%的乙腈或甲醇）对PTX的影响，以确定实现高信号质量和峰分辨率的最佳比例。2:1的乙腈:水混合物产生了稳健、可重复的钟形色谱图，且不会影响峰强度。为了实现内部标准化，评估了DOC作为内标（IS）在不同浓度下的效果。选择在酸化乙腈中的0.001 nM DOC作为最佳工作浓度，以最小化背景噪声并消除假阳性峰。文献也支持使用酸化乙腈的选择，因为PTX在碱性和甲醇环境中不稳定[36,37]，特别是在萃取和温度依赖性的离心步骤中。最终方法产生了清晰的、无干扰的色谱图，如图1所示，图中展示了空白基质（仅含IS的介质）和最低校准水平（L1）的代表性色谱图。图1. LC–MS/MS分析的代表性色谱图。（上）仅含内标（DOC）的空白介质（L0）未检测到PTX峰，证实了方法的特异性。如预期，观察到了明显的DOC峰。（下）最低校准水平（L1；0.03 μM PTX）显示了与DOC内标相邻的清晰且可量化的PTX峰，证实了在低浓度下的灵敏度和线性。3.2. 分配行为与界面传输的计算建模萃取方法基于描述PTX在各种溶剂中溶解特性的现有文献以及温度和pH对其稳定性的影响[16,17,38,39]进行设计。在此系统中，PTX最初溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，然后引入由完整介质（水相）和有机溶剂（萃取相）组成的双相萃取系统中。虽然最初没有将DMSO视为一个独立的相，但离心后观察到了明显的界面层，这促使进一步研究。为了模拟分配行为，使用方程（1）计算了初始的两相分配系数（????），其中[??]1和[??]2分别代表有机相和水相中的PTX浓度[40]：????=[??]1[??]2（1）这个简化模型假设了两相之间的直接分配。然而，由于DMSO层的存在（通过其明显的分离和酚红染色可以证明），需要采用更精细的、基于热力学的建模方法。随后实施了三相模型，将DMSO界面层作为PTX从水相转移到有机溶剂中的媒介。根据界面热力学原理，使用方程（2）描述了PTX在界面上的迁移过程，假设PTX在萃取溶剂界面和DMSO表面的化学势相等[41]：??=e?x?p?[???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????]?ˉ??（2），其中???????表示各相的液-气表面张力；????是玻尔兹曼常数；??是绝对温度（以开尔文为单位）；ˉ??是每个分子的表面积，假设在各相中大致相等。该方程表明，由于表面能差异，PTX倾向于在DMSO界面积累，从而促进其最终转移到有机相中。这种机制理解被纳入了使用COMSOL Multiphysics（“稀释物种传输”模块）的时变有限元模型中。模拟结果如图2所示，可视化了PTX在三个层之间的传输过程，并捕捉了10分钟萃取期间的药物迁移动态。图2. 三相系统中PTX分配的有限元模拟，包括完整介质（水相，底部）、DMSO界面层（中间）和有机萃取溶剂（顶部）。模拟使用COMSOL Multiphysics（“稀释物种传输”模块）进行，以可视化时间依赖性的药物迁移和浓度通量。（a）在T = 0分钟时，混合前，PTX主要位于水相中。（b）在T = 1分钟时，混合促使PTX分子向上层萃取相迁移。（c）在T = 10分钟时，观察到DMSO层中存在明显的浓度梯度，矢量箭头指示净通量主要朝向有机溶剂。该模型反映了包括混合和分离在内的整个系统行为，直至T = 10分钟时溶剂层分离。这种建模方法强调了微尺度萃取系统中的界面行为如何显著影响分析物的回收和定量。这里提出的计算模型旨在作为萃取和分配过程中药物传输的机制性和说明性表示，而不是一个完全参数化的或预测性的传输模型。由于实验约束参数有限，多种扩散、分配和界面传输系数的组合都可能产生类似的时间行为。因此，该模型并未用于推断唯一的传输参数或定量拟合实验浓度-时间数据。所有关于药物吸收和摄取的定量结论均基于直接的LC-MS/MS测量结果。