生物过程放大：一种基于计算流体动力学的甘醇生产琥珀酸的方法 作者：Ioannis Zacharopoulos 和 Constantinos Theodoropoulos

《Processes》：Bioprocess Scale-Up: A Computational Fluid Dynamics Approach for the Bioproduction of Succinic Acid from Glycerol Ioannis Zacharopoulos and Constantinos Theodoropoulos

　　**摘要**
在本研究中，我们展示了利用A. succinogenes从甘油生产琥珀酸的批式厌氧发酵系统的放大过程。该系统已成功从初始的1升生物反应器（实验室规模）放大到100升生物反应器（中试规模）。同时，我们开发了一种混合模型，结合了微生物生长的内在动力学和生物反应器的计算流体动力学（CFD）模型。所提出的模型能够预测在生物过程放大过程中通常观察到的生产力下降现象。在我们的过程中，这是由于系统中气体与液体相之间二氧化碳传质受限所致。该模型成功预测了提高琥珀酸生产力所需的通量。利用该模型，最终琥珀酸产量增加了4.3%，生产力提高了8.5%，而发酵副产物各自减少了约3%。

**1. 引言**
生物过程的重要性日益增加。越来越多的传统化学过程用于生产平台化学品、药品和食品成分正被生物过程所替代。然而，为了使这些生物过程在工业上得到广泛应用，必须提高其效率、生产力和收率，以达到传统化学过程的水平。实现这一目标的一个重要步骤是通过有效的放大方法将其放大到工业（立方米）规模[1]。

生物过程的放大面临一些严重限制，必须解决这些限制才能在工业规模上实现经济可行性。所谓的“生物过程放大效应”包括生物量产率的降低、与小规模发酵相比代谢副产物的增加，以及由于发酵液内部浓度梯度形成而导致的底物限制[2,3,4]。显然，生物过程的生产力和效率在很大程度上取决于两个互补的因素：细胞内活动（基因组和代谢组）和细胞外环境（质量传递和动量传递及剪切应力）[5]。随着过程规模的扩大，细胞外环境和生物反应器流体的重要性变得比细胞内活动更为突出。主要原因是生物反应器内部存在浓度梯度。这些梯度会影响pH值、主要反应代谢物和溶解气体的浓度，从而在反应体积内产生不均匀性[6,7,8]。这些不均匀性可能导致底物过度消耗和副产物过量产生，并降低系统性能[9]。这些不均匀性通常是由于实验室和工业规模在几何结构和操作方式上的差异以及大规模发酵的特性所造成的[6]。

计算流体动力学（CFD）是预测发酵罐内代谢物浓度梯度的有用工具[10]。尽管CFD计算成本较高，但其优势在于能够提供发酵过程中生物反应器内部混合状况和流体运动的详细视图。CFD模拟涉及求解能量、质量和动量的基本守恒方程[11]。在放大研究中使用CFD是可取的，因为它不依赖于通常采用的经验关联，因此计算结果更接近实际情况。CFD考虑了局部生物反应器条件，而不是整体生物反应器情况[8,12]。因此，CFD研究可用于预测气体向液相的质量传递系数[13]。由于生物过程规模的扩大和生物反应器的有效设计对生物过程的可行性至关重要[14]，因此已有大量研究集中在生物反应器内部混合机制的建模、喷射方法及其对气体分布的影响[15]，以及CFD模型与预测微生物生长的模型的耦合，以更准确地表征生物过程。计算流体动力学建模已被有效用于模拟生物反应器内的气体扩散，并计算大规模生物反应器中气体向液相的质量传递系数（kLa）[13,16]。CFD模型还被用来模拟微生物在生物反应器内的不同代谢和生理状态。这种多样性是由于微生物所受到的流体动力压力等多种原因造成的。然后可以将CFD模型与代谢模型结合，以清晰地了解微生物的状态[12,17,18]。在设计生物处理系统时，另一个需要考虑的问题是大规模生物反应器的非均匀性，由于混合不足，会观察到营养物质、气体和pH值的浓度梯度。因此，放大条件与实验室规模系统的条件有很大差异。通过实施CFD模型，可以计算浓度梯度以及生物反应器内细胞的分布，从而更好地设计生物过程的放大[19]。

