一种新颖的光化学方法，用于通过UV-C激活PAA包覆的Fe?O?纳米粒子，以实现具有自由表面氨基的APTES定向功能化

《Applied Surface Science Advances》：A novel approach to the photochemical UV-C activation of PAA-coated Fe?O? nanoparticles for oriented APTES functionalisation with free surface-amino groups

　　M. Barutiak | A. Zeleňáková | P. Hrubov?ák | L. Nagy | D. Volavka | J. Sz?csová | ?. Fabriciová | A. Anto?ová
斯洛伐克科希策P.J. ?afárik大学理学院物理研究所，Park Angelinum 9，04001

**摘要**
通过热分解方法制备了具有多面体（P1）和立方体（K1）形态的Fe?O?磁性纳米颗粒（MNPs），并涂覆了聚丙烯酸（PAA），同时用有机配体3-(氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）对表面进行了功能化处理。我们采用了一种新的方法将APTES连接到聚丙烯酸上，即通过UV-C（254 nm）光化学激活PAA层。这项工作的创新之处在于利用简单的UV-C光化学方法激活表面羟基，实现了定向的APTES功能化。表面功能化与可控的纳米颗粒形态相结合，旨在提高磁性纳米颗粒对核酸的亲和力，从而促进核酸的有效分离。通过XRD、SEM、ATR-FTIR、XPS和ζ电位分析对结构和表面进行了表征，证实了纳米颗粒表面成功被APTES修饰。SQUID磁强计分析显示了形态依赖的磁响应。多面体Fe?O?纳米颗粒的饱和磁化强度（约90 Am2 kg?1）高于立方体形态的颗粒（约70 Am2 kg?1），这反映了它们在磁各向异性和结构有序性上的差异。两种形态的颗粒均在120 K附近表现出Verwey转变，表明磁铁矿核心具有高结晶度和相纯度。使用SQUID磁强计进行的磁测量显示，在室温下存在多畴行为，这对于磁分离应用至关重要。RNA提取实验表明，尽管缺乏二氧化硅层，P1和K1纳米颗粒的分离效率与商业试剂盒中使用的球形Fe?O?@SiO?颗粒相当。这些发现突显了具有不同形态和配体修饰的Fe?O? MNPs作为下一代核酸分离系统基础的潜力。

**1. 引言**
核壳磁性纳米颗粒（MNPs）是一类快速发展的纳米材料，其独特性质源于其纳米尺度尺寸、较大的表面积与体积比以及与块体材料不同的磁行为。磁核和化学可调壳层的结合使得可以精确控制稳定性、生物相容性和分子相互作用，这些都是分离技术和诊断应用中的关键因素。最近的研究表明，适当的表面修饰可以显著提高MNPs的超热性能、磁响应和吸附行为[1,2]。磁性纳米颗粒已成为分离DNA和RNA等生物分子的有效平台，为传统方法（如电泳或色谱法）提供了有吸引力的替代方案。这些传统方法通常耗时较长、技术要求高且依赖于专用实验室设备[3],[4],[5]。相比之下，磁分离依赖于能够选择性结合目标分子的修饰纳米颗粒，然后可以通过外部磁场快速收集这些颗粒。这种方法快速、易于自动化且不需要复杂设备[6],[7],[8]。尽管取得了显著进展，但仍存在关键挑战，特别是在提高胶体稳定性、减少聚集以及通过合理表面修饰增强选择性方面[9],[10],[11],[12]。尽管先前的研究强调了有机配体在介导MNPs与核酸相互作用中的作用，但关于特定功能基团如何影响分离效率的系统评估仍然有限[13,14]。
在我们之前的研究中，我们发现涂覆了SiO?并用APTES修饰的Fe?O?纳米颗粒（图1）表现出优异的核酸分离效率[15]。这一发现表明，纳米颗粒表面自由且朝外的胺基团的存在是增加活性结合位点密度、从而提高DNA/RNA捕获效率的关键因素。基于这一发现，本研究重点开发了一种新的Fe?O?系统，该系统依次用聚丙烯酸（PAA）和3-(氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）进行了修饰。主要目标是保留一个可以与核酸相互作用的自由–NH?基团。