正式的灵敏度或可识别性分析超出了本研究的范围。3.3. 高通量MPS应用的分析验证为了支持在工程化微尺度组织系统中的定量药物传输分析，在完整介质中准备了线性系列，以便准确测量PTX的吸收范围。理论校准范围覆盖了每次分析的0.02 μM至15 μM。然而，在多次运行后，通过基质加标和验证，确定0.03 μM（L1）为满足预定义的准确性和精度标准的最低浓度，因此被确立为量化的下限（LLOQ）。为了确保稳健性和可重复性，线性系列在四次独立迭代中进行了制造和验证。所有迭代在验证指标上表现出相似的性能；因此，这里报告了代表性迭代的数据，并用于所有后续实验。测量浓度、检测精度（%CV）和准确度总结在表2中。表2. （a）定量指标；（b）定性指标。PTX校准品的平均浓度、标准偏差、%CV和%准确度（每个水平n = 3次，每次运行；总运行次数 = 6次）。报告的校准系列包括六个浓度水平：L1 = 0.03 μM、L2 = 0.2 μM、L3 = 2.9 μM、L4 = 6.8 μM、L5 = 8.9 μM和L6 = 13.6 μM。该系列用于所有验证分析和下游定量（图3）。使用多次分析运行中生成的决定系数（R2）评估了检测的线性（n = 3次注射每个水平；每个线性系列6次运行）。检测在多次分析运行中表现出稳健的线性（R2 ≥ 0.90），最佳运行的性能超过R2 = 0.99。图3. 校准曲线和检测线性验证。（左）一个线性系列运行的PTX代表性标准曲线，显示出R2 = 0.985的强线性。（右）使用相同线性系列对三个独立运行中每个校准水平测量的平均PTX浓度，展示了在整个动态范围内的可重复性和精度。检测精度使用百分比变异系数（%CV）进行评估，单个、批次内和批次间的测量接受标准为≤20%。所有测试的迭代都满足精度和准确度要求，证实了其在微生理系统中的高通量定量测量的适用性。这种分析验证水平对于微尺度药物传输研究至关重要，因为在时间、剂量和实验批次方面的可靠定量是实现有意义的IVIVE的基础。3.4. 在重复使用和储存条件下的检测完整性验证为了确保检测方法适用于高通量微生理药物筛选平台，我们评估了在典型实验条件下的潜在携带效应和校准品的稳定性，类似于我们之前的研究[42,43]中报告的。通过在高浓度标准品（L6）注射后立即重复注射最低校准标准品（L1）三次来评估携带效应，中间不加入任何空白运行。该程序重复了七组三次，结果与两个空白样本后的基线L1注射进行了比较。如图4a所示，未观察到显著异常值，携带效应保持在±20%的阈值内，符合高灵敏度LC–MS/MS工作流的接受标准。图4. 检测携带效应和校准品稳定性评估。（a）在高浓度（L6）注射后对最低校准水平（L1）的携带效应分析，显示了六重组（每组n = 3次；每次样本三次注射）的分布情况。未观察到显著的残留效应，所有值均在基线的±20%范围内。(b) 在8天的稳定性研究中，所有校准剂水平的标准化PTX浓度（定量MRM）。校准剂在-20°C下储存，并在+4°C下进行应力处理，然后每个水平重复测量两次（n = 2），每次注射三次。除了L5水平外，所有水平都保持稳定，L5水平显示出统计学上的显著偏差。虽然已知PTX在某些体外条件下会降解[17,38]，但其在水基校准基质中的长期稳定性（特别是对于重复的LC–MS/MS分析）仍然是一个关键考虑因素。为了研究这一点，制备了重复的校准标准品并在-20°C下储存，在+4°C下施加温度应力，持续8天。每隔2天取一次样，每次测量三次，并对每个时间点的数据进行平均处理。数据根据第0天的（D = 0）值进行了标准化，并使用配对的学生t检验来评估信号漂移的统计显著性。定量MRM的结果显示在图4b中（定量剂显示出相同的趋势）。除了校准剂L5外，所有水平在8天的研究期间都保持稳定。值得注意的是，L2、L3和L6水平在D = 4时显示出统计学上的显著降低（p < 0.05），但仍保持在可接受的性能阈值内。这些发现表明，在-20°C下储存的水基校准剂在长达11天的时间内足够稳定，可以可靠地用于重复或延迟分析微尺度实验样本。