在甘油生产琥珀酸的生物过程中，气体底物的浓度梯度非常重要，因为A. succinogenes会消耗二氧化碳，其可用性会影响最终产品的产量[20,21]。A. succinogenes是天然的琥珀酸生产菌，它已被适应在甘油上生长，可实现高达1.28 ????????/???????的琥珀酸产量[22]。此外，关于该微生物代谢的研究表明，二氧化碳的可用性是影响最终产物（琥珀酸）与不需要的副产物（乙酸和甲酸）比例的主要因素，因为二氧化碳的存在改变了三羧酸（TCA）循环中的碳流动方向，使得琥珀酸成为最终产物[23,24,25]。在这项研究中，我们提出了一种混合建模方法，用于利用A. succinogenes从甘油生产琥珀酸的放大过程，其中溶解气体的浓度是通过CFD方法计算的——具体来说，采用了两相混合模型，这是一种简化的多相模型，用于处理不同速度下相间的流动[26]。由于搅拌速度、生物反应器体积和喷射流速会影响气体向液相的总质量传递[27]，我们从计算和实验两方面研究了它们的影响。由于发酵动力学模型描述的是平均反应器行为，CFD方法旨在提供一个代表性的总体平均溶解二氧化碳浓度，以便与该动力学模型一起使用。最后，为了进一步验证这种方法，模拟结果经过了实验验证。

**2. 材料与方法**
**2.1. 实验设置**
实验中使用的微生物Actinobacillus succinogenes（DSM No. 22257）来自德国微生物与细胞培养物收藏中心（DSMZ）（布伦瑞克，DE）。首先使用30 g/L胰蛋白酶大豆肉汤培养基（TSB）培养48小时以复活细胞培养物。然后将活化后的培养物储存在含有30%甘油的冷冻保存小瓶中，并在-80°C下深冻保存。随后按照Vlysidis等人描述的方法[22]将培养物适应高甘油浓度。发酵使用的是Vlysidis等人[22]描述的半定义培养基。最初的甘油浓度范围为30至60 g/L。培养基在121°C下灭菌15分钟。

**2.2. 分析方法**
细胞浓度通过测量发酵液的光密度（Shimadzu UV mini 1240分光光度计）间接计算。在实验期间定期取2毫升样品，然后用7% HCl溶液稀释以溶解MgCO3，避免干扰测量。之后离心去除生物质。使用高效液相色谱（HPLC）（ThermoScientific Diomex UltiMate 3000）和Aminex HPX-87H 300 mm × 7.8 mm（Bio-Rad）柱同时检测残余甘油和发酵产物。残余甘油通过折射率检测器（ERC RefractoMax 520）检测，发酵产物（琥珀酸、乙酸和甲酸）通过二极管阵列检测器（ThermoScientific Diomex UltiMate 3000 DAD）检测。

**2.3. 生物反应器设计**
实验使用了三种不同的生物反应器：一种Electrolab 351台式反应器，工作体积为1升；一种Electrolab Fermac 310反应器，工作体积为18升，用于10升（半满）和18升体积的实验；以及一台英国Life Sciences Ltd.制造的150升中试规模生物反应器，工作体积为150升。所有反应器都装有挡板，搅拌速度均为600 RPM。在整个发酵过程中，反应器的温度保持在37°C，并通过添加浓缩（10 M）NaOH溶液来维持pH值在6.4。二氧化碳（从BOC gases，英国购买）在整个实验过程中以不同的速率供应。空气通过泵以0.01 vvm的速率持续供应。大多数实验中二氧化碳的流速为0.06 vvm，在最后的100升反应器验证实验中，二氧化碳流速增加到0.22 vvm，总 gas 流量分别为0.07 vvm和0.23 vvm。CFD模拟的边界条件使用了总gas流量。