**图1. 3-(氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）的结构式。**
APTES的功能化是在保持胺基未反应的条件下进行的，以便其与核酸的磷酸骨架进行静电相互作用[15,16]。然而，常用的EDC/NHS偶联策略会激活PAA的羧基，导致–COOH与–NH?之间形成酰胺键[17],[18],[19]。这种机制不可避免地消耗了APTES的伯胺基团，从而：i) 阻止后续的生物偶联；ii) 消除了核酸结合所需的正表面电荷；iii) 促进了不利的配体取向。因此，当需要保留自由胺基团时，EDC/NHS协议不适用。为克服这一限制，我们采用了UV-C（254 nm）光化学激活PAA层的方法。已知UV-C照射会在含有羧基或羟基官能团的聚合物上生成自由基和氧化官能团[20],[21],[22]。这些活性中心随后与水解后的APTES中的硅醇基团反应，形成Si–O–C和Si–O–Si键，同时保持伯胺基团的完整性和朝外取向。除了表面化学改性外，我们还研究了颗粒形态的作用。除了常用的球形结构外，我们还合成了立方体和多面体Fe?O?纳米颗粒，因为文献表明颗粒形状可以显著影响磁性质、表面能和生物分子相互作用[23]。特别是立方体颗粒被认为可以提供更大的接触面积和更高的活性表面位点密度，从而可能提高核酸吸附能力。Fe?O?核心是通过热分解法合成的，这种方法能够制备出高度结晶的纳米颗粒，并且对尺寸和形态有很好的控制[24],[25],[26]。提高结晶度有利于快速磁分离[27]。最初的油酸包覆层在有机溶剂中表现出良好的稳定性，但不适合水介质，因此通过配体交换过程用聚丙烯酸替代，从而在水介质中提供了稳定的胶体性能[28]，这是生物应用的基本要求。所有制备的纳米系统都经过了DLS、XRD、SEM、ATR-FTIR、XPS和SQUID磁强计的深入表征，并对其在RNA分离中的性能进行了评估和与商业Fe?O?@SiO?基分离系统进行了对比。

**2. 实验部分**
**2.1. 样品制备和表面修饰**
通过热分解路线合成了平均粒径约为104 nm的多面体Fe?O?磁性纳米颗粒。将三乙酰丙酮铁（Fe(acac)?，4.006 mmol）溶解在苯乙醚（30 mL）中，并加入油酸（OA，9.93 mmol）作为表面活性剂和稳定配体。将混合物转移到三颈100 mL烧瓶中，在室温（350 rpm）下搅拌60分钟以确保完全均匀。随后，在氩气氛围下以15 °C/min的速率加热至265 °C，并在此温度下持续搅拌30分钟，使Fe(acac)?热分解并形成Fe?O?纳米颗粒。这一系列样品标记为P1。
立方体Fe?O?纳米颗粒的合成采用了相同的通用程序，但前体浓度和加热过程有所不同。将Fe(acac)?（3.69 mmol）溶解在苯乙醚（30 mL）中，然后加入OA（9.93 mmol）。在这种情况下，混合物在氩气氛围下以20 °C/min的速率加热至265 °C并保持30分钟。产物通过三步协议进行纯化[29]：首先向粗混合物中加入乙醇（样品:乙醇=1:2），然后离心（5000 rpm，10分钟）；沉淀物重新分散在乙醇、乙酸乙酯和己烷的混合物中并再次离心；此洗涤步骤重复两次。最后，将纯化的纳米颗粒重新分散并在氯仿中稳定。这一系列样品标记为K1。

**2.1.1. 使用配体交换协议将油酸（OA）替换为聚丙烯酸（PAA）**
对于这两种样品，我们根据Zákutná等人的方法[30]，通过配体交换协议将OA替换为PAA。从初始的氯仿悬浮液中分离出Fe?O?纳米颗粒（27 mg），用乙醇/乙酸乙酯混合物（5000 rpm，10分钟）洗涤，然后重新分散在THF（7.48 mL）中。将PAA（77.44 mg）溶解在20 mL THF中，完全溶解后加入纳米颗粒分散液。将混合物加热至66 °C并在持续搅拌下回流4小时。反应后，用约30 mL水稀释混合物，离心并用己烷洗涤；水/己烷洗涤循环重复两次。将纯化的纳米颗粒重新分散在约4 mL去离子水中，并通过调整pH值（加入几滴NaOH）来提高胶体稳定性。

**2.1.2. 使用UV-C辐射对磁性纳米颗粒进行表面修饰（使用有机配体APTES）**
在制备的最后一步中，通过添加APTES分子对Fe?O?@PAA纳米颗粒进行修饰。目的是使胺基团朝外取向，从而为捕获DNA和RNA生物分子提供活性位点。为此，不适合使用EDC/NHS协议，因为该协议会形成酰胺键[19]。也可以通过吸收将角配体应用于纳米颗粒表面，但NH基团可能无法进一步修饰[31]。因此，我们使用UV-C辐射（KRüSS UV灯，254 nm，6 W，240 V）进行光化学激活，以在PAA表面创建反应位点，以便APTES分子通过硅烷基团结合[22]。每个步骤都经过优化，以最小化PAA的降解并实现APTES分子在纳米颗粒表面的最有效附着。