3.5. 3D Microtissues?的药物吸收
在优化和验证检测方法后，评估了无支架3D Microtissues?模具在不同处理浓度和时间点下的PTX吸收情况。实验方案详细记录在方法部分，并在图5中进行了可视化总结。图5. 实验工作流程的示意图，包括微组织铸造、药物处理协议以及处理后的样品收集和LC-MS/MS分析的相分离。该过程展示了无支架3D培养设置、PTX暴露以及上清液的提取和定量。在所有处理组中，都观察到了显著的分析物吸收。具体来说，对于低于1 μM的PTX剂量，大约50%的初始药物在最初的24小时内被Microtissues?吸收。在≥1 μM的浓度下，即使在连续暴露60小时后，吸收也稳定在25%到30%之间，如图6a所示。相比之下，没有模具的对照孔显示几乎没有药物损失，这证实了观察到的耗尽是由于微组织吸收造成的。在这项研究中，药物吸收是通过测量培养基中紫杉醇的净耗尽来量化的，而无模具的对照孔在相同条件下也显示几乎没有药物损失。虽然这种方法能够稳健地捕捉到平台介导的暴露损失，但它没有提供介质、凝胶、细胞和塑料组分之间的封闭质量平衡。直接测量模具或凝胶相中保留的药物将进一步完善机制解释，但这超出了本研究的范围。图6. Microtissues?模具对PTX吸收的定量分析。(a) 0.5 μM和5 μM处理组随时间的PTX吸收趋势，显示了两个监测的MRM。数据代表每组n = 12个微组织模具。(b) 在所有处理条件下多个时间点测量的平均细胞内PTX浓度（n = 每个时间点12个），显示出药物吸收随时间的统计学显著差异。数据使用Tukey–Kramer HSD事后检验进行分析。* p < 0.05, ** p < 0.01, **** p < 0.0001。每个条件在四个独立实验中重复四次。对于每个浓度和时间点，Microtissues?准备了三次，每个上清液样本在技术上重复三次（每组n = 12）。这种重复水平使得跨时间和剂量的统计比较成为可能。使用Tukey–Kramer HSD事后分析评估了药物吸收的时间依赖性差异。如图6b所示，所有处理组在随时间吸收的PTX方面都显示出统计学上的显著差异（p < 0.05），突显了即使在无支架3D培养中，分析物吸收的动态性质。值得注意的是，即使是在短暴露期间，也相对于初始处理浓度出现了显著的药物耗尽。这些结果强调了微生理药物筛选平台的一个关键考虑因素：假设的给药浓度不一定反映组织实际经历的暴露量。这种差异引入了药效学解释和IVIVE模型中的潜在误差来源。此外，分析物吸收的程度可能因化合物而异，受分子大小、亲脂性和与水凝胶基微结构的相互作用等因素的影响。例如，Tamoxifen是一种基于激素的抗癌剂，其物理化学性质与PTX不同，即使在相同制备的Microtissues?模具中也可能表现出不同的吸收行为。这些发现强调了作为临床前IVIVE工作流程一部分的平台特异性和分子特异性吸收分析的重要性[44]。虽然本研究以PTX作为代表性的疏水性化疗药物和MCF-7乳腺癌微组织为例，但药物吸收行为预计会随着分子性质（如极性、电荷、溶解度和蛋白质结合）以及平台组成和几何形状的不同而显著变化。亲水性或带电化合物在同一微组织系统内可能表现出明显不同的传输和保留特性。因此，本研究并不旨在概括所有药物或平台的吸收行为，而是建立一个基于LC-MS/MS的分析框架，用于定量表征工程化3D培养系统中的平台特异性药物暴露。

3.6. 基于细胞微组织构建的功能验证