**2.4. CFD研究**
构建了生物反应器的1:1比例CAD模型，包括反应器的几何结构（挡板、混合涡轮机、喷射器）。计算研究使用ANSYS Fluent（2021 R1）进行。CAD模型用于可视化流体体积，然后导入Fluent中生成用于计算的体积网格（图1A）。
**图1. 中试规模生物反应器的CAD模型：**
(A) 从CAD模型提取的3D流体体积。
(B) 提取的流体体积的2D轴对称简化图。
(C) 2D模型的网格结构。生物反应器有四个挡板，并用带有六个叶片的Rushton涡轮机进行搅拌，叶片均匀分布在盘面上。喷射器位于生物反应器底部，具有四个均匀分布的气体出口。生物反应器的尺寸与CAD模型一致，见表1。

**表1. 中试规模生物反应器尺寸。**
为简化计算和降低成本，使用了反应器的2D渲染图（图1B）。此外，假设轴对称性以最终将2D模型减半。尽管存在挡板和多个Rushton涡轮机局部破坏了轴对称性，但仍然采用了当前的二维轴对称模型来捕捉宏观趋势，并保持计算成本较低，相比于使用完整的三维模型[28,29,30]。网格划分是通过Fluent Meshing软件完成的，采用了三角形网格方法，元素大小为0.005米。这样得到了8448个元素组成的网格，最小正交质量为0.9，偏度为0.44（见图1C）。气体入口孔被设置为速度入口边界，流体顶部被设置为压力出口。流体与固体之间的边界被设置为具有无滑移条件的静止壁。流体单元区域之间的边界被设置为内部壁。对于多相建模，采用了上述提到的混合模型来模拟以不同速度移动的相。为了模拟湍流，使用了带有可伸缩壁函数的标准k-??模型[13,31,32]。对于气泡的模拟，表面张力系数被设定为0.073 N/m[33]。在计算气泡流动产生的相间力时，使用了Grace阻力系数，因为气相的体积分数相对于液相来说相对较小[34,35]。最后，对于气泡相与液体主体之间的二氧化碳传质，采用了带有Hughmark关联式的亨利定律模型[36,37]。在图1B中，叶轮周围的区域被设置为与流体其余部分分开的一个独立区域。叶轮的运动是通过设置该区域的旋转速度来模拟的。流体区域与三个叶轮区域之间的网格接口被设置为匹配的，以便动量可以从叶轮传递到流体的其他部分。用于模拟的材料属性是在ANSYS Fluent数据库中找到的。

**网格灵敏度分析**
还进行了网格大小的灵敏度分析：网格大小从0.5米（60个元素）逐渐增加到0.0005米（137,170个元素）。在图1C和图2C中可以看到不同元素大小的网格，而图3展示了不同网格大小下的二氧化碳摩尔浓度计算结果。图2显示了不同元素大小的CAD模型网格：(A) 0.5米，(B) 0.05米，(C) 0.005米。图3显示了不同网格元素大小下的二氧化碳摩尔浓度：(A) 0.5米，(B) 0.05米，(C) 0.005米，(D) 0.0005米。从图3A和图3B可以看出，对于较大的网格元素（0.5米和0.05米），二氧化碳的浓度梯度形状非常不自然，而后两种情况（图3C和图3D）则较为平滑。图3C（网格大小0.005米）和图3D（网格大小0.0005米）的二氧化碳分布相同，表明二氧化碳浓度曲线与网格大小无关。由于使用0.0005米元素大小的网格划分计算成本更高（比使用小10倍的元素大小多28%），因此选择了0.005米作为元素大小。

**系统建模**
使用了具有压力和速度耦合的稳态求解器，离散化方法选择了二阶迎风格式。迭代次数被设定为3000次，但系统在第一次迭代后就收敛了。前1200次迭代是作为稳态运行的，之后的迭代则作为准瞬态运行。在求解初始化时，采用了一种混合方法。该方法涉及解一个简化的拉普拉斯方程来近似流动和压力场，并得出相应的初始条件，从而加快了整体模拟速度[38]。