**步骤1：在MNPs上光化学激活PAA层**
制备了Fe?O?@PAA纳米颗粒的水分散液（2 mg/mL，10 mL），并将其转移到低矮的硼硅酸盐培养皿中。悬浮液在15 cm的距离处暴露于UV-C照射（254 nm），同时以1500 rpm的速度搅拌。照射时间为30分钟，以确保均匀照明并最小化聚合物的光降解。254 nm波长的照射会在PAA链上生成自由基和氧化官能团[20],[21],[22]。这些活性中心随后与水解后的APTES中的硅醇基团反应，形成Si–O–C和Si–O–Si键，同时保持伯胺基团的完整性和朝外取向。

**步骤2：制备水解后的APTES溶液**
通过将0.5 mL APTES溶解在10 mL乙醇/水混合物（9:1，v/v）中制备水解后的APTES溶液。在室温下搅拌10分钟，以促进Si–OC?H?基团的部分水解和活性硅醇（Si–OH）的形成：
(1) NH???(CH?)???Si(OC2H5)3 → NH???(CH?)???Si(OH)3 + 3C2H5OH
由于水解后的APTES不稳定，因此溶液需在下一步使用前立即制备。

**步骤3：将APTES结合到激活的表面**
将新鲜水解后的APTES溶液加入UV激活的Fe?O?@PAA悬浮液中。反应混合物在室温下搅拌2小时，然后在60 °C下孵育2小时，以促进APTES的硅醇基团与PAA壳层激活的表面官能团之间的结合。我们假设反应介质中发生了多种化学反应：Si–OH与表面–OH基团的缩合形成Si–O–C键，以及通过硅氧烷桥接形成Si–O–Si键。第一个过程导致APTES与PAA涂层共价结合，同时保留了可用于进一步偶联反应的末端伯胺基团：
(2) Fe?O?@PAA?O· + NH?(CH?)?Si(OH)? → Fe?O?@PAA?O?Si(CH?)?NH?+H?O
所得的Fe?O?@PAA@APTES纳米颗粒具有暴露在表面的胺基团，适用于后续的生物分子偶联或进一步表面修饰。

**步骤4：清洗和稳定**
反应后，通过磁力收集纳米颗粒，并用乙醇洗涤两次，再用去离子水洗涤两次，以去除未反应的APTES、水解副产物和松散结合的硅氧烷寡聚物。将纯化的Fe?O?@PAA@APTES纳米颗粒在室温下干燥，并储存在干燥、避光的环境中。对于立方体和多面体形状的MNPs，采用相同的程序分别获得P1（多面体）和K1（立方体）样品（图1）。

**图1. 使用UV-C辐射对MNPs进行有机配体APTES表面修饰的示意图。**
样品A0（Fe?O?@SiO?）含有SiO?，与商业分离试剂盒中的样品相同，用于评估RNA分离效率。X射线衍射
使用Bruker D2 Phaser衍射仪（配备Cu-Kα光源，λ = 0.154 nm）在Bragg-Brentano几何结构下，通过X射线衍射（XRD）研究了制备的纳米颗粒的晶体结构。粉末样品被沉积在单晶硅支架上。通过将记录的衍射图案与Crystallography Open Database（COD）中的参考文件进行比较来进行相位分析。进一步利用Williamson-Hall（WH）方法[33]评估了衍射峰轮廓，以获得平均晶粒尺寸DWH和微应变（ε）。根据方程βcosθ = Kλ/DWH + 4εsinθ绘制了5个最显著XRD峰的参数。其中，K = 0.9是形状因子，λ是X射线波长，β是相应XRD峰的半高宽，θ是其位置。线性拟合（按峰面积加权）得出了与y轴的截距（用于确定DWH）和直线的斜率（用于确定ε）。

2.3. 透射电子显微镜（FE-SEM）和能量色散X射线光谱（EDX）测量
使用场发射扫描电子显微镜（FE-SEM，JEOL JSM-IT700HR）在高达30 kV的加速电压下，检查了纳米颗粒的形态和结构特征，包括形状、大小和组成特征。为了成像，将少量粉末分散在1 mL乙醇中，然后将大约5 μL的分散液沉积在碳涂层铜网格上，并在室温下干燥3小时。通过测量K1和P1样品的200个单独颗粒来评估颗粒大小分布，并使用对数正态拟合函数确定平均颗粒大小。进一步使用能量色散X射线（EDX）探测器（JEOL EX-74212U4L2Q）检查了元素组成。EDX图谱是在20 kV的加速电压下收集的。