为了功能验证从无细胞Microtissue?模具获得的药代动力学吸收数据，我们将分析扩展到了接种了细胞的构建体。将MCF-7乳腺癌细胞接种到Microtissue?模具中，并允许它们在PTX暴露前自组装成3D球体，持续24小时。这个实验与无细胞模具同时进行，以考虑模具特定的药物吸收。使用活死荧光测定法评估细胞活力，同时通过LC–MS/MS量化细胞内PTX浓度。正如预期的那样，实际的细胞内药物水平与名义介质浓度有显著差异，特别是在较高处理剂量下。活死测定结果证实了这种差异：较低的名义浓度（0.05–0.5 μM）产生了主要是活性的球体（绿色荧光），而较高的浓度（5 μM）则导致了大量的细胞死亡（红色荧光），如图7所示。图7. 用活死测定试剂染色的MCF-7球体的代表性荧光图像。活细胞显示为绿色（FITC通道），死细胞显示为红色（TRITC通道）。图像对应于理论处理浓度和实际细胞内浓度（经过模具吸收调整）。在0.05 μM和0.5 μM组中观察到细胞活力增加，这与低于1 μM浓度时较低的PTX吸收和细胞内暴露一致。重要的是，如果未考虑Microtissue?平台的药物吸收，这些细胞毒性结果可能会被误解，根据给药策略可能会高估或低估药物效果。这突显了传统2D测定或无支架3D系统的关键局限性，因为在这些系统中很少量化真实的分析物暴露量。通过将功能性活力成像与定量LC–MS/MS测量相结合，我们展示了将药代动力学与生物反应相结合的工程化微生理平台的实用性。这种双重验证方法增强了体外测定的可解释性，并支持了对体内行为的改进外推。

3.7. 转化相关性和微生理系统对齐
本研究提出了一个定量的、微尺度分析框架，用于药物传输分析，该框架整合了：
- 工程级别的无支架3D Microtissues?构建体；
- 基于LC-MS/MS的药物定量；
- 界面和提取相传输的有限元建模；
- 使用活死测定法的功能性细胞毒性验证。
在这个工作流程中，Microtissues?平台作为一个微尺度药物传输评估系统，能够在受控的体外条件下评估药物吸收和保留的时间和剂量依赖性。这种方法与器官芯片和微生理系统（MPS）研究的目标一致，其中准确的IVIVE依赖于在工程化微环境中的药物生物利用度的定量表征。重要的是，这些发现表明，无支架平台并不免受药物吸收效应的影响，在解释药理反应时必须考虑平台特定的药物隔离。通过将直接分子量化与表型反应相结合，该框架推进了对工程化微生理平台的机制性评估，支持了对3D药物筛选数据的改进解释。未来的工作将把这个框架扩展到患者来源的微组织和具有灌注功能的微流控系统，提高其在肿瘤学和毒性评估中的生理相关性和转化实用性。

4. 结论
IVIVE对于将临床前发现转化为具有临床意义的见解至关重要，特别是随着工程化微尺度组织系统越来越多地取代传统的2D培养模型。要实现可靠的IVIVE，需要直接和定量地确定这些平台内的药物暴露量，而不是依赖于名义剂量假设。在这项研究中，我们建立了一个基于LC-MS/MS的分析框架，用于量化无支架3D Microtissues?中的紫杉醇吸收和暴露动态。通过优化的液-液提取和严格验证的质量谱测定，我们证明了平台特定的药物隔离可以显著改变真实的细胞内暴露量，即使在非粘附性水凝胶基构建体中也是如此。补充的计算建模用于支持传输和分配行为的机制解释，但未用于参数推断。这些发现将LC-MS/MS定位为定量表征微生理系统的关键使能技术。将直接分析物测量纳入3D培养工作流程对于准确解释剂量-反应关系和提高下游IVIVE分析的可靠性至关重要。随着生物制造微尺度平台的不断发展，基于严格质谱的药物-组织相互作用的定量量化对于推进预测性药物筛选、转化生物工程和精准肿瘤学研究至关重要。

补充材料
以下支持信息可以在以下链接下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/mi17030332/s1，表S1. 2D和3D细胞培养模型的比较（来自文献[12,13,14]）。表S2. 现有3D细胞培养技术与Microtissues相比的优势和劣势[3,10,18,19]。图S1. 本研究中识别和使用的MS光谱片段。图S2. 完整介质中的PTX在Microtissue模具中的封闭系统，同时平衡介质从模具扩散到周围环境。PTX必须克服模具屏障才能最终到达球体，根据研究时间，还会发生一些介质蒸发。