**动力学建模**
我们团队之前开发的动力学模型[39]被用来计算底物、主要产物和副产物的浓度剖面。该模型由一组代数方程和常微分方程（DAEs）（方程（2）-（6）组成）。然后使用ode13s Matlab求解器（版本2018a，Mathworks）来求解该DAE系统。该方程组模拟了生物量的增长、底物（甘油）的消耗以及主要发酵产物（琥珀酸）和两种主要副产物（乙酸和甲酸）的生成。首先，使用方程（1）确定A. succinogenes的特定生长率：
$$
\mu = \mu_m a_x \cdot K_l y + K_l y + K_l y + 2K_l y \cdot K_I K_l y \cdot C_0^2 K_C^2 + C_0^2 \cdot (1 - \sigma_A \sigma_A^*) n_{\sigma_A} - \kappa_m a_x \cdot K_l y^0 \cdot K_l y
$$
其中$\mu_m a_x$是最大生物量生长率，$K_l y$是甘油浓度，$CO_2$是二氧化碳浓度，$K_l y$和$K_C^2$是两种底物的饱和常数，$K_I K_l y$是甘油的底物抑制常数，$\sigma_A$是琥珀酸浓度，$\sigma_A^*$是琥珀酸的临界浓度，$n_{\sigma_A}$是琥珀酸抑制的幂项修正系数，$\kappa_m a_x$是最大死亡率系数，$K_l y^0$是初始甘油浓度。生物量的总生长率在方程（2）中表示为：
$$
\dot{X} = \left[ \mu_m a_x \cdot K_l y + K_l y + 2K_l y \cdot K_I K_l y \cdot C_0^2 K_C^2 + C_0^2 \cdot (1 - \sigma_A \sigma_A^*) n_{\sigma_A} - \kappa_m a_x \cdot K_l y^0 \cdot K_l y \right]
$$
由于培养物既利用底物进行生长也用于代谢维持，因此底物的消耗可以与微生物的生长率以及总生物量浓度相关联（方程（3）：
$$
\dot{K_l y} = -\lambda_1 \cdot K_l y \cdot \dot{X}
$$
其中$\lambda_1$分别是甘油消耗与生长和非生长相关的系数。同样的原理也适用于琥珀酸的生成，琥珀酸主要在细胞生长阶段产生，以及由已存在的细菌培养物的代谢过程产生（方程（4）：
$$
\dot{\sigma_A} = \lambda_2 \cdot \dot{X}
$$
最后，主要生物过程副产物乙酸和甲酸的生成与培养物的稳态阶段相关，它们的生成速率与现有的生物量浓度成正比（方程（5）和（6）：
$$
\dot{A}_A = \lambda_3 \cdot X \quad \quad \dot{F}_A = \lambda_4 \cdot X
$$
其中$\lambda_3$和$\lambda_4$分别是乙酸和甲酸生成与非生长相关的系数。该模型之前已经使用从1.8升批实验收集的数据进行了校准和验证。用于模型的计算动力学参数见表2。

**结果**
**1. 小规模实验结果**
进行了一系列小规模实验，以评估工作体积增加对整个生物过程效率的影响。首先在1.8升的工作体积下进行放大实验，然后是10升的工作体积（见图4），最后是18升的工作体积（见图5）。图4显示了在初始甘油浓度为30克/升、 fermentation时间为120小时时的批式发酵浓度曲线：(A) 生物量，(B) 琥珀酸，(C) 甘油，(D) 发酵副产物：甲酸（绿色）和乙酸（橙色）。图5显示了在初始甘油浓度为30克/升、 fermentation时间为73小时时的批式发酵浓度曲线：(A) 生物量，(B) 琥珀酸，(C) 甘油，(D) 发酵副产物：甲酸（绿色）和乙酸（橙色）。在10升的发酵实验中，琥珀酸的最大浓度为31.37 ± 0.24克/升，琥珀酸的产生率为0.26克/升·小时，琥珀酸的产率为1.03克/升·升·甘油分子数。在18升的发酵实验中，琥珀酸的最大浓度为32.02 ± 0.52克/升，琥珀酸的产生率为0.44克/升·小时，琥珀酸的产率为1.05克/升·升·甘油分子数。相比之下，1.8升规模下的发酵实验中琥珀酸的最大浓度为35.31克/升，产生率为0.47克/升·小时，产率为1.21克/升·升·甘油分子数。因此，1.8升规模下的琥珀酸浓度比10升规模高11%，产量比10升高9%，也比18升高6%。此外，1.8升生物反应器的琥珀酸产量比10升生物反应器高15%，比18升生物反应器高13%。