2.4. Zeta电位测量
根据标准协议，使用ZetaSizer Nano ZS仪器（Malvern）基于动态光散射（DLS）测量了Zeta电位（ZP）。每次测量时，将5 mg纳米颗粒粉末分散在15 mL超纯水中（pH ～ 7），并超声处理20分钟以确保适当分散。ZP值使用Hückel模型计算。

2.5. 减衰全反射-傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）
使用Nicolet 8700 FTIR光谱仪（Thermo Scientific）和Smart OMNIC采样器（钻石棱镜）记录了浓度为40 mg/mL的纳米颗粒的ATR-FTIR光谱。每个光谱代表了在宽区域（4000–400 cm?1）内记录的64个干涉图的平均值，分辨率为4 cm?1。每个样品测量三次（n = 3）。从光谱中减去了缓冲液（背景）。

2.6. X射线光电子能谱（XPS）测量
在超高真空（UHV）条件下（≈10?? mbar）使用配备单色Al Kα X射线源和半球形电子能量分析器的光谱仪进行了XPS测量。需要时，还可以使用Mg Kα阳极来调整激发条件。样品被沉积在导电基底上并引入分析室。在测量过程中，系统允许对样品进行温度控制，根据需要实现冷却和加热。所有光谱都使用C 1 s参考峰（284.8 eV）进行校准，并使用标准峰拟合和定量分析程序进行评估。

2.7. 磁性测量
使用SQUID磁力计MPMS 5XL和MPMS3（Quantum Design）对粉末形式的样品进行了磁性测量。在5 K和300 K下，在高达7 T的应用场中记录了等温磁化曲线。在零场冷却（ZFC）和场冷却（FC）协议下测量了磁化随温度的变化。对于ZFC测量，样品在无磁场的情况下从300 K冷却到2 K。在2 K时施加100 Oe的磁场，并在加热到300 K的过程中测量磁化。FC数据是在相同的应用场（100 Oe）下从300 K冷却到2 K获得的。

2.8. 纳米颗粒分离效率的确定
2.8.1. 通过纳米颗粒提取RNA
使用来自Torula酵母（Type VI，R6625，Sigma-Aldrich，USA）的RNA进行了RNA提取。首先在不含DNA/RNA的水中制备了40 μL的初始RNA溶液，浓度为1 mg/ml（批次：2348,873，Invitrogen，UK）。向该溶液中加入50 μL的纳米颗粒（40 mg/mL），然后加入125 μL的结合缓冲液，其中含有1.25 M NaCl和10%聚乙二醇（PEG 20,000）。充分涡旋悬浮液以确保混合均匀，然后在室温下静置5分钟。经过1小时的孵育后，使用外部磁场将磁性纳米颗粒从混合物中分离出来。去除上清液，将得到的沉淀物用70%乙醇洗涤两次，干燥后重新悬浮在60 μL的TE缓冲液中（10 mM Tris–HCl，0.1 mM EDTA，pH 8.0，批次：8 × 012,166，PanReac AppliChem，Germany）。所有缓冲液的制备都使用超纯水（Milli-Q）。通过将悬浮液在65 °C下加热10分钟并持续搅拌700 rpm来实现RNA的释放。收集含有洗脱RNA的上清液，并通过UV–VIS光谱法确定其浓度。通过将回收的RNA量与初始RNA量进行比较来计算提取过程的效率，定义为100%。
为了评估分离性能的差异，进行了统计分析，比较了改性纳米颗粒与未改性的参考样品，并评估了用于计算平均提取值的六个重复实验之间的变化。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）后跟Tukey’s HSD事后检验来确定相对于对照样品（A0）或100% RNA参考值的统计显著差异。

3. 结果与讨论
本研究重点关注通过形状控制和表面功能化来提高核壳磁性纳米颗粒在磁分离过程中的效率。通过从球形转变为多面体和立方体形态来增加活性结合位点的密度，并在纳米颗粒表面引入有机配体APTES以提供与生物分子捕获相关的额外功能基团来实现这一目标。APTES配体与多面体和立方体Fe3O4@PAA核壳纳米颗粒的结合产生了P1和K1样品。研究样品的化学和结构公式总结在表1中，包括代表标准SiO2涂层纳米颗粒的参考样品A0。
表1. 研究样品的化学和结构公式比较。
样品 MNPs 形状 化学公式 配体化学公式 结构公式
P1 多面体 Fe3O4@PAA@APTES K1 立方体 Fe3O4@PAA@APTES
A0 球形 Fe3O4@SiO2 无配体