**2. 中试实验和CFD模拟**
使用100升工作体积的中试反应器进行了实验，初始甘油浓度分别为30克/升和60克/升。表3展示了每次发酵运行的产量和产率结果，并与实验室规模（1.8升工作体积）和小规模反应器（10升和18升工作体积）的结果进行了比较。随后对中试规模生物反应器进行了CFD模拟，以计算反应器内部的浓度梯度和混合流体的速度，从而评估混合质量。通过计算底物组分的浓度梯度，可以更容易地评估质量传输现象对发酵的影响。图6A显示了反应器内的二氧化碳浓度。空气和二氧化碳的混合物（0.06体积分数的二氧化碳和0.01体积分数的空气）通过反应器底部的喷雾器插入反应器。反应器底部和中部（最低叶轮下方及其与中间叶轮之间）的二氧化碳浓度较高。如图6B所示，在反应器顶部几乎没有任何二氧化碳。图6B还显示了500转/分钟搅拌速度和0.07体积分数二氧化碳条件下的100升生物反应器的CFD模拟结果：(A) 液相中的二氧化碳摩尔浓度，(B) 液相速度大小。首先研究了反应器内部的流速梯度，以更好地理解湍流环境和混合质量。图6B表明，湍流主要由叶轮产生，空气/二氧化碳混合物的进入对此有一定贡献。叶轮周围和之间的湍流最为强烈，而反应器的中部和底部的湍流最小。这种气体分布和搅拌器速度的模式也与其他搅拌 aerated 系统的研究结果一致[10,40]。为了探索生物反应器规模对溶解二氧化碳浓度的影响，进行了不同生物反应器体积（20升、50升和150升）和相同几何条件（500转/分钟，0.07体积分数二氧化碳）下的CFD模拟。图7显示了每个生物反应器体积的摩尔浓度剖面，图8总结了溶解二氧化碳的浓度（单位：克/升），表明生物反应器的工作体积与溶解二氧化碳浓度之间存在明确的相关性。当液体体积从20升增加到100升时，溶解二氧化碳减少了90.6%，从0.31克/升降至0.029克/升。图7和图8分别显示了不同生物反应器体积下的CFD模拟结果。当100升反应器的CFD模拟达到稳态流速时，计算出的平均二氧化碳浓度为0.029克/升，而实验室规模（10升和18升）的反应器平均二氧化碳浓度约为0.5克/升。搅拌速度为500转/分钟，二氧化碳的体积流量为0.07体积分数。二氧化碳的体积平均浓度是通过Ansys Fluent计算的，然后将其输入到生物过程模型中。这种方法被采用是因为生物过程模型基于Monod动力学，该模型考虑了总体物种浓度。实验结果与模拟结果之间的比较，对于初始甘油浓度为30 g/L和60 g/L的情况，分别可见于图9和图10。很明显，溶解CO2的减少在降低生产力和产量方面起着关键作用。进一步支持不同工作体积系统中CO2减少影响的证据是乙酸浓度的增加（30 g/L系统的乙酸浓度比实验室规模系统高0.18倍，60 g/L系统的乙酸浓度高0.25倍）。从文献中可以发现，琥珀酸与其他代谢物（副产物）的比例会立即受到细胞消耗的CO2量的影响[23,41]。图9显示了在100 L工作体积、初始甘油浓度为30 g/L、转速为500 RPM以及气体流速为0.07 vvm的条件下，批次发酵浓度曲线（点）与模拟结果（虚线）的对比（tfin = 100 h）：(A) 生物量；(B) 琥珀酸；(C) 甘油；(D) 发酵副产物：甲酸（绿色）和乙酸（橙色）。图10显示了在相同条件下的对比结果（tfin = 166 h）。可以看出，该模型能够预测发酵罐内的浓度曲线。尽管模拟曲线略微高估了实际反应器内的浓度，但这在所预料之中，因为使用的是简化的二维模型来进行计算，并且动力学模型假设整个发酵过程中CO2浓度保持不变。

表3展示了实验室规模实验台生物反应器与中试规模生物反应器之间的性能比较。可以看出，对于初始甘油浓度为30 g/L的情况，中试生物反应器的琥珀酸产量（根据实验批处理时间计算）和产量均低于实验室规模生物反应器。其中，产量降低了0.11倍。对于初始甘油浓度为60 g/L的情况，产量降低了0.03倍。在18 L工作体积下进行的实验，琥珀酸产量与相同初始条件下的实验室规模实验相当（分别为0.44 g/L/h和0.47 g/L/h），但琥珀酸产量降低了13%。与中试规模实验相比，18 L生物反应器的产量提高了37.5%，而琥珀酸产量几乎相同。而10 L工作体积的实验台实验则在性能上表现最差。性能下降的一个原因可能是生物反应器的几何结构：实验台生物反应器仅填充到了10 L的容量，可能导致混合不够充分。此外，乙酸和甲酸的最终浓度都有所增加；具体来说，30 g/L发酵条件下，乙酸增加了14%，甲酸增加了23%；60 g/L发酵条件下，乙酸增加了13%，甲酸增加了11%。发酵副产物的增加进一步证明了由于过程放大导致溶解CO2浓度降低，因为低CO2浓度会促进乙酸和甲酸的产生。如果所有底物都能转化为琥珀酸，理论上的最大产量可以达到1.28 ????????/??????????[23,25,42]。

CFD模型被用来评估不同搅拌速度和体积流速对溶解CO2浓度的影响。气体流速从0.07 vvm增加到了0.23 vvm，同时搅拌速度提高到了1000 RPM。然而，随着搅拌速度的提高，溶解CO2的变化并不显著。相比之下，体积流速对溶解CO2的影响更为明显。图11A表明，增加生物反应器内的气体体积流速会提高液体相中的溶解CO2浓度；具体来说，体积流速从0.07 vvm增加到0.23 vvm时，溶解CO2浓度增加了14.7%。另一方面，如图11B所示，虽然搅拌速度提高到1000 RPM（实际上是原来的两倍），但溶解CO2仅增加了2.6%。

基于计算机模拟结果，并为了实验验证图11A的内容，进行了一次发酵实验，使用的气体流速为0.23 vvm（其中CO2流量为0.22 vvm，空气流量为0.01 vvm），相应的溶解CO2浓度为0.04 g/L。发酵结果如图12所示。图12显示了在100 L工作体积、初始甘油浓度为30 g/L、转速为500 RPM以及气体流速为0.23 vvm的条件下，批次发酵浓度曲线（点）与模拟结果（虚线）的对比（tfin = 96 h）：(A) 生物量；(B) 琥珀酸；(C) 甘油；(D) 发酵副产物：甲酸（蓝色）和乙酸（橙色）。生物反应器内溶解CO2浓度的增加导致最终琥珀酸浓度提高了33.7 ± 0.11 g/L，比气体流速为0.07 vvm时的实验提高了4.3%；相应地，琥珀酸产量提高了3.5%，达到1.12 ????????/??????????；琥珀酸生产力提高了8.5%，达到0.35 ????????/??/?。此外，最终乙酸和甲酸的浓度分别降低了3.6%和3%。

结论：本研究成功地在多个尺度上（从实验室规模到100 L的中试规模）通过生化方法从甘油中生产了琥珀酸。CFD模型被有效地用于模拟生物反应器内液相中的CO2浓度，以评估质量传输对系统整体生产力和产量的影响。结合使用稳健的动力学模型和CFD模拟，计算出了改进的发酵条件，这些条件提高了生物反应器内溶解CO2的浓度，从而提高了工艺的生产力和产量，同时也降低了不需要的副产物的浓度。这些结果强调了集成建模方法的重要性，该方法能够显著提高生物过程的效率和可扩展性[43]。通过这种方法，可以成功地缓解发酵放大过程中的负面质量传输效应。