3.1. 结构和形态
通过SEM对K1和P1样品的形态学表征确认，P1样品接近球形，而K1样品为立方体形态（图2），平均尺寸分别为104.05 nm（± 16.83 nm）和96.35 nm（± 17.80 nm）。SEM测量还确认了纳米颗粒样品中存在较小颗粒的部分，其尺寸分别为P1 = 22.52 nm（± 6.58 nm）和K1 = 14.41 nm（± 3.29 nm）（图2）。
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图2. 研究的P1和K1样品的SEM显微图及其颗粒大小分布的直方图。黑线表示颗粒大小分布的对数正态函数。插图显示了P1和K1样品中较小颗粒部分的尺寸分布。
XRD分析确认两种纳米颗粒样品都结晶为立方磁铁矿（Fe?O?）相，具有反尖晶石结构（空间群Fd-3 m），与参考图案ICDD 96–101–1085一致（图3）[34]。记录的衍射图案显示了一组位于2θ角度30.1°、35.5°、43.2°、53.5°、57.1°和62.7°的反射，对应于磁铁矿的特征平面（220）、（311）、（400）、（422）、（511）和（440）。两个衍射图都显示出明显且定义明确的峰，表明具有高结晶度。
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图3. XRD测量确认了立方磁铁矿相Fe?O?的存在。
使用Williamson-Halls（WH）方法评估了P1和K1样品的晶粒尺寸和微应变（图4）。从W-H分析得到的晶粒尺寸比从SEM图像测得的颗粒尺寸小约30 nm。这种差异是由于XRD检测的是相干衍射域的大小，而不是SEM观察到的物理颗粒大小[35]。
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图4. 使用Williamson-Hall分析XRD数据，计算了晶粒尺寸和微应变。
整体尺寸超过磁铁矿临界尺寸（≈ 36 nm）的纳米颗粒由多个晶体学域组成或包含多个颗粒[36]。此外，与颗粒形态相关的晶格缺陷或微应变的存在会减小相干衍射域的表观尺寸[37]。两种形态的微应变值相同（ε ≈ 1.2 × 10?3），表明内部晶格应变与形态无关。
这些应变值是高度结晶的Fe?O?纳米颗粒的特征，这些颗粒是通过热分解制备的[[38]，[39]，[40]]，这与XRD衍射图案中观察到的尖锐和强烈的反射一致。
进一步使用EDX探测器检查了元素组成。相应的EDX元素图（图5）显示铁在聚集体中的均匀分布，没有局部强度变化或化学不均匀性的迹象。这种均匀信号表明颗粒由单一的氧化铁相组成，没有可检测的杂质。P1和K1的比较进一步表明，观察到的形态差异并未伴随元素组成的变化。
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图5. 研究样品P1和K1的SEM图像及其相应的EDX图。

3.2. Zeta电位测量
纳米颗粒表面的不同有机配体可以显著影响颗粒的表面电荷大小。ZP测量的目的是证明，在将OA替换为PAA后，APTES随后结合到表面，导致ZP从PAA的负值变为APTES的正值。
APTES化合物含有一个主要的氨基（-NH?），这对于与生物环境的相互作用至关重要。在中性和略酸性的pH值下，它质子化为-NH??，导致ZP值为正。如果这样的涂层颗粒与生物环境（例如细胞及其膜）相互作用，这些带有正ZP的纳米颗粒将与细胞强烈相互作用，增加内吞作用（细胞从细胞外环境吸收物质）的速率。
对于没有配体的P1样品，测得的ZP = ?25.4 mV。配体层结合后，分布明显向右移动，峰值达到+61.3 mV（图6），表明表面电荷发生了显著变化。配体的结合导致正电荷显著增加，从而表明纳米颗粒表面通过结合带正电荷的配体得到了有效修饰。
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图6. 带有有机配体APTES（蓝色）和没有配体APTES（红色）的P1样品的Zeta电位。
带强正电荷的颗粒可能适合与带负电荷的生物分子（如DNA或细胞膜）相互作用。
对于没有配体的K1样品，ZP位于负值区域，峰值为?37.7 mV。配体结合后，分布向正值移动，峰值达到+41.1 mV（图7）。APTES结合后，ZP的极性再次从负变为正。纳米颗粒表面的正电荷通常表示其更好的胶体稳定性和降低的聚集倾向。其他几项研究也证实了APTES涂层表面的正电荷[41,42]。Zhang等人建立了来自APTES的表面电荷（中性pH下的–NH??）与增强吸附能力之间的相关性[43]。
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图7. 带有有机配体APTES（绿色）和没有配体APTES（黑色）的K1样品的Zeta电位。

3.3. ATR-FTIR光谱分析
为了评估磁性纳米颗粒表面化学改性的成功，进行了ATR-FTIR光谱测量。为了控制实验，除了APTES修饰的样品P1和K1外，还测量了未修饰样品P?/PAA的ATR-FTIR光谱（图8），该样品仅通过聚丙烯酸进行了表面修饰，作为参考系统。加入这个参考样品使我们能够清楚地识别出由于APTES分子随后的光化学激活和结合所导致的变化。下载：下载高分辨率图像（285KB）下载：下载全尺寸图像图8. 未经过APTES配体表面修饰的多面体Fe3O4@PAA纳米颗粒（P1/PAA）与经过修饰的样品P1和K1的ATR-FTIR光谱比较，后者是在H2O背景下测得的，因为这些纳米颗粒溶解在超纯水中。P1/PAA的参考光谱与APTES修饰样品的光谱比较表明，聚丙烯酸的基本振动特征得以保留，而修饰后出现了与硅氧烷键和APTES胺官能团相关的额外谱带。在1000–1100 cm?1区域，APTES修饰样品的光谱中出现了两个明显的吸收带：一个大约在1045 cm?1，归因于Si–O伸缩振动；另一个在1085 cm?1附近，归因于Si–O–C键合。这些特征是硅烷基团与含氧化物的表面共价结合的典型表现，为APTES成功附着在聚丙烯酸功能化的纳米颗粒上提供了明确证据。P1/PAA参考光谱中缺乏这些特征进一步证实了这一结论。在所有样品中都观察到一个明显的约1700 cm?1的谱带，对应于羧基的C = O伸缩振动，表明PAA层在表面修饰后仍然完整。APTES修饰样品在2950 cm?1附近有微弱的吸收，这些吸收归因于氨基丙基链中的–CH?和–CH?基团的烷基C–H伸缩振动，证实了硅烷层的存在，因为这些谱带在参考光谱中不存在。此外，在所有样品中都观察到一个宽的约3350 cm?1的谱带，主要由O–H伸缩振动引起。总体而言，ATR-FTIR分析确认了所有样品中PAA表面层的保留，并证明了样品P1和K1中有机硅烷配体APTES的成功功能化。

3.4. 通过XPS光谱确认纳米颗粒的表面修饰
图9显示了样品P1的N1s和Si2p区域的XPS光谱。图9a中观察到三个峰，其中结合能为402.31 eV的峰归因于氮，一对橙色峰归因于来自样品架的钼。图9b中看到一个结合能为104.81 eV的Si 2p峰，与氮一起，归因于3-氨基丙基三乙氧基硅烷分子[44]。

图10中样品K1也表现出类似的行为。此外，图10a显示了一对来自钼样品架的Mo峰，以及一个结合能为401.93 eV的氮峰。图10b显示了一个结合能为104.12 eV的硅峰。在这种情况下，氮和硅的存在也证实了3-氨基丙基三乙氧基硅烷分子的存在。

3.5. 磁性特性
图11显示了所研究纳米颗粒系统的等温磁化曲线。即使在T = 300 K时，这些系统也表现出滞后行为。这是纳米颗粒中存在磁性多畴结构的标志，这在与我们大小相当的较大磁铁矿纳米颗粒中是典型的[45,46]。磁化在低场（约1 T）时就已经饱和，且在高场（H > 1 T）时没有顺磁组分（M(H)的线性依赖性）表明表面（无序）层相对于总颗粒体积的比例较低[47]。

图12显示了在100 Oe外部磁场下P1（多面体）和K1（立方体）的磁化温度依赖性（ZFC-FC曲线）。由于纳米颗粒的尺寸远大于单畴Fe3O4颗粒报告的临界直径dc ～ 20 nm（图3）[50]，因此ZFC-FC磁化与同一材料的典型超顺磁纳米颗粒显著不同[32]。与K1样品中典型的宽ZFC最大值不同，我们观察到在T ～ 120 K时磁化出现阶跃变化。即使在其他应用场值（500 Oe, 1 kOe）下获得的ZFC数据中，这种磁化突变仍然存在（数据未显示）。从理论和实验中都已知，ZFC最大值的位置强烈依赖于施加的磁场。因此，在我们的纳米颗粒情况下，这显然是体相磁铁矿典型的Verwey相变[51,52]。

图12还观察到P1（多面体）和K1（立方体）在100 Oe外部磁场下的磁化温度依赖性。对于P1样品，也观察到了类似的ZFC-FC磁化温度依赖性行为，但在T ～ 50 K区域存在一个局部宽峰。这种最大值在约20 nm大小的Fe3O4纳米颗粒中已被观察到，一些作者将其归因于颗粒表面的原子自旋转变现象[52,53]。然而，在我们的案例中，这个局部最大值更可能是由于P1样品中较小（超顺磁）纳米颗粒的比例造成的（通过SEM证实）。S. Sarveen等人的工作中也描述了类似的叠加现象[46]。对于K1样品，由于样品中较小颗粒的比例较小，因此没有观察到类似的局部最大值。

3.6. 研究的纳米颗粒结合RNA的能力
我们使用了“使用纳米颗粒的RNA提取协议”来测试我们纳米颗粒的功能特性，以提供直接实验证据，证明我们的纳米颗粒具有增强的核酸分离效率。我们样品P1和K1的有效分离核酸的能力与为此目的合成的样品A0进行了比较，样品A0中的纳米颗粒是球形的Fe3O4@SiO2纳米颗粒，与商业试剂盒中使用的纳米颗粒相同。样品P1（多面体）和K1（立方体）具有多面体和立方体形状，这应该增加了纳米颗粒的功能表面积，有助于更好的核酸结合性能。P1和K1样品的Fe3O4磁核涂有聚丙烯酸（PAA），作为稳定和功能中间层材料。随后，这些纳米颗粒的表面用3-(氨基丙基)三乙氧基硅烷进行了功能化，以增强其对核酸的亲和力[15]。为了评估这些纳米颗粒的RNA结合能力，我们应用了使用纳米颗粒的RNA提取协议。已知PEG可以通过与表面硅醇基团的氢键吸附到硅上，这可能导致RNA从纳米颗粒上的竞争性置换[9]。RNA分子可以与氨基丙基硅烷功能化的表面相互作用，例如通过带正电的胺基团与带负电的核酸磷酸骨架之间的静电吸引，从而促进RNA在表面的稳定吸附[54]。使用外部磁场从我们的样品A0、P1和K1中提取了结合的RNA。提取后，通过UV–VIS光谱法测定了洗脱溶液中的RNA浓度。实验结果如表2所示。相比之下，RNA与聚丙烯酸（PAA）涂层的相互作用是通过PAA的负电荷羧基与RNA之间的静电和氢键相互作用介导的，这种相互作用通常受溶液条件和离子强度的影响，为RNA吸附和潜在释放提供了可调平台[55]。结果显示，样品P1的纳米颗粒表现出略高的RNA分离效率。尽管Fe?O?@PAA@APTES纳米颗粒由于其形状具有更大的活性表面积并且表面含有有机配体APTES，但它们的分离能力与样品A0相当或更低。这种差异可能表明，仅纳米颗粒表面的胺基团的存在可能不足以实现高效的RNA结合，这与我们的预期不同。这种差异可能归因于不同的形态、P1和K1纳米颗粒的较大尺寸，甚至可能是由于缺乏SiO2层。

表2. 研究的纳米颗粒结合RNA的能力。

MNPs的生物活性
分离效率（%）
A0 7.43 ± 0.37
P1 6.8 ± 0.34
K1 4.8 ± 0.24

样品P1和K1根本不包含SiO2层，而分离方法正是基于SiO2系统的存在，无论是制备基于二氧化硅的提取柱还是使用MNPs的磁分离，RNA的结合都发生在SiO2层上，这在商业PCR试剂盒（例如Qiagen、Thermo Fisher、Roche）中都有体现。尽管样品P1和K1不包含SiO2层，但使用MNPs的RNA提取协议的分离效率与含有SiO2的样品A0相当。正是P1和K1不含二氧化硅的结果表明了它们的潜力，因此我们将继续研究并创建含有用APTES配体修饰的SiO2层的不同形状的纳米颗粒系统。MNPs的相对较大尺寸也可能是RNA分离效率较低的原因之一。通常，用于核酸分离的MNPs的最佳尺寸在30–100 nm范围内，而较小的颗粒或过大的颗粒可能不适合与核酸有效相互作用和结合[56,55]。这个范围内的MNPs具有较高的表面积与体积比，表明有许多活性位点用于DNA/RNA结合。超过这个范围的纳米颗粒虽然磁响应增强，但具有较低的比表面积，导致结合位点减少，容易聚集，并且在溶液中稳定性较差，即使在没有磁体的情况下也容易沉淀，正如我们在实验中观察到的P1和K1样品的情况一样，其尺寸处于理想纳米颗粒尺寸范围（30–100 nm）的上限。纳米颗粒的形状（多面体 vs. 立方体）可能影响了可用表面积和功能基团的密度，这可能反映在P1和K1样品之间分离效率的微小差异上。基于这些发现，可以得出结论，纳米颗粒的化学和形态优化在开发高效的核酸磁分离系统中起着关键作用。尽管Fe?O?@PAA@APTES纳米颗粒的分离效率尚未显著优于样品A0，但它们为进一步修改提供了有趣的基础，例如通过减小MNPs的整体尺寸，或者用SiO2层替换聚丙烯酸。此外，关注MNPs表面有机配体的密度并在不同样品之间进行比较也是合适的。这些初步结果主要关注我们样品的物理特性。基于这些发现，我们旨在进一步优化纳米粒子的制备，以实现RNA/DNA的有效磁分离，这一过程具有重要的生物学意义。4. 结论 本研究介绍了一套专为RNA分离设计的新型磁性纳米粒子的设计与验证，重点探讨了粒子形态、大小和表面化学性质对分离性能的影响。为满足生物技术和诊断领域对高效且可重复使用的磁性载体的持续需求，本工作表明合理的表面工程可以显著增强核酸的结合能力。通过热分解方法，合成了两种不同的Fe?O?纳米粒子形态：多面体（P1）和立方体（K1），随后用聚丙烯酸进行涂层处理，并用3-(氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）进行功能化。采用了一种基于UV-C（254 nm）光化学激活的新方法将APTES连接到聚丙烯酸层上。本研究的关键贡献在于开发了一种利用UV-C激活来修饰Fe?O?纳米粒子PAA涂层的独特光化学策略。该方法成功激活了表面羟基，使得APTES能够附着，并确保了可访问的自由氨基的存在。我们的结果表明，这种相对简单但创新的修饰方法提供了一种高效且成本效益高的替代方案，优于传统的基于二氧化硅或多步骤的功能化方法。ATR-FTIR和XPS分析提供了纳米粒子成功功能化的明确证据，而XRD测量验证了形成了纯相的Fe?O?核心。ATR-FTIR分析确认了所有三个样品中都含有PAA，并证实了样品P1和K1表面成功修饰了有机硅烷配体APTES。SEM显微图显示了明确的粒子形状，平均尺寸分别为约104 nm（P1）和96 nm（K1）。表面电荷分析显示，在APTES修饰后，zeta电位明显向正方向偏移，表明引入了能够与RNA负电荷磷酸骨架发生静电相互作用的氨基。磁测量分析显示了形态依赖的磁响应。多面体Fe?O?纳米粒子表现出更高的饱和磁化强度（约90 Am2 kg?1），而立方体Fe?O?纳米粒子的饱和磁化强度较低（约70 Am2 kg?1），这反映了磁各向异性和结构有序性的差异。两种形态的纳米粒子都在120 K附近表现出Verwey转变，表明磁铁矿核心具有高结晶度和纯度。RNA提取实验表明，这两种纳米粒子系统的分离效率与商业参考样品A0相当，尽管水平较低。值得注意的是，尽管合成的纳米粒子没有常用的SiO?涂层，但其性能仍可与现有系统相媲美。这些结果强调了精确控制粒子形态和表面功能化的重要性，作为提高核酸分离效率的一种可行方法。总体而言，P1和K1 APTES功能化纳米粒子在磁响应性、可调表面电荷和可控形态方面表现出良好的组合，从而实现了有效的RNA分离。它们的表现表明，这种仅含核心的Fe?O?系统可能成为未来开发磁分离技术的一个有前景的平台。通过集成薄SiO?中间层或扩展研究的形态范围，可以进一步提高分离效率。

作者贡献声明：
M. Barutiak：可视化、数据分析、数据管理。
A. Zeleňáková：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、监督、方法学、资金获取、正式分析。
P. Hrubov?ák：撰写——初稿、方法学、数据分析、数据管理。
L. Nagy：可视化、方法学、数据分析、数据管理。
D. Volavka：方法学、数据分析、正式分析。
J. Sz?csová：可视化、数据分析、正式分析、数据管理。
?. Fabriciová：可视化、数据分析、正式分析、数据管理。
A. Anto?ová：撰写——初稿、项目管理、方法学、数据分析、概念化。